本發(fā)明涉及到一種人參健脾丸中人參皂苷類成分的含量測(cè)定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種人參健脾丸中人參類皂苷成分為人參皂苷rf、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1及人參皂苷ro五種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

人參健脾丸收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，由人參、白術(shù)(麩炒)、茯苓、山藥、陳皮、木香、砂仁、炙黃芪、當(dāng)歸、酸棗仁(炒)、遠(yuǎn)志(制)共計(jì)十一味藥材制成，具有健脾益氣，和胃止瀉的功能，用于脾胃虛弱所致的飲食不化、脘悶嘈雜、惡心嘔吐、腹痛便溏、不思飲食、體弱倦怠。《中國(guó)藥典》2015年版中人參健脾丸的標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)橙皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定，眾所周知，人參為人參健脾丸的重要藥味成分，因此，有必要增加人參健脾丸中人參皂苷類成分的測(cè)定，有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障藥品的安全有效，質(zhì)量可控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種人參健脾丸中五種人參皂苷類成分的含量測(cè)定方法，五種人參類皂苷成分為人參皂苷rf、人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1及人參皂苷ro；

本發(fā)明測(cè)定方法采用超高效液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用法，其色譜條件及測(cè)定法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相a：20％→50％，流動(dòng)相b：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流60～90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用；

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各2～5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

本發(fā)明含量測(cè)定方法中，供試品溶液制備中水浴回流提取時(shí)間優(yōu)選為75分鐘；測(cè)定法中分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液的量?jī)?yōu)選為5μl，注入液相色譜儀。

本發(fā)明含量測(cè)定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相a：20％→50％，流動(dòng)相b：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用；

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

為了驗(yàn)證測(cè)定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確保該含量測(cè)定方法可以用于人參健脾丸的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器：watersacquityuplc/xevotq～s超高效液相色譜～三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；分析天平：mettlerae240(感量0.0001g)；精密移液器；超純水儀：integral10(millipore)；色譜柱：watersbehc18(1.7μm，2.1×100mm)。

1.2試藥與試劑

對(duì)照品：人參皂苷re(中檢院提供，批號(hào)：110754～201525，標(biāo)示量92.3％)

人參皂苷rg1(中檢院提供，批號(hào)：110703～201530，標(biāo)示量91.7％)

人參皂苷rb1(中檢院提供，批號(hào)：110704～201424，標(biāo)示量93.7％)

人參皂苷rf(中檢院提供，批號(hào)：111719～201505)

人參皂苷ro(南通宇飛提供，批號(hào)fy15321117，含量≥98％)

試劑：甲醇、乙腈均為為色譜純，水為超純水。

2方法確定

2.1色譜條件

色譜柱：watersbehc18(1.7μm，2.1×100mm)

色譜條件：流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，梯度洗脫程序(見表1)。

柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μl。

表1梯度洗脫程序

2.2質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源(esi源)；

監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定(見表2)；

脫溶劑氣溫度：500℃；

毛細(xì)管電壓：3.00kv；

錐孔電壓：20v；

表2五種成分定性和定量離子及質(zhì)譜條件

2.3流動(dòng)相的優(yōu)化

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終選定正文的方法，能夠在5分鐘內(nèi)完成測(cè)定，建立的方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效的完成目標(biāo)成分的檢測(cè)。

2.4對(duì)照品溶液的配制：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5供試品的制備

取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得

3方法學(xué)考察

3.1專屬性考察

分別取混合對(duì)照品溶液、人參健脾丸樣品，按“2.5”方法項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析。五種成分峰形良好，無(wú)干擾物質(zhì)，色譜峰依次為人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro，見圖1～2。

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液5μl，分別注入超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，進(jìn)行分析，以各成分進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，各成分峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)＞0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3，圖3～6。

表3各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.4重復(fù)性

同一批樣品，剪碎，按低中高稱取樣品各3份，取樣量分別為2、3、4g，精密稱定，按“2.5”方法項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析，計(jì)算含量與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果9份溶液間rsd值均小于5％，表明方法重復(fù)性良好。

3.5回收率

取重復(fù)性項(xiàng)下樣品9份，取樣量為1.5g，精密稱定，每3份為1組，分別加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml，按“2.4”方法項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析。結(jié)果3個(gè)濃度水平的9份溶液平均回收率在95～105％，并且rsd小于7％。表明方法回收率良好，結(jié)果見表4和圖3～7。

表4各成分方法學(xué)結(jié)果

3.6穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，于0小時(shí)開始測(cè)定，在0、0.5、1、3、5、6、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rf、人參皂苷ro峰面積rsd分別為4.1％、3.6％、5.1％、2.8％、6.2％，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4樣品測(cè)定

用超高效液相色譜～串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5樣品測(cè)定結(jié)果

附圖說(shuō)明

圖1混合對(duì)照色譜圖；

圖2人參健脾丸樣品色譜圖；

圖3人參皂苷rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4人參皂苷re標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5人參皂苷rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6人參皂苷rf標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)曲線；

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相a：20％→50％，流動(dòng)相b：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用；

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

實(shí)施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相a：20％→50％，流動(dòng)相b：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流60分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用；

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。。

實(shí)施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為水，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～2分鐘，流動(dòng)相a：20％→50％，流動(dòng)相b：80％→50％；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細(xì)管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rf、人參皂苷rb1、人參皂苷ro標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01μg/ml～1.00μg/ml，分別精密量取一定體積的五種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

供試品溶液的制備：取人參健脾丸，剪碎，取3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)液，備用；

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品系列溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，即得。

上述實(shí)施例均按照藥典進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。