基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法、雌激素作用驗證方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，包括：選取桑白皮中多種待測試化合物；在所述待測試化合物中通過雌激素活性篩選實驗篩選出顯著促進乳腺癌細胞增殖的化合物；通過分子對接實驗篩選出對乳腺癌細胞具有較強親和力的化合物；在篩選后的化合物中確定最終具有雌激素樣的化合物。本發(fā)明還公開了基于桑白皮中雌激素樣成分的雌激素樣作用驗證方法。本發(fā)明還公開了基于桑白皮中雌激素樣成分的應(yīng)用。
【專利說明】
基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法、雌激素作用驗證方 法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中藥有效成分的新用途，具體設(shè)及基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選 方法、雌激素作用驗證方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，由發(fā)現(xiàn)的植物雌激素的化學結(jié)構(gòu)主要包括黃酬類、香豆素類、木脂素類及二 苯乙締類、祗類、醬醇類等。因其與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似，可與ER結(jié)合，作用于祀基因調(diào)節(jié) 區(qū)域的雌激素受體反應(yīng)原件上，啟動下游祀基因的轉(zhuǎn)錄，可發(fā)揮雌激素樣作用或抗雌激素 樣作用，在女性更年期疾病的治療中有較為顯著的療效。隨著研究的系統(tǒng)深入，發(fā)現(xiàn)植物雌 激素不僅是作為雌激素的替代品出現(xiàn)，還可W治療或輔助治療多種疾病，對人體的生殖系 統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等都有顯著效應(yīng)。
[0003] 桑白皮作為臨床常用藥，其應(yīng)用研究融合了現(xiàn)代科學與中醫(yī)理論。近年來，桑白皮 不僅引起了中藥化學研究領(lǐng)域極大的關(guān)注，同時其藥理作用也被廣泛挖掘。隨著分離篩選 純化方法的發(fā)展，桑白皮中多種新的藥用成分和生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)。目前桑白皮已分離 鑒定的化學成分有黃酬類、巧喃類、香豆素類、祗類、醬醇類、糖類及揮發(fā)油類、巧類等。而黃 酬類、巧類物質(zhì)分別具有黃酬母核、二苯乙締的化學結(jié)構(gòu)，它們是雌激素樣作用活性物質(zhì)發(fā) 揮作用的重要藥效結(jié)構(gòu)。但關(guān)于桑白皮雌激素樣作用的報道還沒有。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明設(shè)計開發(fā)了基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，目的是篩選出桑白皮 中具有雌激素樣活性的藥效成分。
[0005] 本發(fā)明還設(shè)計開發(fā)了基于桑白皮中雌激素樣成分的雌激素樣作用驗證方法，目的 是驗證桑白皮中具有雌激素樣作用的活性單體氧化白襲蘆醇的雌激素作用。
[0006] 本發(fā)明還設(shè)計開發(fā)了基于桑白皮中雌激素樣成分的應(yīng)用，目的是為臨床提供新的 可作為用于雌激素的替代治療的植物雌激素。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[000引基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，包括：
[0009] 選取桑白皮中多種待測試化合物；
[0010] 在所述待測試化合物中通過雌激素活性篩選實驗篩選出顯著促進乳腺癌細胞增 殖的化合物；W及
[0011] 通過分子對接實驗篩選出對乳腺癌細胞具有較強親和力的化合物；
[0012] 在篩選后的所述化合物中確定最終具有雌激素樣的化合物。
[0013] 優(yōu)選的是，所述最終具有雌激素樣的化合物為氧化白襲蘆醇。
[0014] 優(yōu)選的是，所述雌激素活性篩選實驗包括如下步驟：
[0015] 使用10 %胎牛血清的DMEM含酪紅的培養(yǎng)基對乳腺癌細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞鋪 滿瓶壁80%^上時，對細胞進行消化后，取1/^3接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在 增殖實驗前一代將培養(yǎng)基換為10%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酪紅的DMEM培養(yǎng)基，置于培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度，用2.5%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酪紅的 培養(yǎng)基進行接種后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，后加入含有不同濃度化合物的2.5 %經(jīng)活 性炭處理的胎牛血清無酪紅的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時，加入MTT，4小時后吸棄培養(yǎng)板 內(nèi)液體，加入DMSO 10化L/孔，對所述細胞進行光密度值檢測。
[0016] 優(yōu)選的是，所述雌激素活性篩選實驗W及分子對接實驗中使用所述待測試化合物 濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ。
[0017] 優(yōu)選的是，在所述分子對接實驗中，對所述待測試化合物進行去鹽、加氨W及離子 化處理，對所述乳腺癌細胞中的結(jié)合受體去除蛋白周圍的水分子和共晶的小分子配體，并 對蛋白結(jié)構(gòu)加氨進行能量最小化處理。
[0018] 優(yōu)選的是，在所述分子對接實驗中，篩選出所述待測試化合物中與雌激素受體ERa 和/或E祕的具有較強親和力的化合物。
[0019] 通過細胞轉(zhuǎn)染實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方法，包括:所述 細胞轉(zhuǎn)染實驗包括人宮頸癌細胞和/或乳腺癌細胞的細胞轉(zhuǎn)染實驗；
[0020] 其中，人宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒后加入含有濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇，在解箱中培養(yǎng)，采用雙巧光素酶報告 檢測系統(tǒng)測定其發(fā)光值，與空白組對照組進行比較，氧化白襲蘆醇增強人宮頸癌細胞ER轉(zhuǎn) 錄活性；
[0021] 乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，加入攜帶有GFP表達基因的 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的混合液后，培養(yǎng)6小時，加入含有濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇，培 養(yǎng)24小時后觀察巧光結(jié)果，與空白對照組進行比較，氧化白襲蘆醇增強乳腺癌細胞ER轉(zhuǎn)錄 活性。
