一種免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及試劑盒或試劑箱，具體地說(shuō)，本實(shí)用新型涉及免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫 瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā) 生。NK細(xì)胞在抗病毒、抗腫瘤中扮演了重要的角色，因其作用不需初次免疫活化，因此在過(guò) 繼免疫治療中有很大的應(yīng)用前景。
[0003] 使用NK細(xì)胞進(jìn)行免疫治療，需要首先在體外擴(kuò)增大量的具有較高殺傷活性的NK 細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開(kāi)發(fā)能夠在體外高效擴(kuò)增具有較高殺傷活性的NK細(xì)胞 的技術(shù)。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004] 本實(shí)用新型的目的在于提供一種免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒，以解決在體外高效擴(kuò) 增具有較高殺傷活性的NK細(xì)胞的技術(shù)問(wèn)題。
[0005] 本實(shí)用新型提供了一種免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒，所述試劑盒包括盒體、可開(kāi)啟 的盒蓋以及儲(chǔ)存單元，所述存儲(chǔ)單元位于所述盒體內(nèi)部，所述儲(chǔ)存單元包括工程細(xì)胞儲(chǔ)存 單元、細(xì)胞因子儲(chǔ)存單元和細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元，
[0006] 所述工程細(xì)胞儲(chǔ)存單元的總?cè)萘繛?-50ml;
[0007] 所述細(xì)胞因子儲(chǔ)存單元的總?cè)萘繛?0-500yL;
[0008] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元的總?cè)萘繛?0-150ml。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述盒體內(nèi)部裝有固定板，所述工程細(xì)胞儲(chǔ)存單元、所述細(xì)胞因 子儲(chǔ)存單元和所述細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元可拆卸地固定于所述固定板上。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述工程細(xì)胞儲(chǔ)存單元中儲(chǔ)存有工程細(xì)胞；所述細(xì)胞因子儲(chǔ)存 單元中儲(chǔ)存有細(xì)胞因子IL-2 ;和所述細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元中儲(chǔ)存有NK細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述工程細(xì)胞儲(chǔ)存單元包括5-15個(gè)工程細(xì)胞試劑瓶，各所述工 程細(xì)胞試劑瓶的容量為l_2ml。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞因子儲(chǔ)存單元包括1-5個(gè)細(xì)胞因子試劑瓶，各所述細(xì) 胞因子試劑瓶的容量為50-100yL。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元包括1-3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基試劑瓶，各所 述細(xì)胞培養(yǎng)基試劑瓶的容量為30-80ml。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述工程細(xì)胞表達(dá)mbCD137L、mbIL15和/或mbIL21分子。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述工程細(xì)胞試劑瓶的數(shù)量為8-12個(gè)（優(yōu)選為10個(gè)），各所述 工程細(xì)胞試劑瓶的容量為l_2ml。各所述工程細(xì)胞試劑瓶的容量可以相同也可以不同。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞因子試劑瓶的數(shù)量為1-3個(gè)，各所述細(xì)胞因子試劑瓶 的容量為50-100yL。各所述細(xì)胞因子試劑瓶的容量可以相同也可以不同。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基試劑瓶的數(shù)量為1-2個(gè)，各所述細(xì)胞培養(yǎng)基試 劑瓶的容量為30-80ml。各所述細(xì)胞培養(yǎng)基試劑瓶的容量可以相同也可以不同。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述固定板上設(shè)置有孔或凹槽，所述工程細(xì)胞試劑瓶、細(xì)胞因子 試劑瓶、和細(xì)胞培養(yǎng)基試劑瓶置于所述孔或凹槽內(nèi)。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述固定板設(shè)有：
[0020] 第一凹槽組，所述第一凹槽組用于安放所述工程細(xì)胞儲(chǔ)存單元；
[0021] 第二凹槽組，所述第二凹槽組用于安放所述細(xì)胞因子儲(chǔ)存單元；和
[0022] 第三凹槽組，所述第三凹槽組用于安放所述細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存單元。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述第一凹槽組、所述第二凹槽組和所述第三凹槽組中凹槽的 數(shù)量比為10 :1 :1。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述第一凹槽組包含5-15個(gè)第一凹槽，優(yōu)選為10個(gè)。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述第二凹槽組包含1-5個(gè)第二凹槽，如1或2個(gè)。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述第三凹槽組包含1或2個(gè)第三凹槽。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述第一凹槽、所述第二凹槽和所述第三凹槽的數(shù)量比為10 : 1 :1〇
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑瓶為密封無(wú)菌試劑瓶。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑瓶為錐形底、圓底或平底的試劑瓶。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述盒體和所述盒蓋是相連接的或相互獨(dú)立的，所述盒蓋蓋在 所述盒體上，使所述試劑盒保持密封狀態(tài)。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述固定板固定在所述盒體內(nèi)，或者所述固定板是可拆卸的。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述固定板為海綿固定板或泡沫固定板，可拆卸地固定在盒體 內(nèi)部。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述固定板上還設(shè)有第四凹槽組，所述第四凹槽組包含1-3個(gè) 第四凹槽，用于放置制冷物，所述制冷物優(yōu)選為冰袋，更優(yōu)選為正方體或長(zhǎng)方體的冰袋。
