專利名稱：利用細胞自發(fā)熒光光譜測定細胞周期的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定細胞周期的方法，特別涉及一種利用細胞自發(fā)熒光光譜準確反映 細胞周期變化的方法。
背景技術(shù)：
細胞作為生命科學研究的基礎(chǔ)， 一切生命的關(guān)鍵問題都要從細胞中尋找。生物的生殖 發(fā)育、遺傳、神經(jīng)(腦)活動等重大生命現(xiàn)象的研究都要以細胞為基礎(chǔ)。植物與動物生長 發(fā)育是依靠細胞增殖、細胞分化與細胞凋亡來實現(xiàn)的， 一切疾病的發(fā)病機制也要以細胞病 變研究為基礎(chǔ)。細胞分裂是生命起源最基本也最重要的過程。細胞生長和細胞分裂是所有 生物增殖的基本形式，細胞生長和細胞分裂的周期即為細胞增殖周期簡稱細胞周期(cell cycle)。對于真核細胞而言，其細胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，它是細胞全 部生理過程的綜合體現(xiàn)，普遍存在于高等生物中。目前，細胞周期及其調(diào)控機制已在腫瘤、 干細胞移植、衰老、生殖和遺傳學等領(lǐng)域顯示出巨大的指導意義。
目前，對于細胞周期進行判定的研究方法主要有以下幾種光學顯微鏡法、流式細胞 儀分析法(DNA含量分析)、3H-TdR標記法等。光學顯微鏡法主要是通過顯微鏡對細胞 的形態(tài)進行觀察以判斷細胞所處細胞周期，該方法是通過人眼觀察，判斷速度慢；流式細 胞儀分析法在細胞周期研究中應(yīng)用廣泛，但價格昂貴。從DNA含量入手，G1期和G2/M 期含有固定的DNA含量，分別為1倍和2倍，S期細胞的DNA含量介于1倍和2倍之間， 應(yīng)用流式細胞儀就可通過監(jiān)測細胞DNA含量的變化確定細胞周期的長短。但是由于G2 期和M期細胞的DNA含量都是2倍，故流式細胞儀無法區(qū)分G2期和M期細胞。3H-TdR 標記法是測定細胞的一種經(jīng)典方法。但其測量中使用的放射性同位素要求專門設(shè)備，很容 易對操作者造成傷害和對環(huán)境造成污染，同時放射性同位素本身對細胞周期也有干擾且不
可避免。
細胞在細胞周期的變化過程中，細胞內(nèi)部的氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)都將隨著細 胞的生長變化發(fā)生巨大的變化。組織細胞的熒光有兩種 一種是自發(fā)熒光， 一種是繼發(fā)熒 光。自發(fā)熒光是指細胞或組織不經(jīng)熒光色素染色，在紫外光或短波長光的照射下所發(fā)出的
熒光。組織細胞經(jīng)熒光色素染色后，細胞內(nèi)某些成分和熒光色素結(jié)合后而呈現(xiàn)的熒光稱為 繼發(fā)性熒光。上述兩種熒光光譜的變化都可以反應(yīng)細胞周期的變化，其中自發(fā)熒光的變化 主要由蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸和核酸引起，繼發(fā)性熒光是熒光色素和細胞內(nèi)的某些特定 成分結(jié)合后而呈現(xiàn)出不同顏色的專一性熒光，雖然這種熒光較強便于觀察，但是用于產(chǎn)生 繼發(fā)性熒光的熒光色素或染劑可能給細胞帶來未知的副作用，給細胞生長造成影響。因此 利用細胞的自發(fā)熒光光譜法直接對細胞中的熒光團進行研究。核酸和蛋白質(zhì)是細胞中產(chǎn)生 熒光的非常重要的兩類物質(zhì)。核酸的熒光量子產(chǎn)率很低，給檢測帶來較大的難度。蛋白質(zhì) 構(gòu)成細胞的大部分，占細胞干重的一半以上，在300 350nm范圍顯示出強熒光，它與生命 活動息息相關(guān)，在生物體內(nèi)具有多種多樣的功能。蛋白質(zhì)固有熒光性質(zhì)使得利用熒光光譜 法對其進行研究具有獨特的優(yōu)勢，它具有天然熒光主要是因為芳香族氨基酸——酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸。它們的相對熒光強度比為100:9:0.5，苯丙氨酸的最大發(fā)射波長為 282nm，酪氨酸304nm，色氨酸340nm。
