專利名稱：一種小麥組織活性氧熒光標記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物逆境脅迫與生理響應(yīng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物組織活性氧定位及相對含量檢測的熒光標記方法，特別涉及一種小麥生長發(fā)育過程中遭受生物逆境與非生物逆境脅迫下活性氧的產(chǎn)生、產(chǎn)生部位與相對含量的標記方法。
背景技術(shù)：
植物在生長發(fā)育過程中時時遭受各種逆境以及不可避免的衰老過程，從而造成植物細胞活性氧(reactive oxygen species)代謝失調(diào)，即植物體內(nèi)活性氧如超氧物陰離子 (OH ·_)，過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(-0H)、單線態(tài)氧(1O2)等猝發(fā)；而活性氧的清除劑，如超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)、類胡蘿卜素、維生素E、維生素C等生物合成或活性水平下降，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生與清除動態(tài)平衡紊亂，活性氧積累?；钚匝醴e累對植物產(chǎn)生傷害的一個重要機制是直接或間接啟動膜脂的過氧化作用，導(dǎo)致細胞膜、類囊體片層結(jié)構(gòu)、線粒體膜、核膜等細胞膜系統(tǒng)損傷、降解，丙二醛(MDA)含量增加，葉綠素降解和光合作用酶活性下降，植物光合效率下降，植物不能維持正常的生長和發(fā)育，組織過早衰老死亡。小麥是兩年生作物，在整個生活史中要遭受冬季凍害、春季干旱、初夏熱害等自然逆境，以及病蟲害等生物逆境，同時花后灌漿過程又是一個不可避免的衰老過程。因此，檢測小麥組織活性氧產(chǎn)生部位與含量是衡量小麥抗逆性、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一個關(guān)鍵指標，是育種學(xué)家篩選優(yōu)良小麥品種的一個重要措施。以前的文獻中，對活性氧的標記一般用硝基四氮唑藍(NBT)標記超氧物陰離子(活性氧中的一種)，3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)標記H2O2活性氧中的一種)。然而，植物組織中活性氧種類繁多，其產(chǎn)生量也相差很大，因此，難以用1-2 種活性氧含量的變化說明植物的抗逆性或衰老進程。更重要的是，目前對小麥組織、特別是較大體積的材料中活性氧綜合產(chǎn)生量還沒有科學(xué)的檢測方法。2’，7’ - 二氯氫化熒光素雙乙酸酯(DCFH-DA)可以通過細胞膜進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)非特異性脂酶催化生成2’，7’ - 二氫二氯熒光黃(DCFH)，DCFH不能發(fā)出熒光。當細胞內(nèi)有活性氧存在時，DCFH可以被氧化成2’，7’- 二氯熒光黃(DCF)，在488 nm波長激光激發(fā)下發(fā)出波長530 nm左右的綠色熒光。DCF形成量與細胞氧化產(chǎn)物水平呈正比。因此， DCF熒光強度間接反映細胞內(nèi)活性氧的綜合水平(Schopfer et al.，2001)。DCFH-DA標記活性氧首先在動物細胞上應(yīng)用，在植物上的應(yīng)用還只限于如懸浮培養(yǎng)細胞、菌類、原生質(zhì)體等單個細胞或體積很小的材料，如剝離的葉片表皮層細胞。本發(fā)明應(yīng)用DCFH-DA熒光標記，首先在小麥葉片、莖桿等較大組織材料中標記活性氧的產(chǎn)生、定位及相對含量的檢測，最大限度保留細胞活性、對小麥植株內(nèi)產(chǎn)生的活性氧進行精準標記。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種小麥生長發(fā)育過程中遭受生物逆境
3與非生物逆境脅迫下活性氧的產(chǎn)生、產(chǎn)生部位與相對含量的標記方法。本發(fā)明提供了一種活性氧熒光標方法，采用DCFH-DA對小麥不同組織材料中的活性氧進行綜合標記、定位及相對含量檢測。該方法包括下述的步驟
a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取樣品標記負載緩沖液5 ml置入容積 6-10ml的器皿中；
以上的標記負載緩沖液通過如下方法配制
配制10 mM Tris-HCl或磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 7. 2-7. 5);用DMS0、醇溶液配制 DCFH-DA母液(可凍存于 20°C- 80°C條件下)，濃度為3_5 mM ;用緩沖液配制熒光標記負載液，含最終濃度為30-50 μ M的DCFH-DA、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 2-2. 8% (體積百分比)的戊二醛。b.用鋒利刀片，如剃須刀片或手術(shù)刀片，將小麥莖桿、葉片等材料切割成長度為 O. 5 cm組織塊；
c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b制得組織塊，至少漂洗兩次，然后將組織塊置于步驟a中盛有標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部，促使負載緩沖液快速進入材料內(nèi)部；
d.在25°C下避光放置20-30分鐘；
e.將步驟d中的材料放置在顯微鏡載玻片上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察、CXD圖像采集系統(tǒng)拍照，顯微鏡工作條件為激發(fā)波長為460-500 nm,發(fā)散波長為 510-560 nm。以上的醇溶液為乙醇或者是甲醇。本發(fā)明適用于O. 5 cm長、厚度小于I mm的各種植物組織材料,特別是在小麥材料上本發(fā)明已經(jīng)成功使用。本發(fā)明的有益效果在于