[0022] 通過乳腺癌細胞ER基因表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方 法，包括如下步驟：向待實驗細胞內(nèi)加入濃度為0.化Μ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇培養(yǎng)24小時 后，對細胞進行總RNA提取及濃度測定，通過RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過cDNA合成RT- PCR，測定每個實驗中的反應(yīng)體系內(nèi)巧光信號到達設(shè)定的闊值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與拷貝量 呈負對數(shù)關(guān)系，與空白對照組進行比較，氧化白襲蘆醇促進乳腺癌細胞的ER誘導(dǎo)基因表達。
[0023] 通過乳腺癌細胞蛋白表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方法， 包括如下步驟：向待實驗細胞內(nèi)加入含有濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇進行培養(yǎng)，然 后對細胞進行蛋白提取，對ERa、E郎蛋白進行含量檢測，與空白對照組進行比較，氧化白襲 蘆醇增強邸曰、E祕蛋白表達。
[0024] 基于桑白皮中雌激素樣成分的應(yīng)用，包括：
[0025] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強人宮頸癌細胞的邸α和/或邸β 轉(zhuǎn)錄活性;或
[0026] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強乳腺癌細胞的邸α和/或邸β轉(zhuǎn) 錄活性;或
[0027] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于促進乳腺癌細胞的ER誘導(dǎo)基因 CTSD、PGR、pS2mRNA 的表達；或
[0028] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強乳腺癌細胞的邸α和/或邸β蛋 白表達。
[0029] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較所具有的有益效果:通過本發(fā)明提供的篩選方法，能夠 篩選出雌激素中雌激素樣作用活性較強的單體成分氧化白襲蘆醇，并且通過雌激素樣作用 實驗從蛋白水平，更為全面的多角度去闡述桑白皮中具有雌激素樣作用的活性單體成分的 雌激素作用，并且通過桑白皮中具有雌激素樣成分的應(yīng)用提供了桑白皮作為植物雌激素用 于雌激素的替代治療的選擇可能性。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對化la細胞邸曰轉(zhuǎn)錄活性的影響。（與空白對照 組相比*沖<0.01;與E2組相比#咕<0.01)
[0031] 圖2為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對化la細胞邸β轉(zhuǎn)錄活性的影響。（與空白對照 組相比*沖<0.01;與Ε2組相比#咕<0.01)
[0032] 圖3為本發(fā)明所述的GFP-ERa、GFP-E祕質(zhì)粒大量提取后電泳圖。（M:lkb Plus DNA Ladder；1：ESR1；2：ESR2)
[0033] 圖4為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞GFP-ERa、GFP-ERi3轉(zhuǎn)錄活性的影 響。
[0034] 圖5為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞CTSD mRNA表達的影響。（與空白對 照組相比*沖<0.01;與E2組相比#咕<0.01)
[0035] 圖6為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞PGR mRNA表達的影響。（與空白對 照組相比*沖<0.01;與E2組相比#咕<0.01)
[0036] 圖7為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞pS2mRNA表達的影響。（與空白對照 組相比沖<0.05，*沖<0.01;與E2組相比##P<0.01)
[0037] 圖8曰、加為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞ERa蛋白表達的影響。（與空白 對照組相比*沖<0.01;與E2組相比#咕<0.01)
[0038] 圖9a、9b為本發(fā)明所述的氧化白襲蘆醇對MCF-7細胞E祕蛋白表達的影響。（與空白 對照組相比*沖<0.01;與E2組相比#咕<0.01)
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，W令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)W實施。
[0040] 本發(fā)明提供了一種基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，包括：
[0041] 選取桑白皮中多種待測試化合物，在選取后的待測試化合物中通過雌激素活性篩 選實驗篩選出顯著促進乳腺癌細胞增殖的化合物W及通過分子對接實驗篩選出對乳腺癌 細胞具有較強親和力的化合物，在篩選后的化合物中確定最終具有雌激素樣的化合物；
[0042] 其中，選取的待測試化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：
[004引在另一種實施例中，最終具有雌激素樣的化合物為化合物4,即為氧化白襲蘆醇 (Oxyr)。
[0049] 在另一種實施例中，雌激素活性篩選實驗包括如下步驟：
[0050] 使用10%胎牛血清的DMEM含酪紅的培養(yǎng)基對乳腺癌細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞鋪 滿瓶壁80%^上時，對細胞進行消化后，取1/^3接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在 增殖實驗前一代將培養(yǎng)基換為10%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酪紅的DMEM培養(yǎng)基，置于培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度，用2.5%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酪紅的 培養(yǎng)基進行接種后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，后加入含有不同濃度化合物的2.5%經(jīng)活 性炭處理的胎牛血清無酪紅的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時，加入MTT，4小時后吸棄培養(yǎng)板 內(nèi)液體，加入DMS0 10化L/孔，對所述細胞進行光密度值檢測。