目前，國內(nèi)外通過建立細胞自發(fā)熒光光譜模型以對細胞的細胞周期進行判斷還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種能夠?qū)φ婧思毎募毎?期各階段(Gl期、S期、G2期和M期)進行判斷的簡便方法，將細胞的熒光光譜信息同 細胞生長行為以及細胞增殖過程中生物化學反應(yīng)對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的影響聯(lián)系起來對細胞 周期進行判斷。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的利用熒光光譜法測定細胞周期的方法，其特征在于包括
如下步驟1)將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處于正常生長狀態(tài)下的細胞
周期Gl期、S期、G2期和M期的單個細胞制成標準樣品。利用熒光分光光度計或熒光光 譜儀測出被測細胞標準樣品的最佳激發(fā)波長，即以該波長照射樣品時，能獲得相對強度最 大的熒光譜；
首先用250nm為激發(fā)波長在250~700nm范圍進行掃描，得到細胞在250nm情況下的發(fā) 射光譜過后，測量250nm到發(fā)射光譜中的第一個熒光峰波長之間的激發(fā)光譜，找到激發(fā)光 譜中熒光強度最強的峰，這個峰所對應(yīng)的波長即為被測細胞樣品的最佳激發(fā)波長，最后以 最佳激發(fā)波長做激發(fā)光測量該波長到700nm間的熒光光譜，掃描間隔0. lnm;
對于在熒光光譜范圍內(nèi)只有一個熒光峰的情況，則直接利用該熒光峰強度與細胞周期 的關(guān)系建立模型通過熒光峰強度對細胞周期進行判別；對于在熒光光譜范圍內(nèi)有多個吸收
峰的情況，則建立距離激發(fā)波長最近的熒光峰強度與細胞周期的關(guān)系曲線，再利用該關(guān)系 對細胞周期進行判別；
2)利用熒光分光光度計或熒光光譜儀在最佳激發(fā)波長到700nm范圍內(nèi)，對被測樣品 進行掃描，對所得光譜曲線進行預處理后，將被測樣品光譜曲線的吸收峰強度與所述某種 細胞周期的熒光光譜模型的吸收峰強度對比，即可判斷出被測細胞處于細胞周期的哪一階 段。
該方法利用細胞在細胞周期(Gl期、S期、G2期和M期)變化過程中胞內(nèi)熒光物質(zhì)(如 氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等)的不斷變化對其熒光光譜的峰位、譜峰及峰強造成的影響，找 出這些參數(shù)與細胞所處周期的對應(yīng)關(guān)系，建立特定細胞的細胞周期熒光光譜模型，最終利 用該模型實現(xiàn)對單個細胞周期的準確測定。該方法將一種常規(guī)方法用于對細胞周期的測 量，解決以往依賴流式細胞儀對細胞周期進行測定的較為繁瑣的判別方法，而且能夠?qū)?胞周期中處于G2期和M期的細胞進行區(qū)分，這是流式細胞儀無法實現(xiàn)的。
本發(fā)明方法制樣簡單、操作方便、儀器設(shè)備普遍、準確性高、測量速度快，應(yīng)用細胞 熒光峰強度隨細胞周期變化的關(guān)系，可很方便的對細胞的細胞周期進行判斷，細胞樣品無 需采用熒光染劑對染色，從而消除了熒光染劑的使用帶來的副作用，使得細胞在測量后還 可用于后繼培養(yǎng)和研究，有利于在生物醫(yī)學研究過程中推廣應(yīng)用。


圖1為Hela細胞細胞周期各階段自發(fā)熒光光譜曲線圖； 圖2為熒光峰強度和細胞周期的關(guān)系圖。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例利用熒光光譜法對Hela細胞進行細胞周期測量的方法-1、首先，建立Hela細胞周期的熒光光譜模型，每一時相的細胞標準光譜曲線按以下 步驟獲取
① 樣品的獲得。為獲取準確的光譜數(shù)據(jù)，首先要保證細胞樣品處于自然生長狀態(tài)下， 采用光學顯微鏡觀察根據(jù)形態(tài)變化，獲取處于細胞周期不同時相(Gl期、S期、G2期和 M期)的單個細胞，將其作為標準樣品。