(1)傳統(tǒng)的DAB、NBT等對活性氧種類的標記需要2-12小時，時間較長，而本發(fā)明對活性氧的標記只需要20-30分鐘，避免了樣品長時間標記負載期間活性氧含量及部位的失真；
(2)采用本發(fā)明的方法可對較大的組織材料中活性氧綜合產(chǎn)生量進行更科學(xué)的檢測； 例如可以對厚度小于1_的植物葉片組織、壁厚小于1_的莖桿組織如小麥莖桿中的活性氧進行檢測；
(3)本發(fā)明所用樣品標記負載緩沖液含有終濃度為2.2-2. 8% (體積百分比)戊二醛，可在DCFH-DA對活性氧標記的同時，對材料進行固定，保證活性氧標記的精確性；同時，用注射器對密封后放置材料的器皿進行抽氣，使負載緩沖液快速進入材料內(nèi)部，提高固定與負載效果；
(4)本發(fā)明能對較大體積的組織材料中活性氧綜合產(chǎn)生量進行檢測，更能精準反映植物的抗逆性或衰老進程；
(5)本發(fā)明對實驗材料的前處理以及所用的器材要求簡單，易于操作。


圖I為實施例I小麥葉片組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果；圖2為實施例2小麥葉片組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果；
圖3為實施例3小麥葉片組織熒光激發(fā)后在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
來對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。實施例I
一種植物組織活性氧熒光標記方法，在營養(yǎng)脅迫(氮素缺乏)下小麥(濟麥22)莖桿組織中的應(yīng)用，具體操作如下
a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取樣品標記負載緩沖液5 ml置入容積為10 ml的器皿中；
配制10 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 2);用DMSO配制DCFH-DA母液，濃度為5 mM ;用緩沖液配制熒光標記負載液，含最終濃度為50 11|1的00 ! ^、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 5% (體積百分比)的戊二醛。b.將小麥莖桿切成長度為O. 5 cm的組織塊，并沿縱軸平均切開，一分為二 ；
c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b制得組織塊兩次，然后置于步驟a中盛有標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部；
d.在25°C下避光放置30分鐘；
e.將莖桿組織塊外側(cè)朝上放置在顯微鏡載玻片上，用熒光顯微鏡(LeicaDM 2500)觀察并用CXD圖像采集系統(tǒng)(Leica DFC 420)拍照，顯微鏡工作條件為激發(fā)波長為495 nm, 發(fā)散波長為518 nm。將最終制作的小麥莖桿組織材料用熒光激發(fā)裝置激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如附圖I所示，圖中箭頭所指為性氧產(chǎn)生部位與相對含量，高亮度部位說明活性氧含量較高，低亮度部位活性氧含量相對較低，標尺=200 Mm)。
權(quán)利要求
1.小麥組織活性氧熒光標記方法，包括下述的步驟a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取小麥組織樣品標記負載緩沖液5ml置于器皿中；以上的樣品標記負載緩沖液通過如下方法配制配制10 mM Tris-HCl或磷酸鹽PBS緩沖液，其pH 7. 2-7. 5 ；用DMS0、醇溶液配制濃度為3-5 mM DCFH-DA的母液；用緩沖液配制的熒光標記負載液，含最終濃度為30-50 μ M的DCFH-DA、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 2-2. 8%的戊二醛，其中戊二醛的濃度為體積百分比；b.用刀片將小麥莖桿、葉片材料切成長度為O.4 - O. 6cm組織塊；c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b中的組織塊，然后置于步驟a中盛有樣品標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣；d.在25°C下避光放置20-30分鐘；e.將步驟d中的材料放置在顯微鏡載玻片上，用激光激發(fā)裝置激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察CCD圖像采集系統(tǒng)拍照，顯微鏡工作條件為激發(fā)波長為460-500 nm,發(fā)散波長為 510-560 nm。
2.如權(quán)利要求I所述的小麥組織活性氧熒光標記方法，其特征在于，步驟b中所述的醇溶液為甲醇或者是乙醇中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物逆境脅迫與生理響應(yīng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小麥生長發(fā)育過程中遭受生物逆境與非生物逆境脅迫下活性氧的產(chǎn)生、產(chǎn)生部位與相對含量的標記方法。該標記方法的步驟是配制標記負載緩沖液、準備材料組織塊、負載緩沖液漂洗組織塊、在25℃下避光放置、用激光激發(fā)裝置激發(fā)，觀察并拍照。本發(fā)明的方法相對于傳統(tǒng)的DAB、NBT等對活性氧種類的標記方法節(jié)省了時間，避免了樣品長時間標記負載期間活性氧含量及部位的失真；可在DCFH-DA對活性氧標記的同時，對材料進行固定，保證活性氧標記的精確性；所用的器材要求簡單，易于操作。
文檔編號G01N1/28GK102589942SQ201210015479
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者馮波, 司紀升, 孔令安, 張賓, 李升東, 王法宏 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所