[0051 ]在另一種實施例中，雌激素活性篩選實驗W及分子對接實驗中使用所述待測試化 合物濃度為0. luM~ΙΟμΜ。
[0052]在另一種實施例中，在分子對接實驗中，對待測試化合物進行去鹽、加氨W及離子 化處理，對乳腺癌細胞中的結(jié)合受體去除蛋白周圍的水分子和共晶的小分子配體，并對蛋 白結(jié)構(gòu)加氨進行能量最小化處理。
[0053] 在另一種實施例中，在分子對接實驗中，篩選出待測試化合物中與雌激素受體ERa 和/或E祕的具有較強親和力的化合物。
[0054] 本發(fā)明提供了一種通過細胞轉(zhuǎn)染實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗 證方法，包括:所述細胞轉(zhuǎn)染實驗包括人宮頸癌細胞和/或乳腺癌細胞的細胞轉(zhuǎn)染實驗；
[0055] 其中，人宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒后加入含有濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇，在解箱中培養(yǎng)，采用雙巧光素酶報告 檢測系統(tǒng)測定其發(fā)光值，與空白組對照組進行比較，氧化白襲蘆醇增強人宮頸癌細胞ER轉(zhuǎn) 錄活性；
[0056] 乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，加入攜帶有GFP表達基因的 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的混合液后，培養(yǎng)6小時，加入含有濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲蘆醇，培 養(yǎng)24小時后觀察巧光結(jié)果，與空白對照組進行比較，氧化白襲蘆醇增強乳腺癌細胞ER轉(zhuǎn)錄 活性。
[0057] 本發(fā)明提供了一種通過乳腺癌細胞ER基因表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的 雌激素作用驗證方法，包括如下步驟:向待實驗細胞內(nèi)加入濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白襲 蘆醇培養(yǎng)24小時后，對細胞進行總RNA提取及濃度測定，通過RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過 cDNA合成RT-PCR，測定每個實驗中的反應(yīng)體系內(nèi)巧光信號到達設(shè)定的闊值時所經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù)，與拷貝量呈負對數(shù)關(guān)系，與空白對照組進行比較，氧化白襲蘆醇促進乳腺癌細胞的ER誘 導(dǎo)基因表達。
[005引本發(fā)明提供了一種通過乳腺癌細胞蛋白表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌 激素作用驗證方法，包括如下步驟:向待實驗細胞內(nèi)加入含有濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白 襲蘆醇進行培養(yǎng)，然后對細胞進行蛋白提取，對ERa、E祕蛋白進行含量檢測，與空白對照組 進行比較，氧化白襲蘆醇增強邸α、E祕蛋白表達。
[0059] 本發(fā)明提供了一種基于桑白皮中雌激素樣成分的應(yīng)用，包括:使用桑白皮中雌激 素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強人宮頸癌細胞的邸α和/或邸0轉(zhuǎn)錄活性;或
[0060] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強乳腺癌細胞的邸曰和/或邸β轉(zhuǎn) 錄活性;或
[0061] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于促進乳腺癌細胞的ER誘導(dǎo)基因 CTSD、PGR、pS2mRNA 的表達；或
[0062] 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白襲蘆醇用于增強乳腺癌細胞的邸α和/或邸β蛋 白表達。
[0063] 下面結(jié)合具體的實施例和實驗例對本發(fā)明做出進一步的闡述。
[0064] 實驗材料
[0065] Ε2為邸S的激動劑;在本實施例中，&為雌二醇；
[0066] ICI 182,780為邸S完全括抗劑；
[0067] 化la人宮頸癌細胞購自上海細胞生物研究所；
[0068] MCF-7化Ra+，ΕΚβ+)人乳腺癌細胞株購自上海細胞生物研究所；
[0069] FBS為胎牛血清；
[0070] CS-FBS為經(jīng)活性炭處理過的胎牛血清；
[0071] MTT為3-( 4,5-二甲基嚷挫-2 )-2,5-二苯基四氮挫漠鹽。
[0072] 實施例1桑白皮雌激素樣活性物質(zhì)篩選實驗
[0073] 1、雌激素活性篩選實驗化-screen實驗）
[0074] 細胞從液氮中取出后，直接于37°C~40°C溫水中，迅速搖動并不斷觀察融化情況， 避免溫度過高使細胞損傷。然后在無菌條件下，吸出細胞凍存液，移至離屯、管并加入DMEM培 養(yǎng)基。SOOrpm離屯、3min，去除上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)基洗涂一次。加入足量培養(yǎng)液輕輕吹打 成為細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶(接種密度為5 X 105個/ml )，置于5 % C〇2、37 °C飽和濕度的培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0075] 根據(jù)已有的細胞倍增時間進行細胞消化和傳代，待細胞處于對數(shù)生長期或鋪滿培 養(yǎng)瓶底后，吸棄瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗去殘留的培養(yǎng)液，加入1ml 0.25 %的膜酶，晃動培養(yǎng)瓶保 證膜酶與細胞充分接觸，置于37°C培養(yǎng)箱，lmin后于顯微鏡下進行觀察細胞形態(tài)，若胞質(zhì)出 現(xiàn)回縮，成球形，立即吸棄消化液，加入全培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打貼壁的細胞形成單細 胞懸液。細胞計數(shù)后，取的混懸液接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%C〇2、37°C飽和濕度的培 養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
[0076] 細胞凍存前2地更換培養(yǎng)基，待細胞鋪滿瓶壁80 % W上時，消化、離屯、收集細胞，W 含10%DMS0、20%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至108個/ml,分裝于凍存管中，1.5ml/管， 放入凍存盒中于-80°C冰箱中24h后存放于液態(tài)氮中保存。