② 各時相細胞最佳激發(fā)波長的獲取。首先用250nrn為激發(fā)波長在250~700nm范圍進行
掃描，得到細胞在250mn情況下的發(fā)射光譜過后，測量250nm到發(fā)射光譜中的第一個熒光 峰波長360nm之間的激發(fā)光譜，找到激發(fā)光譜中熒光強度最強的峰，這個峰所對應(yīng)的波長 290nm即為被測細胞樣品的最佳激發(fā)波長。
③ 各時相細胞熒光光譜的測量。在生理溫度(36.5士0.5'C)下利用熒光分光光度計 或熒光光譜儀，測量標準樣品的300nm到700nm間的熒光光譜，掃描間隔0. lnm，掃描次 數(shù)5次。(測量結(jié)果曲線如附圖l所示)。
④ 細胞熒光光譜的預處理。將每一細胞周期的5組光譜數(shù)據(jù)取平均作為該樣品組細胞 的標準光譜曲線，將平均所得光譜曲線進行平滑濾波處理，以降低消除測量中各種原因引 起的光譜畸變。
⑤ 細胞熒光光譜模型的建立。完成細胞周期各階段樣品的光譜曲線的測量后得到兩個 特征熒光峰，利用距離激發(fā)波長290nm最近的360nm波長處的熒光峰強度與細胞所處細胞 周期相應(yīng)階段的關(guān)系建立對應(yīng)模型(如附圖2所示)。
2、完成細胞周期各階段的光譜模型建立后，就可對細胞所處周期進行判斷。首先， 利用熒光分光光度計或熒光光譜儀在290 700nm范圍內(nèi)，對被測Hela細胞樣品進行掃描， 對所得光譜曲線進行平滑濾波等處理后，將光譜曲線建立模型所用波長對應(yīng)的吸收峰強度 與模型對比，即可判斷出被測細胞處于細胞周期的G1期(如附圖2所示)。
本發(fā)明方法將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處于正常生長狀態(tài)下的細胞 周期G1期、S期、G2期和M期的單個細胞制成標準樣品，利用熒光分光光度計或熒光光 譜儀測量各細胞樣品在于其最佳激發(fā)波長10nm到700nm范圍內(nèi)的熒光光譜。在該范圍 內(nèi)的主要熒光峰處，熒光峰的強度會隨著細胞周期變化中胞內(nèi)物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋 白質(zhì)等)的不斷變化的有明顯的變化。對于在該范圍內(nèi)只有一個熒光峰的情況，則直接利 用該熒光峰強度與細胞周期的關(guān)系建立模型通過熒光峰強度對細胞周期進行判別。對于在 該范圍內(nèi)有多個熒光峰的情況，則以離激發(fā)波長距離最近的那個熒光峰對細胞周期進行判 別，建立其強度與細胞周期的關(guān)系模型。完成模型的建立后，當要對該種細胞所處的細胞 周期進行測定時，只需測量其在最佳激發(fā)波長 700nm的熒光光譜，將所得熒光峰強度與 相關(guān)模型對比即可判斷其所處細胞周期。
本發(fā)明所提供的細胞熒光光譜法是可反映真核細胞在細胞周期過程中各個階段Gl期、
S期、G2期和M期的變化趨勢。細胞的生長、增殖過程都和細胞周期密不可分，在細胞
周期的各個時相中，由于細胞內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)隨細胞周期變化而在各時相中的不
均勻分布以及濃度變化，造成了細胞在各時相中熒光光譜的峰值及其強度的差異。故可將
這種差異作為熒光光譜方法測定細胞周期的主要參數(shù)，從而準確地對細胞的生長行為進行 描述和判斷。
利用熒光光譜可以對細胞周期過程中的蛋白質(zhì)的變化進行精確的跟蹤進而得出在細 胞周期不同時相的特征光譜，并以此作為建立細胞周期光譜信息模型的依據(jù)。同時，樣品 無需采用熒光染劑對染色，從而消除了熒光染劑的使用帶來的副作用，使得細胞在測量后 還可用于后繼培養(yǎng)和研究。它還具有設(shè)備簡單、價格低廉、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點。
權(quán)利要求
