一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法采用溶解了蘇丹黑B的樹(shù)脂溶液作為染色包埋液來(lái)滲透包埋熒光生物樣品。該方法所得生物樣品在保持熒光信號(hào)強(qiáng)度的前提下，背景熒光大大降低。本方法能適用于厘米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用于連續(xù)超薄切片。本發(fā)明方法成本低廉，操作步驟簡(jiǎn)單，適合在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
【專利說(shuō)明】一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代生物學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)是理解跨度范圍從細(xì)胞到組織到器官甚至到完整生物體的結(jié)構(gòu)和功能。傳統(tǒng)的落射式熒光顯微成像由于景深和背景熒光的影響，只能對(duì)幾十微米的薄切片進(jìn)行成像。將這種塊面成像方法與連續(xù)機(jī)械薄切片結(jié)合起來(lái)，能成功地對(duì)厘米級(jí)大尺寸生物樣品進(jìn)行快速三維成像。通常，為了保證生物樣品能進(jìn)行連續(xù)薄切片，需要采用樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行包埋。然而，該技術(shù)雖然解決了成像景深的問(wèn)題，但仍然存在背景熒光干擾的問(wèn)題。大尺寸生物樣品存在組織自發(fā)熒光和焦面外的信號(hào)熒光導(dǎo)致的背景熒光干擾，而在樣品包埋的過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步提高背景熒光。這種強(qiáng)烈的背景熒光干擾往往使得焦面上的細(xì)節(jié)信息被湮沒(méi)。因此，發(fā)明一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法具有非常重要的意義。
[0003]目前，有研究者通過(guò)在樹(shù)脂中摻入不透明劑的方法減少樹(shù)脂包埋樣本的背景熒光，如文獻(xiàn)“Surface Imaging Microscopy, an Automated Method for Visualizing WholeEmbryo Samples in Three Dimensions at High Resolution.(Ewald, A.J., H.McBride, M.Reddington, S.E.Fraser, and R.Kerschmann.Developmental Dynamics225, n0.3(Nov2002):369-75.) ”。但是該方法目前仍未能應(yīng)用到熒光蛋白(GFP及其衍生物，XFPs)標(biāo)記的生物樣品中。熒光蛋白自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其穩(wěn)定的熒光發(fā)射、不具有物種專一性、易于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，已作為標(biāo)記物廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。利用XFPs標(biāo)記技術(shù)，能特異性標(biāo)記各種細(xì)胞，對(duì)研究生物體的結(jié)構(gòu)和功能具有重大意義。但是一些極端的理化條件，如高溫、強(qiáng)氧化還原劑、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等，均會(huì)導(dǎo)致XFPs的熒光強(qiáng)度降低甚至淬滅。因此該文獻(xiàn)也指出，如何將其方法應(yīng)用到表達(dá)熒光蛋白的樣本上是未來(lái)的技術(shù)挑戰(zhàn)之一。
[0004]鑒于此，發(fā)明一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，將其應(yīng)用到厘米尺寸的熒光生物樣品上，特別地，可應(yīng)用到熒光蛋白標(biāo)記的生物樣品上，具有重大意義和巨大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為解決上述問(wèn)題而提供了一種生物樣品在保持熒光信號(hào)強(qiáng)度的前提下，背景熒光大大降低的方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，包括以下步驟:
[0008](I)將生物樣品用冰水預(yù)冷卻的質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛溶液固定6?24h ;
[0009](2)將步驟(I)得到的生物樣品用冰水預(yù)冷卻的濃度為0.01mol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其間更換新鮮漂洗液3?5次；
[0010](3)將步驟(2)得到的生物樣品依次放入冰水預(yù)冷卻的質(zhì)量百分比為50%、70%和95%的乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水，每次15min?2h ；
[0011](4)將步驟(3)得到的生物樣品依次放入質(zhì)量百分比為70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中進(jìn)行梯度滲透，每個(gè)梯度I?3h，隨后再次放入新鮮的質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液中滲透6?12h ;
[0012](5)將步驟(4)得到的生物樣品放入蘇丹黑B染色包埋液中滲透I?4天；
[0013](6)將步驟(5)得到的生物樣品放入包埋模具中，包埋模具中充滿蘇丹黑B染色包埋液，然后在45?50 °C下隔氧聚合12?60h。
[0014]進(jìn)一步地，所述步驟(4)中質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液由質(zhì)量百分比為67%的GMA單體，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配制而成。
[0015]進(jìn)一步地，所述步驟(5)和(6)中的蘇丹黑B染色液包埋液是由預(yù)聚GMA水溶性包埋液溶解的濃度為0.5?5w/w%。(g/kg)的蘇丹黑B溶液配制而成。
[0016]進(jìn)一步地，所述預(yù)聚GMA水溶性包埋液是取質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90?95°C時(shí)迅速放入冰水浴中，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0017]更進(jìn)一步地，為加強(qiáng)染色效果，可以向所述步驟(3)中的質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液以及步驟(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入蘇丹黑B，配制成0.5?5w/w%。的染色液。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟(6)中的隔氧聚合是采用的包埋模具具有隔氧功能或采用具有抽真空功能的烘箱。
[0019]進(jìn)一步地，所述步驟(I)中生物樣品的尺寸不超過(guò)2厘米見(jiàn)方。
[0020]優(yōu)選地，所述生物樣品可以為任何發(fā)射熒光的動(dòng)物組織。
