專利名稱：重組人親環(huán)素a抗體、其制備方法及elisa試劑盒以及細胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)與免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的是說一種重組人親環(huán)素A抗體、其制備方法及ELISA試劑盒以及細胞株。
背景技術(shù)：
目前已發(fā)現(xiàn)和克隆的親環(huán)素有130多種異構(gòu)體，它們構(gòu)成了Cyclophilins家族，廣泛分布于細菌、真菌、植物和哺乳動物中，在進化的過程中比較保守。親環(huán)素最初是作為環(huán)孢菌素A(CyCl0Sp0rinA，CsA)的蛋白受體被發(fā)現(xiàn)的，環(huán)孢菌素A是一種免疫抑制劑，臨床上用于治療器官移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)及自身免疫系統(tǒng)疾病，所以親環(huán)素被認為參與了免疫抑制過程。后來大量的研究表明，親環(huán)素還具有其它許多重要的生物學(xué)功能，CyPs具有 肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，催化蛋白質(zhì)折疊過程，尤其是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，同時還介導(dǎo)細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞凋亡、參與HIV-I病毒蛋白組裝，參與炎癥反應(yīng)等。人類親環(huán)素A(Cyclophilin A7CypA)基因位于7pl3,編碼的蛋白質(zhì)含165個氨基酸，相對分子質(zhì)量為18X106，主要存在胞質(zhì)內(nèi)。CyPA含一個由8條反平行β鏈構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)，7個芳香族及其他疏水殘基在桶內(nèi)形成了一個緊湊的疏水核心，該區(qū)域正是環(huán)孢素的結(jié)合部位。鑒于以上所述的親環(huán)素生物學(xué)功能，近年來，大量的研究表明，CypA與風(fēng)濕性疾病(如風(fēng)濕病)、腫瘤(如胰腺癌非小細胞癌)、炎癥(如皮膚銀屑病，結(jié)腸炎、胰腺炎)，免疫性疾病(如紅斑狼瘡)及病毒感染(如乙肝病毒感染)有密切的關(guān)系。對于CypA蛋白的檢測，免疫學(xué)方法無疑是最為方便的一種，如果用免疫學(xué)方法檢測需要首先建立檢測的方法，并制備試劑盒，試劑盒的核心組分-抗體的制備傳統(tǒng)的方法是用重組蛋白生產(chǎn)抗體，一般的流程是先培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達菌，收集并裂解誘導(dǎo)后的表達菌，帶標(biāo)簽的重組蛋白通過標(biāo)簽純化之后需要使用蛋白酶切除載體融合標(biāo)簽蛋白，不帶標(biāo)簽的重組蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)特性進行純化，如果表達蛋白在包涵體里面則包涵體純化的方法進行，蛋白純化在目前還是生物學(xué)領(lǐng)域的一打難題，需要借助很多手段綜合運用，不但如此，往往蛋白的純度和可溶性都不高，生物活性更難以保證；如果制備抗體，需要用以上純化的蛋白免疫動物實驗，最后再用這純化的蛋白作為親和配體來純化抗體。這樣做的程序繁瑣，蛋白酶的成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，并且每多一步操作，不但蛋白量損失至少20% (表2)，蛋白免疫學(xué)活性損失30%左右(表3);如果重組蛋白在包涵體中表達，重組蛋白的純化就更加困難；由于菌體中有很多種蛋白存在，使用任何方法純化，過程中都難免遇到結(jié)構(gòu)或者性質(zhì)與目標(biāo)蛋白類似的菌體蛋白，這類蛋白在純化過程中很難清除，造成純化的蛋白純度不高，有時候通過跑SDS-PAGE膠也很難看清楚，以此蛋白(作為抗原)來免疫動物并以此作為親和純化抗原配體純化得到的抗體或者篩選單克隆抗體細胞株來生產(chǎn)的抗體中必然有一部分是針對殘留在純化蛋白(抗原)中大腸桿菌菌體蛋白的，而人在生活中每天都會接觸大腸桿菌，體內(nèi)也有一些抗大腸桿菌菌體蛋白的抗體，如果以上述方法生產(chǎn)的實際盒來檢測人體標(biāo)本，毫無疑問肯定會對真實的結(jié)果引起干擾，造成試劑盒性能下降甚至是無效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決上述抗體生產(chǎn)中存在的技術(shù)問題，提供一種工藝條件簡單、特異性好、純化簡單、蛋白免疫學(xué)活性損失少、操作簡便的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法。本發(fā)明還提供一種由上述方法制得的重組人親環(huán)素A抗體。本發(fā)明還提供一種含有上述重組人親環(huán)素A抗體的重組人親環(huán)素A的ELISA試劑盒。本發(fā)明還提供一種只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，為一種雜交瘤細胞 株，命名為雜交瘤細胞株12C28，其來源種屬的拉丁文學(xué)名Mus musculus，保藏該細胞株的單名稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址是中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2012年5月7日，保藏編號為CCTCC C201259。本發(fā)明重組人CypA抗體的制備方法包括以下步驟(I)擴增人CypA編碼區(qū)基因，通過酶切位點裝入原核表達載體pET_28a，得到重組表達質(zhì)粒p28a-CypA;(2)將重組表達質(zhì)粒p28a_CypA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)CypA蛋白的表達，得到誘導(dǎo)后菌體；(3)收集并破碎誘導(dǎo)后菌體，再通過免疫實驗動物制備多克隆抗體血清，然后再通過差異性中和法去除多克隆抗體血清中的非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體，得到含有只針對CypA蛋白的多克隆特異性蛋白抗體的血清；或者收集并破碎誘導(dǎo)后菌體，再通過免疫實驗動物、免疫后動物脾臟細胞與骨髓瘤融合，得到雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞株通過差異性ELISA篩選法得到只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株(即雜交瘤細胞株12C28，保藏編號為CCTCC C201259)，陽性細胞株通過普通培養(yǎng)法得到含有只針對CypA蛋白的單克隆特異性蛋白抗體細胞上清液，或者將細胞株注入實驗動物體內(nèi)得到含有針對CypA蛋白的單克隆特異性蛋白抗體的腹水。