[0077] MCF-7細胞W含10%FBS的DMEM含酪紅的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，增殖實驗前一代換為 10 %CS-FBS無酪紅的DMEM培養(yǎng)，W消耗細胞內(nèi)激素類物質(zhì)。至80 %融合時取狀態(tài)良好的細 胞膜酶消化，用2.5%CS-FBS無酪紅的DMEMW5000個細胞每孔接種于96孔板。37°C，5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞貼壁良好，鋪展生長。此時吸去培養(yǎng)液，用D-化nk'S液20化1每孔 洗涂1次，加入含有不同濃度藥物的2.5 % CS-FBS無酪紅的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72h。設(shè)溶劑對照組 (0.1%DMS0)、E2 組(0.0化]\〇、62(0.0化]\〇+1(：1(0.化]\〇組、藥物各濃度組、^及藥物+1(：1(0.1 μΜ)組。
[0078] 待加藥處理72h后，取出培養(yǎng)板，小屯、吸棄培養(yǎng)液，加入ΜΤΤ試劑，使其終濃度為 5mg/ml。用錫錐紙包裹培養(yǎng)板，37 °C解育4h。吸棄MTT試劑，加入DMS0，100μΙ/孔。振蕩器上振 蕩15min，490nm處檢測光密度值(0D值）。
[0079] 2、分子對接實驗
[0080] 使用高通量虛擬篩選體系：（1)各小分子的數(shù)據(jù)庫是由Sch巧dinger軟件中的 LigPrep模塊進行準備的，用作對接實驗的配體庫；（2)使用S.ch:l沿dingei·軟件中的Protein preparation wizard模塊準備ERa、邸β的蛋白，通過化IDE模塊生成grid文件，即對接試驗 的受體文件；（3)將上述2個文件經(jīng)任務(wù)管理程序投送至分布式計算集群中，由 Sdl巧dinger軟件中的化IDE模塊進行對接試驗；（4)通過Pipeline Pilot對上一步驟結(jié)果 進行排序分析，輸出化合物打分列表，保留前幾位分子進行下一步篩選；（5)通過對分子目 視篩選，選出結(jié)合方式合理，模擬結(jié)合力較強的分子作為候選化合物，進入后續(xù)生物活性測 定步驟。
[0081 ] 應(yīng)用Sch巧dingersoftware suite 2015中的化IDE模塊進行了分子對接研究，用 來確定化合物Oxyr與雌激素受體ERa、ER0的結(jié)合模式。首先通過'Sch泌姐ng符sof tware sui te中的Li評r巧模塊進行小分子準備，分子去鹽，加氨，離子化狀態(tài)參數(shù)設(shè)置，抑為7. ο ± 2.0,多樣化對接模式，空間異構(gòu)體，環(huán)式結(jié)構(gòu)生成的多種構(gòu)象可產(chǎn)生多種可能的結(jié)構(gòu)。最小 化的能量W產(chǎn)生最穩(wěn)定或最佳結(jié)合模式，立場參數(shù)設(shè)定為〇PLS_2005 (Optimized Potentials for Liquid Simulations),并且對全部分子產(chǎn)生互變異構(gòu)體。
[0082] 雌激素受體ERa、E祕的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1GWR、30LL)于Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫下 載，該共晶結(jié)構(gòu)原子的坐標數(shù)據(jù)采用X射線衍射法收集得到，分辨率分別為2.4 A、1.5 A， 二者均為共晶分子，配體分子結(jié)合于活性口袋空間體積較大的中屯、位置。WSchrodiiiger software suite中的Protein preparation wizard功能分別進行邸α、Ε祕蛋白的準備，在 該過程中將去除蛋白周圍的水分子和共晶的小分子配體，并對蛋白結(jié)構(gòu)加氨最終進行能量 最小化。參照共晶結(jié)構(gòu)中的配體位置坐標對接Grid的生成，通過Sch巧dinger中的化IDE模 塊自動生成。對接結(jié)果中應(yīng)用gl ide_gscore作為打分函數(shù)，用W評價對接構(gòu)象的結(jié)合模式； 在本實施例中，實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。實驗結(jié)果W均值±標準差 (i±S)進行表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way AN0VA) "P<0.05為差異有統(tǒng)計學 意義，進行Ξ次獨立實驗，其中（n = 6)。
[0083] 作為一種優(yōu)選，在本實施例中采用的軟件為Sch巧dinger software suite2010(64 位）、Discovery Sl:udio 3.5、Pipeline Pilot 8.5?及Pymol 1.4,配備的硬件設(shè)備為Dell 化tiplex 380臺式計算機W及HP ProLiant DL388G7塔式服務(wù)器用于中小型運算量的計算 任務(wù)。
[0084] 3、實驗結(jié)果
[0085] 3.1、桑白皮雌激素活性成分對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響
[0086] MTT法進行MCF-7細胞增殖實驗及ICI182,780干預(yù)的細胞增殖抑制實驗，結(jié)果顯 示，&組處理7化可顯著促進MCF-7細胞增殖，ICI 182，780可完全抑制E2的促增殖作用;受試 單體中的二苯乙締類化合物1的促增殖作用不明顯，化合物2、3、4可顯著促進MCF-7細胞增 殖，其效價約為E2的（1/100-1/1000)，該作用可被ICI 182，780可完全抑制。而黃酬類化合 物5、6、7、則表現(xiàn)出一定的抑制細胞增殖的結(jié)果，化合物8對MCF-7細胞的增殖無明顯影響。 糞環(huán)類化合物9及苯并巧喃類化合物10具有顯著抑制細胞增殖的作用(如表1所示）
[0087] 表1桑白皮提取的10種單體成分對MCF-7細胞增殖的影響G±:S)(n = 6)
[008引（注：與空白對照組相比沖<0.05，*沖<0.01;與E2組相比##P<0.01) 「00891
[0090] 3.2分子對接結(jié)果
[0091] 10個化合物經(jīng)過分子對接篩選，依據(jù)docking score打分排序，選出結(jié)合作用較強 的分子，如表2和3所示，Oxyr與蛋白的結(jié)合方式比較合理，進行后續(xù)研究
[0092] 表2氧化白襲蘆醇與ERa分子對接Score
[0096] Glide對接結(jié)果顯示，化合物4,即氧化白襲蘆醇(Oxyr)和陽性對照分子E2均成功 對接到雌激素受體邸α、Ε祕的活性口袋中。邸的活性口袋包含于分子內(nèi)部，為略呈狹長的囊 狀結(jié)構(gòu)，雌激素結(jié)合區(qū)多為疏水氨基酸殘基分布排列，兩端有少數(shù)親水性殘基與配體形成 氨鍵。與Ε2相比，Oxyr獲得了更多的結(jié)合位點但結(jié)合分數(shù)略低于Ε2?；衔锘痽r與雌激素受 體ERa的Leu346、Glu353、Ar的94、Met421、Gl巧21等氨基酸殘基形成了 5個氨鍵，使分子定位 于活性口袋之內(nèi)，Leu384、化e404等氨基酸形成空間位阻作用，進一步穩(wěn)定了化yr在活性口 袋內(nèi)的結(jié)合。雌激素受體ER-β中，Oxyr與1^611298、6111305、4'邑346、化3475形成了4個氨鍵， Phe356、Ile373等殘基形成的空間位阻穩(wěn)定了化yr與E祕的結(jié)合。