1、利用細胞自發(fā)熒光光譜測定細胞周期的方法，其特征在于，包括如下步驟1)將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處于正常生長狀態(tài)下的細胞周期G1期、S期、G2期和M期的單個細胞作為標準樣品；2)利用熒光分光光度計或熒光光譜儀測出被測細胞標準樣品的最佳激發(fā)波長，以最佳激發(fā)波長做激發(fā)光測量該波長到700nm間的熒光光譜；3)利用熒光分光光度計或熒光光譜儀在最佳激發(fā)波長到700nm范圍內(nèi)，對與所述標準樣品同種類的被測樣品進行掃描，對所得光譜曲線進行預處理后，將被測樣品光譜曲線的吸收峰強度與所述某種細胞周期的熒光光譜模型的吸收峰強度對比，即可判斷出被測細胞處于細胞周期的哪一階段；對于在熒光光譜范圍內(nèi)只有一個熒光峰的情況，則直接利用該熒光峰強度與細胞周期的關(guān)系建立模型通過熒光峰強度對細胞周期進行判別；對于在熒光光譜范圍內(nèi)有多個峰的情況，則采用距離激發(fā)波長最近的熒光峰，再利用該關(guān)系對細胞周期進行判別。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用細胞自發(fā)熒光光譜測定細胞周期的方法，其特征在于， 所述標準樣品的獲得，要保證細胞樣品處于自然生長狀態(tài)下，采用光學顯微鏡觀察根據(jù)形 態(tài)變化，獲取處于細胞周期不同時相的細胞，將其制成標準樣品。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用細胞自發(fā)熒光光譜測定細胞周期的方法，其特征在于， 所述最佳激發(fā)波長的測量方法是首先用250nm為激發(fā)波長在250~700nm范圍對被測細胞 標準樣品進行掃描，得到該標準樣品細胞在250nm情況下的發(fā)射光譜過后，測量250nm到 發(fā)射光譜中的第一個熒光峰波長之間的激發(fā)光譜，找到激發(fā)光譜中熒光強度最強的峰，這 個峰所對應(yīng)的波長即為被測標準樣品細胞的最佳激發(fā)波長，最后以最佳激發(fā)波長做激發(fā)光 測量該波長到700nm間的熒光光譜，掃描間隔0. lnm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用熒光光譜法測定細胞周期的方法，其特征在于，所述步 驟2)中熒光光譜的測量是在生理溫度36. 5±0. 5'C下利用熒光分光光度計或熒光光譜儀， 進行標準樣品的熒光光譜測量，設(shè)定分光光度計的掃描范圍為最佳激發(fā)波長到700nm，掃 描步長O. lnm，掃描次數(shù)5次。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用熒光光譜法測定細胞周期的方法，其特征在于，所述細 胞光譜的預處理是將每一細胞周期的5組光譜數(shù)據(jù)取平均作為該樣品組細胞的標準光譜曲 線，將平均所得光譜曲線進行平滑濾波處理。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用細胞自發(fā)熒光光譜測定細胞周期的方法。該方法利用細胞在細胞周期(G1期、S期、G2期和M期)變化過程中胞內(nèi)熒光物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等)的不斷變化對其熒光光譜的峰位、譜峰及峰強造成的影響，找出這些參數(shù)與細胞所處周期的對應(yīng)關(guān)系，建立特定細胞的細胞周期熒光光譜模型，最終利用該模型實現(xiàn)對單個細胞周期的準確測定。本發(fā)明制樣簡單、操作方便、儀器設(shè)備普遍、準確性高、測量速度快，應(yīng)用細胞吸收峰強度隨細胞周期變化的關(guān)系，可很方便的對細胞的細胞周期進行判斷，細胞樣品無需采用熒光染劑對染色，從而消除了熒光染劑的使用帶來的副作用，使得細胞在測量后還可用于后繼培養(yǎng)和研究。
文檔編號G01N21/64GK101363836SQ20081007030
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日
發(fā)明者林曉鋼, 潘英俊, 郭永彩, 潮 高 申請人:重慶大學