(4)對步驟(3)中得到的含有多克隆特異性蛋白抗體的血清或單克隆特異性蛋白抗體的細胞培養(yǎng)上清液或腹水進行純化得到純化后的重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。本發(fā)明中采用了差異性中和法純化得到多克隆特異性抗體，采用差異性ELISA篩選法篩選只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，通過普通細胞培養(yǎng)法得到細胞培養(yǎng)上清液或者經(jīng)細胞株注入實驗動物體內(nèi)得到腹水，細胞培養(yǎng)上清液或腹水中含有只針對CypA蛋白蛋白的特異性抗體，經(jīng)過純化得到單克隆特異性抗體；其基本原理如下含空表達載體質(zhì)粒pET-28a和重組表達質(zhì)粒p28a-CypA的表達菌經(jīng)過培養(yǎng)誘導(dǎo)表達后，他們的蛋白表達譜的唯一差別就是重組表達質(zhì)粒的表達菌多了外源重組CypA蛋白片斷，所以只要是含有重組蛋白的物質(zhì)(不管是純化的還是非純化，不管是切了標(biāo)簽的還是未純化的在菌體中的重組蛋白)，都可以拿來免疫動物，只要后期可以有效地中和去除所有針對表達菌菌體蛋白的抗體就可以得到高品質(zhì)、特異性好的多克隆特異性抗體，或者通過有效篩選到只分泌針對CypA蛋白而非菌體蛋白的細胞株就可以生產(chǎn)單克隆特異性抗體。本發(fā)明的核心正是基于此原理建立起來的。所述步驟(I)中，CypA蛋白編碼區(qū)基因裝入原核表達載體pET_28a的具體方法先設(shè)計針對人CypA特異性引物并加裝酶切位點(上游EcoRI，下游XhoI )，從人肺cDNA文庫用PCR技術(shù)擴增人CypA編碼區(qū)基因，回收得到特異性擴增產(chǎn)物片段(回收產(chǎn)物)后，同時用EcoRI和XhoI雙酶切消化載體pET-28a和回收產(chǎn)物，將消化后的載體pET_28a和回收產(chǎn)物混合后用T4連接酶連接(連接產(chǎn)物)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過EcoRI和XhoI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到重組表達質(zhì)粒p28a-CypA。所述步驟(3)中，收集并破碎誘 導(dǎo)后菌體，利用載體上的融合6His標(biāo)簽，通過鎳親和層析柱對破碎誘導(dǎo)后菌體進行初純化，得到初純化的CypA蛋白，然后再將初純化的CypA蛋白進行后續(xù)的實驗動物免疫。初純化的目的是為了初步純化CypA蛋白，提高免疫抗原中CypA蛋白含量，進而在免疫實驗動物后能夠得到含量較高的針對CypA蛋白的抗體血清，提高多克隆抗體的產(chǎn)量或降低后續(xù)單克隆抗體篩選的難度；無論免疫實驗動物的抗原(CypA蛋白)是否進行過初純化，在篩選步驟中都可以同時去除所有多克隆抗體血清中的非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體(包括免疫實驗動物后自身產(chǎn)生的非特異性菌體蛋白抗體以及預(yù)純化過程中產(chǎn)的多克隆抗體血清中載體上的34氨基酸殘基融合蛋白體抗等各種非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體)，得到只針對CypA蛋白的多克隆特異性蛋白抗體?；蛘咄ㄟ^差異性ELISA篩選得到只分泌針對CypA蛋白而非菌體蛋白抗體的細胞株，通過細胞培養(yǎng)得到細胞上清液或者注入動物體內(nèi)產(chǎn)生的腹水中純化出單克隆特異性抗體。步驟(2)中，所述誘導(dǎo)的方法為將重組表達質(zhì)粒p28a_CypA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑取單菌落到5毫升含有100ug/mL濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C、200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至OD600達到O. 6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)7-8小時后，IOOOOg離心收集菌體，用50mmol/L，Tris-Cl, 200mmol NaCl, 200mg/L溶菌酶作為菌體用裂解液重懸，室溫反應(yīng)O. 5小時，超聲波破碎至菌液清亮，IOOOOg離心20分鐘，保留上清液得到誘導(dǎo)菌體裂解物。步驟(3)中，所述差異性中和法為用含空表達載體pET_28a的誘導(dǎo)菌裂解物中和多克隆抗體血清中非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體，優(yōu)選加入量為血清中抗體質(zhì)量的5-10倍。這里使用差異性中和法的原理為pET_28a與p28a_CypA細菌誘導(dǎo)后裂解物中蛋白譜中唯一差異就是重組CypA蛋白片段(不包括載體上的34氨基酸殘基載體融合蛋白)，而純化工藝過程中不可避免的含有微量的未知菌體蛋白，因此在下游免疫動物制備抗體中不可以避免的含有一些針對菌體未知蛋白的抗體，所以通過pET-28a細菌誘導(dǎo)后裂解物的抗體中和就可以有效去除這些相對于CypA蛋白的非特異性抗體(包括針對融合在CypA蛋白上的載體的34氨基酸殘基的抗體)，然后再通過簡單純化就可得到純化后的針對CypA蛋白的重組人親環(huán)素A的多克隆特異性抗體；步驟(3)中，所述差異性ELISA篩選法為將含重組質(zhì)粒p28a_CypA和空載體質(zhì)粒pET-28a的誘導(dǎo)菌體裂解物包被固相載體，分別與待篩選的單克隆抗體細胞株所分泌的抗體反應(yīng)，只與含重組質(zhì)粒p28a-CypA的誘導(dǎo)裂菌體解物反應(yīng)，而不與空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)裂解物反應(yīng)的細胞株確定為陽性，從而篩選得到只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，細胞株培養(yǎng)或者注入實驗動物體內(nèi)得到含有特異性針對CypA蛋白抗體的細胞上清液或者腹水。