一種篩選鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選方法，包括以下步驟：(1)鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：通過實驗確定鈣激活中性蛋白酶-1最適反應濃度；(2)陽性藥驗證模型可靠性：配制不同濃度的陽性藥，每孔加入5ul；配制2×底物試劑，加樣前加入一定量的Cac12，每孔加入10ul；配制一定量最佳濃度的蛋白酶，每孔加入5ul；室溫反應20分鐘后檢測化學發(fā)光，得到不同濃度陽性藥所對應的抑制率，使用作圖軟件求算半數(shù)抑制率IC50。本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化學發(fā)光Calpain-1底物，在緩沖體系中對Calpain-1和熒光素酶活性進行優(yōu)化。加入Calpin-Glo試劑后Calpain-1剪切底物，產(chǎn)生輝光型化學發(fā)光信號。在這個均相的酶聯(lián)反應體系中，化學發(fā)光信號值與酶的活性成比例變化。該方法簡便快捷；化學發(fā)光信號強，靈敏度高；分析結果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
【專利說明】一種篩選鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學領域，利用化學發(fā)光檢測技術，構建了鈣激活中性蛋白 酶-l(calpain-l)抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對鈣激活中性蛋白酶-1活性的 高通量檢測。

【背景技術】
[0002] Calpain-1是鈣激活的半胱氨酸蛋白酶家族成員，參與一大類的蛋白質的剪切過 程。通過催化蛋白水解作用調節(jié)底物蛋白活性，Calpain-1在鈣離子信號轉導過程中起重 要作用。Calpain-1參與在許多鈣調節(jié)的細胞生理過程中：細胞運動，細胞周期，細胞增殖、 凋亡、壞死、分化，膜融合和血小板的激活。Calpain-1還參與許多病例過程，是重要的治療 靶位點。諸如心肌梗塞，中風和腦外傷引起的鈣離子穩(wěn)態(tài)破壞導致的Calpain活性失調會 造成組織破壞。
[0003] 本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化學發(fā)光Calpain-1底物，在緩沖體系中 對Calpain-1和熒光素酶活性進行優(yōu)化。加入Calpin-Glo試劑后Calpain-1剪切底物，產(chǎn) 生輝光型化學發(fā)光信號。在這個均相的酶聯(lián)反應體系中，化學發(fā)光信號值與酶的活性成比 例變化。該方法靈敏度高，簡便快捷，重復性好，適用于高通量篩選。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于建立一種化學發(fā)光的鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選 模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0005] 本發(fā)明的技術方案：采用化學發(fā)光方法建立體外鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高 通量篩選模型，初篩，復篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制鈣激活中性蛋白酶-1活性的候選化合物。具 體步驟如下：
[0006] 本發(fā)明利用化學發(fā)光的方法建立了一種鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選 模型。
[0007] 步驟一：鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0008] 步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0009] 步驟三：高通量篩選模型驗證。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0010] 圖1:鈣激活中性蛋白酶-1的最適濃度優(yōu)化實驗結果。（n=3,
[0011] 圖2:陽性藥對鈣激活中性蛋白酶-1的抑制曲線圖。（n=3,[迅；
[0012] 圖3 :高通量篩選Z'值分布。

【具體實施方式】
[0013] 以下結合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】：
[0014] 1.鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑篩選方法建立
[0015] ⑴實驗材料
[0016] 緩沖液（Promega，USA)、底物（Promega，USA)、檢測試劑（Promega，USA)丐激活中 性蛋白酶 _l，P〇rcineErythrocytes(Sigma-aldrich，USA)、氯化f丐，DMSO(Sigma-aldrich， USA)
[0017] 1)確定鈣激活中性蛋白酶-1的最適濃度
[0018] a.配制不同濃度梯度的蛋白酶，每孔加入5ill。
[0019] b.配制2X底物試劑，室溫平衡30分鐘，加樣前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 u 1〇
[0020] c.配制實驗所耐受濃度的DMS0溶液，每孔加入5ii1，使最終反應體系為20ii1。
[0021] d?室溫反應20分鐘后檢測化學發(fā)光。
[0022] e.對結果進行處理，在蛋白酶濃度-信號曲線的線性范圍內取最佳的蛋白酶濃度 作為后續(xù)實驗的條件。
[0023] 2)陽性藥特征曲線
[0024] a.配制不同濃度的陽性藥，每孔加入5ill。
[0025] b.配制2X底物試劑，加樣前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。
[0026] c.配制一定量最佳濃度的蛋白酶，每孔加入5ii1。
[0027] d?室溫反應20分鐘后檢測化學發(fā)光。
[0028] 2?數(shù)據(jù)處理
[0029] (1)根據(jù)公式計算各孔的相對抑制率
[0030]

【權利要求】
1. 一種鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 蛋白酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶為鈣激活中性蛋白酶-1。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中進行確定鈣激活中性蛋白酶-1 的最適濃度實驗。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，配制不同濃度梯度的蛋白酶，每 孔加入5 ill ;配制2 X底物試劑，室溫平衡30分鐘，加樣前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 U 1 ;配制實驗所耐受濃度的DMSO溶液，每孔加入5 y 1，使最終反應體系為20 ii 1 ;室溫 反應20分鐘后檢測化學發(fā)光，可得到最佳反應所需的鈣激活中性蛋白酶-1濃度為50nM。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)選用步驟（1)所到的合適濃度的 鈣激活中性蛋白酶-1，然后配制不同濃度的陽性藥，每孔加入5iU ;配制2X底物試劑，力口 樣前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。配制一定量最佳濃度的蛋白酶，每孔加入5iil ; 室溫反應20分鐘后檢測化學發(fā)光。數(shù)據(jù)處理，得出陽性藥的IC5Q為113. 5nM。
6. 權利要求1-5中所述任一所述的方法在篩選鈣激活中性蛋白酶-1抑制劑的應用。
【文檔編號】G01N21/76GK104458709SQ201310421022
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】嚴明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學