[0097] 實施例2桑白皮活性單體成分氧化白襲蘆醇雌激素樣作用實驗
[0098] 1、化la細胞轉(zhuǎn)染實驗
[0099] 為了消除干擾，至少提前一代使用1 % CS-FBS-DMEM培養(yǎng)細胞。于轉(zhuǎn)染前一天，取生 長狀態(tài)良好的細胞，用0.25 %膜酶消化離屯、后，調(diào)整細胞濃度，用適量的1 % CS-FBS-DMEM培 養(yǎng)液重懸，種于96孔板中，100μΙ/孔，104個/孔。使得37°C，5%C〇2條件下培養(yǎng)8-lOh后細胞匯 合率達70 %-90 %。
[0100] 轉(zhuǎn)染:吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入90μ1 1%CS-FBS-DMEM。采用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。A 液:pTk-ERE-luc: ERa: pTk-Reni la = 2:1:1。每孔質(zhì)粒DM總量為0.化g，扣1基礎(chǔ)培養(yǎng)液輕輕 混勻；B液：0.3μ1 lipofectamine 2000用化1基礎(chǔ)培養(yǎng)液混勻。室溫解育5min，混合A、B兩 液，室溫解育20min。！化1/孔加入96孔板中。
[0101] 加藥:解箱中培養(yǎng)，8-1化內(nèi)吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗涂細胞。分別加入培基瓜，不 同濃度的受試藥物(DMS0溶解配制為10-2Μ的母液，4°C保存，每次實驗均用母液等級稀釋，使 細胞培養(yǎng)液中DMSO的終濃度< 1%〇)，解箱中培養(yǎng)24h。
[0102] 檢測:采用雙巧光素酶報告檢測系統(tǒng)試劑盒進行檢測，檢測試劑盒內(nèi)容物如下：
[0103] D5XPLB；
[0104] 2)Luciferase Assay Reagent II substrate，Luciferase Assay Reagent II buffer;LAR II substrate與buffer混合后，分裝保存于-80°C冰箱。實驗時將混合物超純 水稀釋5倍使用。
[0105] 3)Stop&GloTM substrate，Stop&GloTM buffe;r(現(xiàn)用現(xiàn)配substrate:buffer= 1: 49)實驗中超純水稀釋5倍后使用。
[0106] 取給藥后2地的細胞，PBS洗涂細胞，IX化B^assive Lysis Buffer)20yl/孔裂解 細胞5min，封口膜將96孔板封口置于-40°C冰箱凍存4h后取出融化，將細胞內(nèi)容物移入白板 中。避光加入超純水稀釋5倍的Luciferase Assay Reagent II(LAR II，分裝保存于-80°C 冰箱），10化1/孔，立即放入酶標儀中，使用1-2秒延遲，測定其5-lOs的發(fā)光值。隨即迅速加 入的超純水稀釋5倍的Stop&GloTM(現(xiàn)用現(xiàn)配substrate :buffer = 1:49) 100μΙ/孔，立即放 入酶標儀中，使用l-2s延遲，測定其5-lOs的發(fā)光值。WFiref ly Lucif erase/Renila Luciferase值作為結(jié)果，分別對每孔結(jié)果進行統(tǒng)計，每組Ξ孔取均值，比較統(tǒng)計各組比值差 異。
[0107] 2、MCF-7細胞轉(zhuǎn)染實驗
[0108] E.coli D冊α購于北京索萊寶生物技術(shù)有限責任公司。
[0109] 按照如下步驟在12孔板中轉(zhuǎn)染MCF-7細胞(步驟中均按照一個細胞孔的量給出質(zhì) 量和體積）。
[0110] 1)在10化1無血清化ti-MEM培養(yǎng)基中稀釋替換成攜帶有GFP表達基因的邸α、Ε地質(zhì) 粒，并輕輕混勻；
[0111] 2)使用前輕輕混勻LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑，取化1在96μ1 Opti-MEM培養(yǎng) 基中稀釋。室溫下靜置5分鐘；
[0112] 3)室溫下靜置5min后，混合LipofectamineTM 2000和DNA的稀釋液（總體積為200μ 1)。輕輕混勻并在室溫下靜置30分鐘；
[0113] 4)將12孔板中的舊培養(yǎng)液棄掉，使用無血清化t i -ΜΒ1培養(yǎng)基將細胞洗涂一次，然 后每孔加入80化1預(yù)熱的無血清化ti-MHM培養(yǎng)基，最后在12孔板中的每個孔中加混合液200 μ1，并前后輕輕搖動細胞板使混合液與孔中的培養(yǎng)液混勻；
[0114] 5)將孔板置于37°C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化后，更換為含有不同濃度藥物的培養(yǎng) 基培養(yǎng)，分組如下：
[0115] 空白組:含有0.1 %DMS0的2.5 % CS-FBS無酪紅的DMEM處理；
[0116] 給藥組:含有不同藥物的2.5%CS-FBS無酪紅的DMEM處理，分組為瓜組(0. ΟΙμΜ)、 E2(0.01yM)+ICI組(Ο.ΙμΜ)、氧化白襲蘆醇組（10μΜ)、Κ及氧化白襲蘆醇（10yM)+ICI(0.化 M)組；
[0117] 6)24h后在倒置巧光顯微鏡下觀察結(jié)果。
[0118] 3、桑白皮雌激素活性成分對MCF-7細胞ER誘導(dǎo)基因表達的影響
[0119] 為了消除干擾，至少提前一代使用10%CS-FBS-DMEM培養(yǎng)細胞。于實驗前一天，取 對數(shù)生長期的細胞，0.25%膜酶消化離屯、后，按面積調(diào)整細胞濃度，用適量的10%CS-FBS- DMEM培養(yǎng)液重懸，種于6孔板中。使得37 °C，5 % C〇2條件下培養(yǎng)24h后細胞匯合率達90 %。吸 棄培養(yǎng)基加入含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)2地。分組如下：
[0120] 空白組:含有0.1 %DMS0的2.5 % CS-FBS無酪紅的DMEM處理；
[01別]給藥組:含有不同藥物的2.5%CS-FBS無酪紅的DMEM處理，分組為瓜組(0. ΟΙμΜ)、 Ε2(0.01μΜ)+Ι(Π 組(0. ΙμΜ)、藥物各濃度組、W及藥物+ICI (0. ΙμΜ)組。
[0122] 給藥處理2地后提取RNA。
[0123] 3.1細胞總RNA提取
[0124] 棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗涂細胞2次，加入1ml化izol試劑對細胞進行裂解，反復(fù) 用槍吹打W裂解細胞;將細胞的化izol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫放置5min;向離屯、管中加 入Ξ氯甲燒20化1，劇烈震蕩使其充分乳化，溶液無分相現(xiàn)象后，室溫靜置5分鐘。12000g 4 °C離屯、，15min;此時，離屯、管中液體分為Ξ層:上清液、中間蛋白層及下層有機相。吸取上清 液轉(zhuǎn)移至另一新的離屯、管中（切忌吸出白色中間層）；向該離屯、管中加入所取上清液等體積 的異丙醇，上下顛倒使離屯、管中的液體充分混勻，室溫靜置lOmin。12000g 4°C離屯、，lOmin。 管底會出現(xiàn)白色沉淀；棄上清，加入75%的乙醇1 ml,溫和地上下顛倒，洗涂離屯、管管壁， 12000g 4°C離屯、，5min。棄去乙醇，盡量除凈乙醇;室溫放置2-5min，不能過久，否則RNA將會 很難溶解，加入適量的RNase-打ee水(常用體積為30-40U1)溶解沉淀，必要時可用移液槍輕 輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后備用或放置于-80°C冰箱保存。