使用差異性ELISA篩選法的原理是pET_28a與p28a_CypA細菌誘導(dǎo)后裂解物唯一不同的是其蛋白表達譜中多了一個蛋白序列，pET-28a與p28a-CypA細菌誘導(dǎo)后裂解物包被酶標(biāo)板，待篩選的細胞孔上清液同時分別與其反應(yīng)，只與p28a_CypA細菌誘導(dǎo)后裂解物包被孔反應(yīng)的，也就是與CypA蛋白序列特異性反應(yīng)。通過此原理特異性篩選可以得到只針對CypA蛋白抗體的細胞株,從而可以得到細胞培養(yǎng)上清液或者腹水。步驟(4)中，所述多克隆抗體的純化方法為以CypA蛋白作為親和純化的配體，通過親和層析的方法純化含有多克隆特異性蛋白抗體的血清，得到重組CypA蛋白的特異性多克隆抗體。步驟(4)中，所述單克隆抗體的純化方法為將腹水經(jīng)二氧化硅吸附脫脂、硫酸銨沉 淀后通過葡聚糖凝膠G2tltl進一步分離得到重組人CypA蛋白的特異性單克隆抗體；或者將細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨沉淀后通過葡聚糖凝膠G2tltl進一步分離得到重組人親環(huán)素A的特異性單克隆抗體。所述免疫實驗動物的方法可以為常規(guī)的家兔或者Balb/C小鼠的免疫，具體免疫實驗方法為現(xiàn)有的常規(guī)方法。本發(fā)明重組人親環(huán)素A抗體由上述方法制得的重組人親環(huán)素A的多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明重組人親環(huán)素A的ELISA試劑盒，包括固相載體和檢測抗體，其特征在于，所述固相載體或者檢測抗體中所使用的抗體為由上述方法制得的重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。所述重組人親環(huán)素A的ELISA試劑盒可以為雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒或競爭法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備，試劑盒內(nèi)主要包括固相載體(包被有重組人親環(huán)素A的多克隆抗體或單克隆抗體)、標(biāo)準(zhǔn)品(純化的重組人親環(huán)素A蛋白)、檢測抗體(或競爭標(biāo)記物)等,本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)ELISA試劑盒的具體需要合理配制。作為試劑盒的制備，以上所制備的單克隆抗體和多克隆抗體可以作為如下例舉的組合在雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒中使用(I)多克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)多克隆抗體(包被抗體)；(2)單克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)(多克隆抗體)；(3)單克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)單克隆抗體(檢測抗體)；在競爭法人親環(huán)素A ELISA試劑盒中沒有檢測抗體，包被抗體為單克隆抗體或者多克隆抗體都可以，競爭ELISA試劑盒中的競爭標(biāo)記物為純化的人親環(huán)素A蛋白經(jīng)過生物素標(biāo)記制備而成，其余組分競爭法與雙抗體夾心法ELISA試劑盒相同。進一步的，制得的重組人親環(huán)素A的多克隆抗體或單克隆抗體還可以應(yīng)用于制備膠體金試紙條、免疫熒光、免疫比濁、化學(xué)發(fā)光等各種形式的產(chǎn)品。有益效果I.本發(fā)明方法中采用經(jīng)(或未經(jīng))初步純化的重組CypA蛋白(不需要要求太高純度也不需要切載體蛋白34氨基酸殘基)直接免疫動物而不用p28a-CypA細菌誘導(dǎo)后裂解物可以提高免疫原中有效成分的含量，激發(fā)盡可能多的B淋巴細胞，產(chǎn)生更多的抗體，從而提高后期抗體制備的產(chǎn)量或者單抗陽性細胞株篩選的幾率，同時降低了工藝難度和生產(chǎn)成本。2.所用的純化的重組CypA蛋白初步純化比較容易，作為免疫原也不需要苛刻的純度，比較容易實現(xiàn)，蛋白量及蛋白免疫學(xué)活性損失少，后期純化后蛋白純度高，回收率高(見表I)。3.本發(fā)明中生產(chǎn)的單克隆抗體或者多克隆抗體特異性好，試劑盒也具有特異性好、抗干擾性強、成本低、應(yīng)用廣泛的優(yōu)點。


圖I為本發(fā)明使用的蛋白表達載體pET_28a圖譜。圖2為構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒p28a_CypA示意圖。
圖3為從人肺cDNA文庫中通過PCR擴增出的CypA基因編碼區(qū)片段(質(zhì)量百分比1%瓊脂糖凝膠電泳圖)。圖4為含重組表達質(zhì)粒p28a-CypA的大腸桿菌BL21 (DE3)經(jīng)IMm IPTG不同誘導(dǎo)時長目的蛋白表達量對比SDS-PAGE電泳圖，注M為蛋白質(zhì)MARKER,從上到下依次分別為97kD, 66kD, 43kD, 31kD, 20kD, 14. 4kD,泳道 I, 2，3，4，5，6，7，8，9 分別代表誘導(dǎo)前，誘導(dǎo) I 小時，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，7小時，8小時。SDS-PAGE膠濃度為10%。圖5為純化后的CypA蛋白電泳圖，注M為蛋白質(zhì)MARKER,從上到下依次分別為97kD，66kD, 43kD, 31kD, 20kD,SDS-PAGE膠濃度為10%。圖6為雙抗體夾心法ELISA與競爭法ELISA檢測CypA蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖6A為雙抗體夾心ELISA試驗盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖6B為競爭法ELISA試驗盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖)。本發(fā)明只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，為一種雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株12C28，其來源種屬的拉丁文學(xué)名Mus musculus，保藏該細胞株的單名稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2012年5月7日，保藏編號為CCTCC C201259。