[0034] 應(yīng)理解，在本實(shí)用新型范圍內(nèi)中，本實(shí)用新型的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí) 施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為本實(shí)用新型的試劑盒的外觀結(jié)構(gòu)示意圖。
[0036] 圖2為本實(shí)用新型的一優(yōu)選實(shí)施方式中試劑盒的盒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037] 圖3為本實(shí)用新型的一優(yōu)選實(shí)施方式中試劑盒的固定板結(jié)構(gòu)示意圖。
[0038] 圖4為本實(shí)用新型的另一優(yōu)選實(shí)施方式中試劑盒的固定板結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本實(shí)用新型提供的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒，能夠高效擴(kuò)增出純度和殺傷活性都 較高的NK細(xì)胞，而且能夠避免加入多種細(xì)胞因子，更簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、且擴(kuò)增高效。
[0040] 術(shù)語(yǔ)
[0041] 如本文所用，"試劑盒"也可稱為試劑箱，具有相同的含義，均用于盛載適用于NK 細(xì)胞擴(kuò)增的配套器具（如試劑瓶），并在配套器具中存放相應(yīng)的試劑。
[0042] 如本文所用，"工程細(xì)胞"是指可以表達(dá)mbCD137L、mbIL15、和/或mbIL21等分子 的工程細(xì)胞。關(guān)于這些工程細(xì)胞是已知的，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在相關(guān)公開(kāi)的報(bào)道，也可以從 市售的渠道的獲得，比如購(gòu)自博生吉醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司。
[0043] 在本市實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述工程細(xì)胞為工程細(xì)胞pAPC-mbIL21。 pAPC細(xì)胞是一種經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)將⑶137L和IL-15基因?qū)爰?xì)胞，使其在細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá) ⑶137L和IL-15分子的工程細(xì)胞，由博生吉公司構(gòu)建和提供。pAPC-mbIL21 (pAPC-membrane bindingIL21)是利用慢病毒將IL21分子表達(dá)在pAPC細(xì)胞膜上。
[0044] 研宄表明可溶性的IL2、IL15及飼養(yǎng)細(xì)胞可刺激NK細(xì)胞的擴(kuò)增，不過(guò)NK細(xì)胞擴(kuò) 增倍數(shù)較低限制了該方案的應(yīng)用。而經(jīng)膜結(jié)合型IL21刺激擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞端粒長(zhǎng)度增 長(zhǎng)，能夠在體外更長(zhǎng)時(shí)間維持NK細(xì)胞的擴(kuò)增。
[0045] 所以本試劑盒采用了一種改良型的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用了一種表 達(dá)了NK細(xì)胞分化成熟所必需的mbCD137L、mbIL15、和/或mbIL21等分子的工程細(xì)胞，該細(xì) 胞能夠作為一種在體外能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞分化成熟的飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0046] 使用本實(shí)用新型的工程細(xì)胞，在IL-2(60IU/ml)共同參與下，進(jìn)行NK細(xì)胞擴(kuò)增，通 過(guò)流式檢測(cè)確定，NK細(xì)胞（⑶3-⑶56+)占總細(xì)胞的百分率可以從10. 59%升高到86. 76%。 數(shù)據(jù)同時(shí)顯示，在應(yīng)用本擴(kuò)增技術(shù)體外擴(kuò)增NK細(xì)胞進(jìn)行到21天時(shí)，相比初始NK細(xì)胞數(shù)目， NK細(xì)胞數(shù)目最多可增加600多倍。此外，應(yīng)用本擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞能夠?qū)562 等多種細(xì)胞系表現(xiàn)出很好的殺傷效果，殺傷效率均高達(dá)76. 7%以上。
[0047] 綜上，該擴(kuò)增方法避免了加入多種細(xì)胞因子，更簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、且擴(kuò)增高效。這種基于 mbIL21的改良型NK細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，在IL-2(60IU/ml)共同參與下，能夠高效擴(kuò)增出純度和 殺傷活性都較高的NK細(xì)胞。
[0048] 如本文所用，"細(xì)胞因子IL-2"是一種已知的材料，可以從市售的渠道獲得，比如可 以購(gòu)自羅氏（Roche)公司。
[0049] 如本文所用，"NK細(xì)胞培養(yǎng)基"是一種已知的材料，可以從市售的渠道獲得，比如可 以購(gòu)自美天旎（MiltenyiBiotec)公司。
[0050] 本試劑盒為一種改良型的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)采用了一種表達(dá)了NK 細(xì)胞分化成熟所必需的mb⑶137L、mbIL15、mbIL21等分子的工程細(xì)胞，該細(xì)胞能夠作為一 種在體外能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞分化成熟的飼養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)用本試劑，可在7天左右觀察到NK細(xì) 胞開(kāi)始快速擴(kuò)增。并且，本試劑可在體外連續(xù)活化和擴(kuò)增NK細(xì)胞達(dá)4-6個(gè)周期。
[0051] 本實(shí)用新型的優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述試劑盒中的試劑瓶共三種12個(gè)，均為密封 無(wú)菌試劑瓶，分別裝有工程細(xì)胞pAPC-mbIL21，細(xì)胞因子IL-2和NK細(xì)胞培養(yǎng)基。本實(shí)用新 型的試劑盒，使用方便，適用于體外擴(kuò)增人源NK細(xì)胞，利于NK細(xì)胞在體外維持的長(zhǎng)期活性， 且使NK細(xì)胞獲得大量增殖，經(jīng)過(guò)優(yōu)化適用于臨床應(yīng)用。
[0052] 本實(shí)用新型的優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述試劑盒是密封的，包括合體和可開(kāi)啟的盒 蓋，所述合體內(nèi)部裝有固定板，所述固定板上設(shè)置數(shù)個(gè)放置有器具的孔或凹槽，所述器具為 試劑瓶。其中所述試劑盒中的試劑瓶共12個(gè)，均為密封無(wú)菌試劑瓶，10個(gè)裝有工程