[0125] 3.2總3臟濃度測定
[0126] 取化1 RNA溶液，加入99μ1 DEPC水中，WDEPC水作空白對照。在紫外分光光度計上 分別讀取260皿、280皿波長下的光密度值(0D值）。計算Α260/Α280的比值;其中，總RNA濃度 (yg/yl) =00260值 X 40 X 稀釋倍數(shù)/100
[0127] 3.3逆轉(zhuǎn)錄合成〇0臟
[01 巧]按照Transcriptor First Sl:and cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書依次在PCR 管中加入W下反應(yīng)物，模板上樣量為10化g。
[0129] 表4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（2化1體系）
[0130]
[0131] 將PCR小管放入C-1000PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：25°C10min，48°C30min，95°C 5min。得到的cDNA產(chǎn)物可于當天檢測或放置于-80°C冰箱保存。
[0132] 3.4RT-PCR
[0133] 按照SYBR GR邸N PCR Master Mix試劑盒說明書，在PCR管中依次加入W下反應(yīng) 物。
[0134] 表5PCR反應(yīng)體系（2化1體系）
[0135]
[0136] 反應(yīng)參數(shù)如下:95°C :20sec;95°C :3sec;60°C :30sec;循環(huán)數(shù):40
[0137] 溶解曲線步驟:每個循環(huán)在72°C時采集巧光，40個循環(huán)之后測定溶解曲線。
[0138] 溶解參數(shù)如下:95Γ : 20sec; 95Γ : 3sec; 60°C : 30sec;
[0139] 表6RT-PCR所用引物序列
[0140]
[0141 ] 注：W上引物均由上海生物工程公司合成。
[0142] Ct值是每個反應(yīng)管內(nèi)的巧光信號到達設(shè)定的闊值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與拷貝量呈 負對數(shù)關(guān)系。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越 多，Ct值越小。A Ct =待測基因 Ct值-內(nèi)參照基因 Ct值。應(yīng)用Bio-Rad實時定量PCR儀分析軟 件調(diào)整闊值后，查看并分析數(shù)據(jù)，得到每個樣品反應(yīng)的Ct值，計算得到ACt，并與對照組比 較，取值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0143] 4、MCF-7 細胞蛋白提取、Western-Blot 實驗
[0144] 4.1細胞蛋白提取與定量
[0145] 4.1.1細胞樣品的制備
[0146] 為了消除干擾，至少提前一代使用10%CS-FBS-DMEM培養(yǎng)細胞。于實驗前一天，取 對數(shù)生長期的細胞，0.25%膜酶消化離屯、后，按面積調(diào)整細胞濃度，用適量的10%CS-FBS- DMEM培養(yǎng)液重懸，種于6孔板中。使得37 °C，5 % CO2條件下培養(yǎng)24h后細胞匯合率達90 %。吸 棄培養(yǎng)基加入含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)2地。分組如下：
[0147] 空白組:含有0.1 %DMS0的2.5 % CS-FBS無酪紅的DMEM處理；
[0148] 模型組:含有LPS (化g/ml)的2.5 % CS-FBS無酪紅的DMEM處理；
[0149] 給藥組:含有不同藥物的2.5%CS-FBS無酪紅的DMEM處理，分組為瓜組(0. ΟΙμΜ)、 Ε2(0.01μΜ)+Ι(Π 組(0. ΙμΜ)、藥物各濃度組、W及藥物+ICI (0. ΙμΜ)組。
[0150] 4.1.2蛋白提取
[0151 ]用冷的PBS洗涂細胞2次，吸棄洗涂液;每孔加入50化1 PBS，用細胞刮將細胞板內(nèi) 的細胞收集于底角，并收集于1.5ml的ΕΡ管中，再用50化1 PBS將細胞刮沖洗干凈，將沖洗液 收集于EP管中；于3000rpm，4°C，5min的條件下離屯、得到細胞;盡可能吸棄上清，加入蛋白裂 解液(RIPA: PMSF = 100:1現(xiàn)用現(xiàn)配），吹吸混合液，至蛋白充分裂解，冰上放置30min，期間可 上下顛倒離屯、管使蛋白充分裂解;將蛋白裂解物l〇〇〇〇g，4°C，離屯、5min，將上清收集于新的 EP管中。
[0152] 4.1.3蛋白濃度檢測及定量
[0153] 配制BCA工作液:將BCA試劑盒中的試劑A和試劑B按A: B = 50:1的比例混合備用，現(xiàn) 用現(xiàn)配;配制蛋白標準品梯度濃度。
[0154] 4.2操作步驟
[0155] 4.2.1聚丙締酷胺凝膠的配制
[0156] 配制8%分離膠混合液，小屯、地將混合液在50ml離屯、管中混勻，然后立刻輕輕地將 膠倒入配膠槽內(nèi)，膠的表面距上端2cm左右，注意不要產(chǎn)生氣泡。在分離膠的表面加上一層 純水，使膠的表面平整。經(jīng)過大約30min分離膠凝固。膠凝固后，倒掉上面的純水，然后用濾 紙吸干膠表面的水分。
[0157] 配制5%濃縮膠混合液，小屯、地將膠液混合，加到分離膠上面，并插入相應(yīng)厚度的 梳子。濃縮膠凝固后，室溫放置。
[0158] 一旦加入TEMED，混勻后立即小屯、地將分離膠和濃縮膠注配膠板中，防止其在離屯、 管內(nèi)凝固。
[0159] 4.2.2準備及上樣
[0160] 待到濃縮膠凝固后，用記號筆畫出齒槽所在位置W方便后面上樣，然后兩手分別 捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。取下配好的膠將其放入電泳槽中。（玻璃板向外， 白板面向內(nèi)，用紅色夾子固定好。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊玻璃板且同樣用紅色 夾子固定好）。加入之前配好的足量的1X電泳緩沖液；
[0161] 上樣:試先取出之前變性好的蛋白，計算含50yg蛋白的溶液體積即為上樣量。按照 計算好的上樣量，用微量移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器槍頭插 至加樣孔中緩慢加入樣品，不要有氣泡。逐孔加完，最后加入蛋白Marker。按照紅色對紅色， 黑色對黑色蓋上電泳槽的蓋，時間一般3-地，電壓開始在濃縮膠里可W為80V，待蛋白在濃 縮膠內(nèi)濃縮成較粗一條時，把電壓調(diào)成100V。電泳至SDS剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。
[0162] 4.2.3 電泳
[0163] 將電泳裝置與電源連接。設(shè)置電壓和時間，在穩(wěn)壓下濃縮膠用80V，直到漠酪蘭示 蹤染料進入分離膠，將電壓調(diào)成120V;直至漠酪蘭到達分離膠的底部，關(guān)閉電源;拆除電泳 裝置：用薄板擦開玻璃平板，暴露凝膠，用邊緣整齊平整的薄板截取目的蛋白所在處的凝 化，W備后用。