具體實施例方式以下實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但是不作為本發(fā)明內(nèi)容的限制。實施例I重組人親環(huán)素A蛋白重組表達、純化I. CypA基因的獲取根據(jù)Genbank已經(jīng)收錄的基因(NCBI收錄號ΝΜ_021130· 3),應(yīng)用Primerpremier5. O軟件設(shè)計一對引物,并在上游和下游引物5’端分別設(shè)計EcoRI和XhoI限制酶切位點，CypA基因通過酶切位點插入表達載體pET-28a (圖I)，并且表達的融合蛋白上含有載體上的6HIS標(biāo)簽蛋白，便于后續(xù)純化(構(gòu)建后的重組質(zhì)粒示意圖如圖2)，設(shè)計引物如下上游引物(Pl):5，GCGAATCCatggtcaaccccaccgt 3，下游引物(P2):5，GCGCTCGAGttattcgagttgtccacag3，以人肺cDNA文庫為模版，進行PCR擴增，以獲取目的基因，反應(yīng)體系如下
ddH2032.5μΙ_
10XPCR buffer5. 0μΙ_
P11·0μΙ_
P21·0μΙ_
dNTP mixture6· 0μΙ_
人肺 cDNA2. ΟμΙ
Taq聚合酶O. 5μΙ_
TotaI volume50. Ομ 加入各組分后混合均勻，PCR反應(yīng)按以下反應(yīng)條件進行94°C預(yù)變性2 min, 94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸90s，30個循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后取3PLPCR產(chǎn)物進行質(zhì)量百分比I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Axygen, AP_GX_50)從凝膠中回收目的DNA片段(操作參照產(chǎn)品說明書進行)。2.大腸桿菌DH5a和BL21 (DE3)感受態(tài)的制備 在構(gòu)建p28a_CypA和進行誘導(dǎo)表達CypA的過程中需要用到大腸桿菌DH5a和BL21 (DE3)。大腸桿菌DH5a感受態(tài)(氯化鈣法)制備具體方法如下挑取DH5a菌株在LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)后，挑取單菌落轉(zhuǎn)到IOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/min培養(yǎng)過夜；將上述培養(yǎng)液按2%接種量接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)2_3小時；將培養(yǎng)后的菌液置冰浴中IOmin后轉(zhuǎn)移到無菌的50mL離心管中，4°C 4000r/min離心IOmin,去掉上清液，向管中加入20mL無菌的預(yù)冷的O. ImoVLCaCl2溶液重新懸浮菌體，4°C 4000r/min離心10 min,去掉上清液；向管中加入2mL無菌的預(yù)冷的O. lmol/LCaCl2溶液重新懸浮菌體，即為感受態(tài)細胞；剛做的感受態(tài)細胞可直接用于轉(zhuǎn)化試驗，也可將剩余的感受態(tài)細胞加入終濃度為30%(體積比)的甘油分裝于I. 5mL離心管(ΙΟΟμ ν管)置_70°C保存?zhèn)溆?。大腸桿菌BL21 (DE3)的制備方法同大腸桿菌DH5 α。3.重組質(zhì)粒p28a_CypA的構(gòu)建將回收的DNA片斷與原核表達載體pET_28a分別用EcoRI和XhoI限制酶進行酶切，酶切后分別回收DNA片斷，按照pET-28a載體CypA DNA片斷數(shù)量=1 5-10的比例混合，加入T4連接酶，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布于LB半固體平板，37 °C培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落擴大培養(yǎng)至3毫升培養(yǎng)瓶中，收集菌液提取質(zhì)粒，通過雙酶切進行鑒定(鑒定標(biāo)準(zhǔn)酶切之后電泳顯示為兩條清晰的條帶，大小分別為約5kb和500bp )，鑒定正確的質(zhì)粒即為重組表達質(zhì)粒p28a-CypA。4.重組質(zhì)粒p28a_CypA的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達及重組質(zhì)粒p28a_CypA表達條件的優(yōu)化。
重組表達質(zhì)粒p28a_CypA轉(zhuǎn)化表達菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落，接種于100毫升LB(含50ug/mL卡那霉素)，37°C 200rpm培養(yǎng)之0D600為O. 6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)目的蛋白的表達，每隔I小時取樣，將以上每次所取樣品連同誘導(dǎo)前的樣品，10，OOOg離心收集菌體即為誘導(dǎo)后菌體，采用裂解液(50mmol/L Tris-Cl, 200mmol/L NaCl, 200mg/L溶菌酶)重懸，室溫反應(yīng)O. 5小時，超聲波破碎至菌液清亮，得到誘導(dǎo)后菌體裂解物，菌體裂解物10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液進行10% SDS-PAGE電泳，通過不同誘導(dǎo)時間的CypA表達量比對，得到CypA蛋白最佳誘導(dǎo)時間為7 — 8小時(圖4)。重組CypA蛋白的初純化按照以上已優(yōu)化的條件大量培養(yǎng)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒p28a_CypA菌的表達，收集菌體并通過超聲波破碎，離心后上清液通過鎳親和層析瓊脂糖凝膠(GE healthcare,17-5318-01)進行純化(操作方法參照產(chǎn)品使用手冊)，如果沉淀過多，則用尿素溶解沉淀后取上清通過鎳親和層析瓊脂糖凝膠純化目的蛋白，得到初純化的CypA蛋白，所有步驟 參照產(chǎn)品使用手冊嚴格執(zhí)行，純化后得到的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分析純度(如圖5)，從SDS-PAGE膠上有很少量的菌體蛋白雜帶。實施例2.重組人親環(huán)素A蛋白抗體(單克隆或多克隆特異性蛋白抗體)的制備將初純化的CypA蛋白進行動物免疫及免疫效果檢測，方法如下動物免疫選擇適齡的健康雄性動物進行免疫，小鼠的首次免疫劑量為50 μ g 400 μ g/次，大鼠為IOOyg I OOOyg /次，兔為200μ8 I OOOyg/次，采用多點皮下注射方法，每間隔3周，進行加強免疫，劑量為首免的一半，每次免疫前耳靜脈取血監(jiān)測抗體效價，直到血清抗體ELISA效價達到I :1，000，000以上。