[0021]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0022]本發(fā)明是采用一種溶解了光吸收劑的樹(shù)脂作為染色包埋液滲透、包埋生物樣品，所得樣品為背景熒光被抑制的能應(yīng)用于超薄切片的生物樣品。該方法所得生物樣品在保持熒光信號(hào)強(qiáng)度的前提下，背景熒光大大降低。本方法能適用于厘米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用于連續(xù)超薄切片。本發(fā)明方法成本低廉，操作步驟簡(jiǎn)單，適合在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。同時(shí)所得包埋的生物樣品能應(yīng)用于塊面成像結(jié)合連續(xù)薄切片的技術(shù)上，可用于快速獲取熒光蛋白標(biāo)記組織的高分辨三維熒光分布，繼而進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1采用傳統(tǒng)樹(shù)脂包埋方法制備的成年Thyl-GFP-M小鼠全腦樣本的塊面熒光成像結(jié)果圖；
[0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1采用弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法制備的成年Thyl-GFP-M小鼠全腦樣本的塊面熒光成像結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]本實(shí)施例提供了一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，包括以下步驟:
[0028](I)成年的Thyl-GFP-M line轉(zhuǎn)基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，通過(guò)心臟左心室灌注37°C的0.01mol/L PBS溶液3分鐘，待血液沖洗干凈后，立即灌注冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液，并持續(xù)I小時(shí)。然后，取出小鼠全腦，再次放入冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液中后固定24小時(shí)。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為0.0lmol/L PBS。
[0029](2)固定結(jié)束后，將全腦樣本放入冰水預(yù)冷卻的0.0lmol/L PBS中漂洗24小時(shí)，其間更換新液5次，以徹底清洗掉殘余的多聚甲醛固定液。
[0030](3)接著，將全腦樣本依次放入冰水預(yù)冷卻的50%、70%和95%乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水，每次2小時(shí)。
[0031](4)脫水結(jié)束后，將全腦樣本依次放入質(zhì)量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中進(jìn)行梯度滲透，每個(gè)梯度3小時(shí)，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶劑為95%乙醇。隨后再次放入新鮮的100%GMA水溶性包埋液中滲透12小時(shí)，最后放入預(yù)聚GMA水溶性包埋液配制的3%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透4天。所有滲透液都先用冰水浴預(yù)冷卻。100%GMA水溶性包埋液由質(zhì)量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配制而成。預(yù)聚GMA水溶性包埋液的配制方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90°C時(shí)迅速放入冰水浴中，并大力搖動(dòng)，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0032](5)將小鼠全腦放入凝膠將囊中，加入預(yù)聚GMA水溶性包埋液配制的3%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然后蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然后一起放入50°C烘箱中聚合60小時(shí)，得到所需的背景熒光顯著降低的全腦包埋樣本。
[0033]對(duì)所得全腦樣本進(jìn)行GFP熒光塊面成像，所得熒光圖像參照?qǐng)D2，通過(guò)圖1與圖2的比較可以明顯的看出通過(guò)本發(fā)明制備得到的全腦包埋樣本在保持熒光信號(hào)強(qiáng)度的前提下，背景熒光大大降低。
[0034]實(shí)施例2
[0035]本實(shí)施例提供了一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，包括以下步驟:
[0036](I)成年的Thyl-GFP-M line轉(zhuǎn)基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，通過(guò)心臟左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分鐘，待血液沖洗干凈后，立即灌注冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液，并持續(xù)I小時(shí)。然后，取出小鼠全腦，切成I毫米厚的腦塊，再次放入冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液中后固定6小時(shí)。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為
0.01mol/L PBS0
[0037](2)固定結(jié)束后，將腦塊樣本放入冰水預(yù)冷卻的0.01mol/L PBS中漂洗3小時(shí)，其間更換新液3次，以徹底清洗掉殘余的多聚甲醛固定液。
[0038](3)接著，將腦塊樣本依次放入冰水預(yù)冷卻的50%、70%和95%乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水，每次15min。
[0039](4)脫水結(jié)束后，將全腦樣本依次放入質(zhì)量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中進(jìn)行梯度滲透，每個(gè)梯度I小時(shí)，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶劑為95%乙醇。隨后再次放入新鮮的100%GMA水溶性包埋液中滲透6小時(shí)，最后放入預(yù)聚GMA水溶性包埋液配制的0.5%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透I天。所有滲透液都先用冰水浴預(yù)冷卻。100%GMA由質(zhì)量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配制而成。預(yù)聚GMA水溶性包埋液的配制方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至95°C時(shí)迅速放入冰水浴中，并大力搖動(dòng)，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0040](5)將小鼠全腦放入凝膠將囊中，加入預(yù)聚GMA水溶性包埋液配制的0.5%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然后蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然后一起放入45°C烘箱中聚合12小時(shí)，得到所需的背景熒光顯著降低的I毫米腦塊包埋樣本。