[0164] 4.2.4 轉(zhuǎn)膜
[0165] 據(jù)蛋白所占據(jù)的大小和位置裁剪大小合適的PVDF膜，并在邊緣處做好標記，操作 過程中需帶手套，W免污染膜，用綴子夾住切好的PVD刊莫一側(cè)，置于有甲醇的容器中浸5min 才可使用;將轉(zhuǎn)膜緩沖液倒入搪瓷盤中，放入夾子，并把濾紙潤濕，夾子黑色的一面在下邊， 鋪好夾子和厚濾紙;取電泳后取材好的凝膠，鋪于濾紙上，凝膠與濾紙之間不要有氣泡，將 泡好的PVDF膜鋪于凝膠上，使二者間沒有氣泡，在該膜上覆蓋另一層厚的濾紙，加好夾子， 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。將轉(zhuǎn)移槽放入有 冰的泡沫盒內(nèi)，蓋上蓋子。一般用250mA或者300mA轉(zhuǎn)移適當?shù)臅r間即可。（轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋 白大小而定，蛋白多大kD即轉(zhuǎn)膜多少分鐘）
[0166] 4.2.5免疫反應(yīng)
[0167] 封閉:將轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜放入試先配制好的5%脫脂奶粉封閉液中，置于脫色搖 床上搖動封閉1.化-2h;
[0168] 解育一抗:封閉快完成的時候，用試先自制的塑料袋用TBST液配制所需濃度的一 抗稀釋液，待轉(zhuǎn)膜后，將膜在TBST下洗去封閉液，然后放入裝有一抗溶液的塑料袋內(nèi)，4 Γ下 封閉過夜。次日用TBST在室溫下脫色搖床上洗5次，每次5min;
[0169] 解育二抗：同法配制二抗稀釋液并放入洗好的膜，室溫下脫色搖床上解育化。同樣 用TBST在室溫下脫色搖床上洗5次，每次5min，進行化學發(fā)光；
[0170] 4.2.6化學發(fā)光、顯影與定影
[0171] 將A和B兩種試劑在平皿里等體積混勻，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸 Imin。在X-光片夾中鋪上一層保鮮膜，然后將膜移至保鮮膜上，再輕輕的蓋上一層保鮮膜， 用手輕輕的趕走兩層保鮮膜之間的氣泡，蓋上X-光片夾；
[0172] 在暗室中，將IX顯影液和定影液分別倒入塑料盤中，在紅燈下取出X-光片，用剪 刀裁成適當大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm)，根據(jù)巧光信號的強弱適當調(diào)整曝光時間；曝光 完成后，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間 一般為l-2min(20-25°C)，顯影結(jié)束后，把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5-lOmin， W膠片透明為止;用水沖去殘留的定影液后，室溫下驚干。
[0173] 4.2.7凝膠成像分析
[0174] 將膠片進行掃描或拍照，用多功能成像分析系統(tǒng)MP5000及自帶軟件掃描計算目標 帶的灰度值。
[0175] 在本實施例中，實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。實驗結(jié)果W均值± 標準差進行表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way AN0VA)"P<0.05為差異有 統(tǒng)計學意義。進行Ξ次獨立實驗，其中(n = 3)。
[0176] 5、實驗結(jié)果
[0177] 5.1桑白皮中雌激素活性成分化yr對化la細胞ER轉(zhuǎn)錄活性的影響
[017引lOnmol/L的E2可顯著促進化la細胞的邸α轉(zhuǎn)錄活性，巧光素酶活性為空白對照組 的2倍，E2和ICI(182,780)共同處理后，E2的促ER轉(zhuǎn)錄活性被抑制；0.1皿ol/L、l皿ol/L的 Oxyr對邸α、E祕轉(zhuǎn)錄活性均無影響，而10皿ol/L的Oxyr可顯著增強對ERa、E祕轉(zhuǎn)錄活性，且 巧光素酶活性約為空白對照組的1.5倍，該作用也可被ICI(182,780)阻斷，結(jié)果如圖1和2所 /J、- 0
[01巧]5.2MCF-7轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果
[0180] 攜帶有GFP表達基因的ERa、E地質(zhì)粒（即：ESR1和ESR2質(zhì)粒)經(jīng)轉(zhuǎn)化得到培養(yǎng)皿中的 菌落，在抗性篩選平板上隨機挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。質(zhì)粒大量提取 后進行凝膠電泳實驗，結(jié)果如圖3所示。驗證重組質(zhì)粒的品質(zhì)，其堿基對為6600bp，結(jié)果顯 示，ESR1和ESR2重組質(zhì)粒質(zhì)量完好。將上述兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞，加后給予不同 藥物處理，24h后在倒置巧光顯微鏡觀察結(jié)果，如圖4所示，當攜帶GFP的ERa、E郎轉(zhuǎn)錄表達 時，在藍色激發(fā)光照射下可觀察到綠色巧光。給予10皿ol/L的E2處理后，視野下的綠色巧光 多且強，提示E2可顯著促進MCF-7細胞的邸轉(zhuǎn)錄活性，ICI (182，780)可減弱該上調(diào)作用，給 予10皿ol/L的化yr后視野中綠色巧光蛋白表達上調(diào)，提示化yr可顯著增強對邸α、Ε祕轉(zhuǎn)錄 活性，ICI (182，780)可減弱該上調(diào)作用。
[0181] 5.3化yr對邸誘導(dǎo)基因表達的影響
[0182] 與空白對照組相比，E2組可顯著促進MCF-7細胞的邸誘導(dǎo)基因 CTSD、PGR、P S2mRNA 的表達瓜和ICI(182,780)共同處理后瓜的上調(diào)作用被抑審ij。結(jié)果如圖5、圖6所示，ΙΟμ mol/ L化yr組對CTSD、PGR mRNA的表達有上調(diào)作用，而0.1皿ol/L和1皿ol/L組對其沒有明顯影 響。1皿ol/L、10皿ol/L Oxyr組可顯著上調(diào)pS2mRNA的表達（如圖7所示），且Oxyr促進MCF-7 細胞的ER誘導(dǎo)基因表達的作用可被ICI(182,780)阻斷。
[0183] 5.4化yr對MCF-7細胞邸蛋白表達的影響
[0184] ERa、E郎是MCF-7細胞中的標志性蛋白，當給及激素樣活性物質(zhì)處理時，兩者的表 達上調(diào)，如圖8、圖9所示，與空白對照組相比，lOnmol/L的E2可促進MCF-7細胞的ER誘導(dǎo)基因 ERa、ERf3蛋白的表達，E2和ICI(182,780)共同處理后，E2的上調(diào)作用被抑制，與E2相似，1μ mol/L、10皿ol/L的Oxyr可顯著增強邸α、Ε祕蛋白的表達。當Oxyr和ICI (182，780)共同處理 后，該上調(diào)作用被阻斷。
[0185] 綜上所述，十種受試桑白皮單體成分中，苯并巧喃類化合物、糞類化合物和部分黃 酬類化合物呈現(xiàn)抑制MCF-7細胞增殖的作用。二苯乙締類的化合物可顯示出促進MCF-7細胞 的增殖，且該作用可被ICI182，780所阻斷，提示其發(fā)揮促MCF-7細胞增殖的作用可能是m?介 導(dǎo)的。其中活性最強的化yr也可通過誘導(dǎo)契合作用使蛋白發(fā)生一定的形態(tài)變化可與邸α、邸 0的活性口袋匹配結(jié)合，顯示出較強的雌激素活性，桑白皮單體成分化yr可激活邸S，表現(xiàn)出 一定的雌激素活性，桑白皮中單體成分化yr對E地的激活作用強于對ERa的激活作用。此外， Oxyr通過與ER結(jié)合，作用于激活下游雌激素信號通路，作用于祀基因 DNA結(jié)合位點，上調(diào)雌 激素誘導(dǎo)基因和ERa、ΕΚβ蛋白表達。