免疫佐劑為佛氏佐劑，首免用佛氏完全佐齊U，以后用佛氏不完全佐劑，每次免疫前將完全抗原與佐劑按照同體積混合后通過超聲波乳化。本實施例以家兔為免疫動物制備多克隆抗體，以BalB/C小鼠為例制備單克隆抗體。(I)多克隆抗體的制備(差異性中和法)家兔的免疫按上述動物免疫方法進行，得到滿足效價要求的血清抗體(重組人親環(huán)素A蛋白)用包被稀釋液稀釋到I μ g/mL, 100 μ L/孔，包被于96孔酶標(biāo)板中，4 °C過夜；拍干板孔中的液體，封閉液(含1%羊血清的O. 01mol/L TBS (pH8. 5)，150 μ L/孔，室溫封閉4小時；用TBS/Tween-20 (含體積比O. 05% Tween-20)洗板后，待檢血清與未免疫動物空白血清平行從I : 1,000倍比稀釋后，100 μ L/孔，37°C孵育60分鐘；用TBS/Tween_20(0. 05%)洗板后，將HRP標(biāo)記羊抗兔(I :1，000稀釋，武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn))，100 μ L/孔加入，37°C孵育45分鐘后，TBS/Tween-20 (含體積比0.05% Tween-20)洗板3次后，加入即用型3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液(武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn))，室溫反應(yīng)10分鐘，每孔加100 μ L顯色終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值(0D 45(|)。待檢血清某個稀釋度的450 nm吸光值是空白血清的3倍時，該稀釋度定義為該抗體的ELISA效價。當(dāng)完全抗原免疫的動物血清效價達到實驗要求后，分別采用頸動物放血，收集全血，37°C放置I小時后，4°C過夜，離心分離血清；血清中加入質(zhì)量百分比O. 01%疊氮化鈉，_20°C保存?zhèn)溆?，得到含有只針對CypA蛋白的多克隆特異性蛋白抗體的血清。(2)單克隆抗體制備
BALB/c小鼠的免疫按上述動物免疫方法進行，首免和二免后一個星期分別用斷尾抽真空法采血200 μ L進行抗體檢測，二免采血后讓小鼠休息兩周進行加強免疫，三天后融合。注免疫劑量以載體蛋白的質(zhì)量計算，IOOug/只/次。。①瘤細胞的準(zhǔn)備融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細胞并培養(yǎng)(培養(yǎng)方法參照ATCC提供的方法)，在融合前天將細胞調(diào)整到合適濃度，融合是細胞處于80%長滿，大小均勻
透亮為宜。②飼養(yǎng)細胞的制備制備飼養(yǎng)細胞，采用Balb/c小鼠的腹腔巨噬細胞和脾細胞的混合細胞作為飼養(yǎng)細胞，其制備步驟如下脫頸椎處死空白Balb/c小鼠I只，用75% (體積比)的酒精浸泡5min。在無菌超 凈臺上仰面固定好小鼠，剪開腹部皮毛并撕分開固定至兩側(cè)，露出胸腹；鑷子提起腹膜，注射器針頭刺破腹膜注入2. 5mLRPMI 一 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹吸多次，最后將腹腔液體吸回注射器，4000rpm離心5分鐘，RPMI 一 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸即為腹腔巨噬細胞。剪開腹膜，打開腹腔，取出脾臟，去除脂肪和筋膜，勻漿器加5 mLRPMI 一 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液研磨脾臟至均勻糊狀，稍微靜置吸取上部細胞懸液裝入離心管，加入IOmLRPMI 一 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，4000rpm離心5分鐘，如此重復(fù)洗滌3次。③免疫脾細胞的制備 免疫脾細胞的制備與飼養(yǎng)細胞制備中的脾細胞制備完全相同。④細胞融合將免疫脾細胞和SP 2/0骨髓瘤細胞按照1:3-10的數(shù)量比混合搖勻，4000rpm離心5分鐘，倒掉上清，細胞沉淀放在振蕩器上震蕩2分鐘，細胞混合物變成粘稠糊狀之后，緩慢均勻的加入ImL的50% PEG1450融合劑，邊加邊攪動使細胞糊狀始終保持均勻，無塊狀團狀，I分鐘內(nèi)加完后靜置90秒，立即用50mL RPMI — 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液均勻稀釋，邊加邊攪動，始終保證細胞糊均勻，加完后離心再加入50mLRPMI — 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液離心洗滌兩次。融合后的細胞與適量的飼養(yǎng)細胞混合，用含質(zhì)量體積比1%HAT的RPMI — 1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將其分鐘于96孔細胞培養(yǎng)板，沒孔lOOuL，CO2培養(yǎng)箱溫度調(diào)到37°C，5%的CO2濃度。4-7天后可以在培養(yǎng)板孔中看到細胞集落，第7天補加IOOuL含質(zhì)量體積比1%HT的RPMI - 1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞液變黃可以開始檢測。⑤篩選方法的建立本發(fā)明采用差異性ELISA篩選方法對有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)孔進行篩選含重組質(zhì)粒p28a-CypA與空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)后菌體裂解物分別包被固相載體,通過間接ELISA法，篩選與含重組質(zhì)粒p28a-CypA裂解物包被板孔，而不與空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)裂解物包被物板孔反應(yīng)的細胞孔，確定為陽性孔，步驟如下A.包被含重組質(zhì)粒p28a_CypA與空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)裂解物分別作為包被物，以lmg/mL的濃度用碳酸鹽(PH9. 6)包被酶標(biāo)板過夜(以下分別簡稱p28a_CypA孔和pET-28a 孔)；B.