[0041]實(shí)施例3
[0042]本實(shí)施例提供了一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，包括以下步驟:
[0043](I)成年的Thyl-YFP-H line轉(zhuǎn)基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，通過(guò)心臟左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分鐘，待血液沖洗干凈后，立即灌注冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液，并持續(xù)I小時(shí)。然后，取出小鼠全腦，切成5毫米腦塊，再次放入冰水預(yù)冷卻的4%多聚甲醛固定液中后固定12小時(shí)。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為0.0lmol/LPBS。
[0044](2)固定結(jié)束后，將腦塊樣本放入冰水預(yù)冷卻的0.0lmol/L PBS中漂洗12小時(shí)，其間更換新液4次，以徹底清洗掉殘余的多聚甲醛固定液。
[0045](3)接著，將全腦樣本依次放入冰水預(yù)冷卻的50%和70%乙醇溶液中梯度脫水，每次I小時(shí)，然后放入95%乙醇溶液配制的5%。蘇丹黑B染色液中脫水I小時(shí)。
[0046](4)脫水結(jié)束后，將全腦樣本依次放入質(zhì)量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液配制的5%。蘇丹黑B染色液中進(jìn)行梯度滲透，每個(gè)梯度2小時(shí)，其中70%和85%GMA包埋液的溶劑為95%乙醇。隨后再次放入新鮮的GMA水溶性包埋液配制的5%。蘇丹黑B染色液中滲透8小時(shí)，最后放入GMA水溶性包埋液配制的5%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透2天。所有滲透液都先用冰水浴預(yù)冷卻。100%GMA水溶性包埋液由質(zhì)量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配制而成。預(yù)聚GMA水溶性包埋液的配制方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90°C時(shí)迅速放入冰水浴中，并大力搖動(dòng)，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0047](5)將小鼠腦塊放入凝膠將囊中，加入預(yù)聚GMA水溶性包埋液配制的5%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然后蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然后一起放入50°C烘箱中聚合48小時(shí)，得到所需的背景熒光顯著降低的腦塊包埋樣本。
[0048]本發(fā)明是采用一種溶解了光吸收劑的樹(shù)脂作為染色包埋液滲透、包埋生物樣品，所得樣品為背景熒光被抑制的能應(yīng)用于超薄切片的生物樣品。該方法所得生物樣品在保持熒光信號(hào)強(qiáng)度的前提下，背景熒光大大降低。本方法能適用于厘米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用于連續(xù)超薄切片。本發(fā)明方法成本低廉，操作步驟簡(jiǎn)單，適合在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用。同時(shí)所得包埋的生物樣品能應(yīng)用于塊面成像結(jié)合連續(xù)薄切片的技術(shù)上，可用于快速獲取熒光蛋白標(biāo)記組織的高分辨三維熒光分布，繼而進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究。
[0049]最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將生物樣品用冰水預(yù)冷卻的質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛溶液固定6?24h; (2)將步驟(I)得到的生物樣品用冰水預(yù)冷卻的濃度為0.0lmol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其間更換新鮮漂洗液3?5次； (3)將步驟(2)得到的生物樣品依次放入冰水預(yù)冷卻的質(zhì)量百分比為50%、70%和95%的乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水,每次15min?2h ； (4)將步驟(3)得到的生物樣品依次放入質(zhì)量百分比為70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中進(jìn)行梯度滲透，每個(gè)梯度I?3h，隨后再次放入新鮮的質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液中滲透6?12h ; (5)將步驟(4)得到的生物樣品放入蘇丹黑B染色包埋液中滲透I?4天； (6)將步驟(5)得到的生物樣品放入包埋模具中，包埋模具中充滿蘇丹黑B染色包埋液，然后在45?5(TC下隔氧聚合12?60h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述步驟(4)中質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液由質(zhì)量百分比為67%的GMA單體，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配制而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述步驟(5)和(6)中的蘇丹黑B染色液包埋液是由預(yù)聚GMA水溶性包埋液溶解的濃度為0.5?5w/w%。(g/kg)的蘇丹黑B溶液配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述預(yù)聚GMA水溶性包埋液是取質(zhì)量百分比為100%的GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90?95°C時(shí)迅速放入冰水浴中，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，為加強(qiáng)染色效果，可以向所述步驟(3)中的質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液以及步驟(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入蘇丹黑B，配制成0.5?5w/w%。的染色液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述步驟(6)中的隔氧聚合是采用的包埋模具具有隔氧功能或采用具有抽真空功能的烘箱。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述步驟(I)中生物樣品的尺寸不超過(guò)2厘米見(jiàn)方。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弱背景熒光的樹(shù)脂包埋方法，其特征在于，所述生物樣品可以為任何發(fā)射熒光的動(dòng)物組織。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103808553SQ201410039740
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】龔輝, 駱清銘, 胡碧荷 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)