[0186] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可W被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細節(jié)和運里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項】
1. 基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，包括： 選取桑白皮中多種待測試化合物； 在所述待測試化合物中通過雌激素活性篩選實驗篩選出顯著促進乳腺癌細胞增殖的 化合物；以及 通過分子對接實驗篩選出對乳腺癌細胞具有較強親和力的化合物； 在篩選后的所述化合物中確定最終具有雌激素樣的化合物。2. 如權(quán)利要求1所述的基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，所述最終 具有雌激素樣的化合物為氧化白藜蘆醇。3. 如權(quán)利要求1或2所述的基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，所述 雌激素活性篩選實驗包括如下步驟： 使用10 %胎牛血清的DMEM含酚紅的培養(yǎng)基對乳腺癌細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶 壁80 %以上時，對細胞進行消化后，取1/3接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在增殖 實驗前一代將培養(yǎng)基換為10%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酚紅的DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度，用2.5%經(jīng)活性炭處理的胎牛血清無酚紅的DMEM培 養(yǎng)基進行接種后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，后加入含有不同濃度化合物的2.5%經(jīng)活性炭處 理的胎牛血清無酚紅的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時，加入MTT，4小時后吸棄培養(yǎng)板內(nèi)液體， 加入DMSO 100μL7孔，對所述細胞進行光密度值檢測。4. 如權(quán)利要求3所述的基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，所述雌激 素活性篩選實驗以及分子對接實驗中使用所述待測試化合物濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ。5. 如權(quán)利要求1所述的基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，在所述分 子對接實驗中，對所述待測試化合物進行去鹽、加氫以及離子化處理，對所述乳腺癌細胞中 的結(jié)合受體去除蛋白周圍的水分子和共晶的小分子配體，并對蛋白結(jié)構(gòu)加氫進行能量最小 化處理。6. 如權(quán)利要求5所述的基于桑白皮中雌激素樣成分的篩選方法，其特征在于，在所述分 子對接實驗中，篩選出所述待測試化合物中與雌激素受體ERa和/或ER0的具有較強親和力 的化合物。7. 通過細胞轉(zhuǎn)染實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方法，其特征在于， 包括:所述細胞轉(zhuǎn)染實驗包括人宮頸癌細胞和/或乳腺癌細胞的細胞轉(zhuǎn)染實驗； 其中，人宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 后加入含有濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白藜蘆醇，在孵箱中培養(yǎng)，采用雙熒光素酶報告檢測 系統(tǒng)測定其發(fā)光值，與空白組對照組進行比較，氧化白藜蘆醇增強人宮頸癌細胞ER轉(zhuǎn)錄活 性； 乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染實驗包括如下步驟:準備待轉(zhuǎn)染細胞，加入攜帶有GFP表達基因的質(zhì)粒 和轉(zhuǎn)染試劑的混合液后，培養(yǎng)6小時，加入含有濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白藜蘆醇，培養(yǎng)24 小時后觀察熒光結(jié)果，與空白對照組進行比較，氧化白藜蘆醇增強乳腺癌細胞ER轉(zhuǎn)錄活性。8. 通過乳腺癌細胞ER基因表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方法， 其特征在于，包括如下步驟:向待實驗細胞內(nèi)加入濃度為0. ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白藜蘆醇培養(yǎng) 24小時后，對細胞進行總RNA提取及濃度測定，通過RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過cDNA合成 RT-PCR，測定每個實驗中的反應(yīng)體系內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與拷 貝量呈負對數(shù)關(guān)系，與空白對照組進行比較，氧化白藜蘆醇促進乳腺癌細胞的ER誘導(dǎo)基因 表達。9. 通過乳腺癌細胞蛋白表達實驗對桑白皮中雌激素樣成分的雌激素作用驗證方法，其 特征在于，包括如下步驟:向待實驗細胞內(nèi)加入含有濃度為Ο.ΙμΜ~ΙΟμΜ的氧化白藜蘆醇進 行培養(yǎng)，然后對細胞進行蛋白提取，對ERa、ERi3蛋白進行含量檢測，與空白對照組進行比較， 氧化白藜蘆醇增強ERa、ER0蛋白表達。10. 基于桑白皮中雌激素樣成分的應(yīng)用，其特征在于，包括： 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白藜蘆醇用于增強人宮頸癌細胞的ERa和/或ERi3轉(zhuǎn)錄 活性;或 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白藜蘆醇用于增強乳腺癌細胞的ERa和/或ERi3轉(zhuǎn)錄活 性;或 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白藜蘆醇用于促進乳腺癌細胞的ER誘導(dǎo)基因 CTSD、 PGR、pS2mRNA的表達;或 使用桑白皮中雌激素樣成分氧化白藜蘆醇用于增強乳腺癌細胞的ERa和/或ERi3蛋白表 達。
【文檔編號】G01N33/68GK106011218SQ201610522062
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】樊官偉, 魏靜, 高秀梅, 陳景瑞, 邱峰, 劉二偉
【申請人】天津中醫(yī)藥大學