封閉倒掉剩余包被物，拍干酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板內(nèi)加入封閉液(含質(zhì)量體積比1%BSA的O. Olmmol/L TBS pH8. 5)，室溫封閉3小時；封閉完成后加入ELISA洗滌液，每孔200 μ L，3 — 5min后倒掉，拍干，如此重復(fù)三次。C.加培養(yǎng)上清僅對有集落的孔進行檢測，每孔取樣兩次，每次50 μ L，分別加到p28a-CypaA孔和pET_28a孔內(nèi)，加完后，在桌面上水平地輕輕晃動酶標(biāo)板使之混勻，37°C溫箱放置Ih后，洗板三次。同時設(shè)陰性血清和陽性血清對照(I 5000加樣)。D.加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG :工作濃度I : 10000，每孔100 μ L，37°C溫箱放置30min后，洗板四次。E.洗板3次后，加入即用型3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液(武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn))，室溫反應(yīng)10分鐘，每孔加100 μ L顯色終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值(OD45tl )。F.結(jié)果判定根據(jù)同一樣品0Dp28a_CypAa/0DpET_28aa來加以判斷，選擇 0Dp28a-CypA 孔 I
0DpET_28a值最大的3-5孔通過有限稀釋法再次克隆，選取只有單個克隆的細胞孔重復(fù)以上的ELISA篩選步驟，得到可穩(wěn)定的分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株(即雜交瘤細胞株12C28，保藏編號為CCTCC C201259，保藏日期為2012年5月7日)，采用間接ELISA法鑒定分泌的抗體亞型為IgG2a型?？贵w亞型的鑒定參照常規(guī)通用的間接ELISA法方法進行，本實施例不做贅述。⑥小鼠腹水法生產(chǎn)單克隆抗體本實施例采用滅菌液體石蠟預(yù)處理BALB/c小鼠后，再注射雜交瘤細胞的方法生產(chǎn)腹水，其具體過程如下用滅菌的液體石蠟處理小鼠，腹腔注射O. 5mL/只，十天后即可注射雜交瘤細胞，用RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成I 一 5 X IO6個/毫升，腹腔注射小鼠O. 5mL/只，8天左右觀察到小鼠腹部隆起，即可采集腹水(含有針對CypA蛋白的單克隆特異性蛋白抗體的腹水)。⑦培養(yǎng)細胞法生產(chǎn)單克隆抗體按照常規(guī)細胞培養(yǎng)法進行，本實施例不做贅述。實施例3抗體的純化I、多克隆抗體的純化將親和純化的CypA蛋白過量藕聯(lián)到瓊脂糖凝膠4B(GE Healthcare, 17-0430-01)上制備親和層析介質(zhì)，層析介質(zhì)裝配成層析柱，將上述實施例2中分離的多克隆抗體血清中通過親和層析的方法提取針對該CypA蛋白抗原的特異性抗體，藕聯(lián)方法與親和層析純化方法參照該瓊脂糖凝膠4B的產(chǎn)品說明書進行，得到重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體。2、單克隆抗體的純化A.用二氧化硅吸附法對腹水進行預(yù)處理取一定量的腹水，加等體積的巴比妥緩沖液，加適量二氧化娃粉末，室溫下，攪拌30 min, 1800 r/min,離心20 min,即得澄清的腹水。B.用50%的飽和硫酸銨(按最終飽和度算)粗提一次，33%的飽和硫酸銨粗提兩次，用1/2腹水體積的PBS將單抗溶解，裝入透析袋，用PBS透析兩天，用小青霉素瓶分裝，每瓶2 mL，凍干，一 20°C保存。使用時用2 mL蒸餾水溶解，再加等體積甘油，混勻后，一 20°C保存。
C葡聚糖凝膠G2tltl純化單抗將葡聚糖凝膠G2tltl用PBS于4°C浸泡三天，裝柱，將粗提的單抗取ImL上樣，用PBS洗脫，20%磺基水楊酸檢測，出現(xiàn)白色渾濁后開始收集，渾濁度較低時停止收集。用小青霉素瓶分裝成每瓶2 mL，凍干，一 20°C保存。使用時用ImL蒸餾水溶解，再加ImL甘油，混勻后，一 20°C保存，得到重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體。實施例4、人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備作為試劑盒的制備，以上所制備的單克隆抗體和多克隆抗體可以作為如下組合在雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒中使用(I)多克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)多克隆抗體(包被抗體);(2)單克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)(多克隆抗體)；(3)單克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)單克隆抗體(檢測抗體);在競爭法人親環(huán)素A ELISA試劑盒中沒有檢測抗體，包被抗體為單克隆抗體或者多克隆抗體都可以，競爭ELISA試劑盒中的競爭標(biāo)記物為純化的人親環(huán)素A蛋白經(jīng)過生物素標(biāo)記制備而成，其余組分競爭法與雙抗體夾心法ELISA試劑盒相同。
I.雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備本實施例采用單克隆抗體(包被抗體)對應(yīng)(多克隆抗體)為例來進行說明雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備。固相載體制備將純化得到的單克隆特異性抗體包被固相載體(ELISA板)，包被方法抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液(PH9. 6)稀釋到I μ g/mL, 100 μ L/孔，包被于96孔酶標(biāo)板中，4 °C過夜；拍干板孔中的液體，封閉液(含質(zhì)量體積比1% BSA的O. Olmmol/L TBS ρΗ8· 5)，150 μ L/孔，室溫封閉4小時；排干后孔中液體，自然晾干，鋁箔袋真空密封包裝，-20°C保存，裝盒備用。標(biāo)準(zhǔn)品的制備純化的人CypA蛋白測定濃度后分裝成Iug/支,真空凍干,備用。檢測抗體的制備將純化得到的多克隆特異性抗體標(biāo)記生物素，制備成檢測抗體(標(biāo)記方法參照Sigma B2643產(chǎn)品說明書)。樣品稀釋液含1%BSA (質(zhì)量體積比)，O. Olmmol/L TBS ρΗ8· 5檢測抗體稀釋液含1%BSA (質(zhì)量體積比)，1%PEG4000 (質(zhì)量體積比)0. 01mmol/LTBS ρΗ8· 5濃洗滌液0.25mmol/L TBS pH8. 5試劑盒組裝本試劑盒包括固相載體(包被有抗體單克隆特異性抗體的96孔酶標(biāo)板)I塊、標(biāo)準(zhǔn)品(純化的人CypA蛋白的凍干品，Iug/支，臨用前用去離子水稀釋到I毫升，然后樣品稀釋液作連續(xù)倍比稀釋)2支、檢測抗體(生物素標(biāo)記的多克隆特異性抗體120 μ L，臨用前用檢測抗體稀釋液稀釋100倍即為檢測抗體工作液)I支，鏈霉親和素酶標(biāo)記復(fù)合物(120 μ L，武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn)，臨用前用檢測抗體稀釋液稀釋100倍即為鏈霉親和素酶標(biāo)記復(fù)合物工作液)I支，即用型3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液(12mL，武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn))I支，顯色終止液(10 mL 2M H2SO4) I支，樣品稀釋液(20ml)l支，檢測抗體稀釋液(IOml)I支，濃洗滌液(30ml，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍)I瓶，酶標(biāo)板覆膜5張，使用說明書I份。2.競爭法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備本實施例采用單克隆抗體作為包被抗體進行說明。競爭法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的制備方法與雙抗體夾心法不同點就是“檢測抗體的制備”改為“競爭標(biāo)記物的制備”，具體方法如下將純化得到的CypA蛋白通過生物素標(biāo)記，制備成競爭標(biāo)記物(標(biāo)記方法參照Sigma B2643產(chǎn)品說明書)，其余與夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒相同。試劑盒組裝競爭法ELISA試劑盒中無生物素標(biāo)記的檢測抗體，將該對應(yīng)的組分改為競爭標(biāo)記物，其余同雙抗體夾心法人親環(huán)素A ELISA試劑盒的組裝。 實施例5人親環(huán)素A的檢測將純化的人親環(huán)素A蛋白加入空白血清中，通過以上 兩種不同檢測方法的試劑盒(競爭法ELISA試劑盒與雙抗體夾心法ELISA試劑盒)檢測含量，計算回收率(結(jié)果見表I )。實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37°C溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。夾心法ELISA試劑盒操作按照如下程序進行I、加樣分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液IOOyL,標(biāo)準(zhǔn)孔加稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品100 μ L/孔，待測樣品孔加待測樣品100 μ L/孔，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37°C溫育2小時。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測抗體工作液IOOyL (臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37°C溫育I小時。2、棄去液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘。每孔加鏈霉親和素酶標(biāo)記復(fù)合物工作液100μ L，酶標(biāo)板加上覆膜，37°C溫育I小時。3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 μ L /每孔，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。4、每孔加3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液90 μ L，酶標(biāo)板加上覆膜37°C避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3_4孔梯度不明顯時，即可終止)。5、每孔加顯色終止溶液50 μ L，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與顯色液的加入順序相同。6、立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度值(OD45tl值)。7、得到的原始數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標(biāo)，OD45tl為縱坐標(biāo)通過曲線專家I. 4 (curveexpert I. 4)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖6A為雙抗體夾心法ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖6B為競爭法ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線)。競爭法ELISA試劑盒第一步按如下程序進行，其余步驟同夾心法ELISA試劑盒I、加樣分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?0yL，標(biāo)準(zhǔn)孔加稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μ L/孔，待測樣品孔加待測樣品50 μ L/孔，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，立即分別在每空加入50 μ L稀釋好的競爭標(biāo)記物工作液，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37°c溫育45分鐘。表I.利用ELISA試劑盒檢測人空白血清中CypA蛋白的回收率
權(quán)利要求
1.一種重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，包括以下步驟 (1)擴增人親環(huán)素A編碼區(qū)基因，通過酶切位點裝入原核表達載體pET-28a，得到重組表達質(zhì)粒p28a-CypA; (2)將重組表達質(zhì)粒p28a-CypA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)CypA蛋白的表達，得到誘導(dǎo)后菌體； (3)收集并破碎誘導(dǎo)后菌體，再通過免疫實驗動物制備多克隆抗體血清，然后再通過差異性中和法去除多克隆抗體血清中的非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體，得到含有只針對CypA蛋白的多克隆特異性蛋白抗體的血清； 或者收集并破碎誘導(dǎo)后菌體，再通過免疫實驗動物，免疫后動物脾臟細胞與骨髓瘤融合，得到雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞株通過差異性ELISA篩選法得到只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，陽性細胞株通過普通培養(yǎng)法得到含有只針對CypA蛋白的單克隆特異性蛋白抗體細胞上清，或者將細胞株注入實驗動物體內(nèi)得到含有針對CypA蛋白的單克隆特異性蛋白抗體的腹水； (4)對步驟(3)中得到的含有多克隆特異性蛋白抗體的血清或單克隆特異性蛋白抗體的細胞培養(yǎng)上清液或腹水進行純化得到純化后的重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，收集并破碎誘導(dǎo)后菌體，利用載體上的融合6His標(biāo)簽，通過鎳親和層析柱對破碎誘導(dǎo)后菌體進行初純化，得到初純化的CypA蛋白，然后再將初純化的CypA蛋白進行后續(xù)的實驗動物免疫。
3.如權(quán)利要求I或2所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述誘導(dǎo)的方法為將重組表達質(zhì)粒p28a-CypA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落到5毫升含有100ug/mL濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C、200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D_達到·O.6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導(dǎo)7 — 8小時后，IOOOOg離心收集菌體，用50mMTris-Cl, 200mM NaCl, 200mg/L溶菌酶作為菌體用裂解液重懸，室溫反應(yīng)O. 5小時，超聲波破碎至菌液清亮，IOOOOg離心20分鐘，保留上清液得到誘導(dǎo)菌體裂解物。
4.如權(quán)利要求I或2所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述差異性中和法為用含空表達載體pET-28a的誘導(dǎo)菌裂解物中和去除多克隆抗體血清中非針對CypA蛋白的非特異性蛋白抗體。
5.如權(quán)利要求I或2所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述差異性ELISA篩選法為將含重組質(zhì)粒p28a-CypA和空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)裂解物包被固相載體，分別與待篩選的單克隆抗體細胞株分泌的抗體反應(yīng)，只與含重組質(zhì)粒p28a-CypA的誘導(dǎo)裂解物反應(yīng)，而不與空載體質(zhì)粒pET_28a的誘導(dǎo)裂解物反應(yīng)的細胞株確定為陽性，從而篩選得到只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株。
6.如權(quán)利要求I或2所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述多克隆抗體的純化方法為以CypA蛋白作為親和純化的配體，通過親和層析的方法純化含有多克隆特異性蛋白抗體的血清，得到重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體。
7.如權(quán)利要求I或2所述的重組人親環(huán)素A抗體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述單克隆抗體的純化方法為將腹水經(jīng)二氧化硅吸附脫脂、硫酸銨沉淀后通過葡聚糖凝膠G200進一步分離得到重組人親環(huán)素A的特異性單克隆抗體；或者將細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨沉淀后通過葡聚糖凝膠G2tltl進一步分離得到重組人親環(huán)素A的特異性單克隆抗體。
8.—種重組人親環(huán)素A抗體，其特征在于，為由權(quán)利要求I 一 7的任一方法制得的重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。
9.一種重組人親環(huán)素A的ELISA試劑盒，包括固相載體和檢測抗體，其特征在于，所述固相載體或者檢測抗體中所使用的抗體為由權(quán)利要求I 一 7任一項方法制得的重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。
10.一種只分泌針對CypA蛋白抗體的陽性細胞株，其特征在于，為一種雜交瘤細胞株，其保藏編號為CCTCC C201259。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人親環(huán)素A抗體、其制備方法及ELISA試劑盒以及細胞株，解決了現(xiàn)有重組人親環(huán)素A抗體制備過程中工藝條件復(fù)雜、特異性差、蛋白免疫學(xué)活性損失大的問題。通過將得到的誘導(dǎo)后菌體經(jīng)或不經(jīng)預(yù)純化直接免疫實驗動物，再經(jīng)過篩選、純化得到重組人親環(huán)素A的特異性多克隆抗體或特異性單克隆抗體。本發(fā)明重組人親環(huán)素A抗體由上述方法制得，本發(fā)明ELISA試劑盒中的固相載體和檢測抗體含有上述抗體。本發(fā)明具有工藝條件簡單、特異性好、純化簡單、蛋白免疫學(xué)活性損失少、操作簡便的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102702357SQ20121015145
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者萬慧丹, 代騰飛, 李學(xué)斌, 杜蓉, 費小戰(zhàn), 陳琰 申請人:武漢伊艾博科技有限公司