本發(fā)明涉及到一種血栓心脈寧片中人參皂苷類成分的含量測定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種血栓心脈寧片中人參類皂苷成分為人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd五種成分同時測定的含量測定方法。

背景技術(shù)：

血栓心脈寧片收載于《中國藥典》2015年版一部，由川芎、丹參、水蛭、毛冬青、牛黃、麝香、槐花、人參莖葉皂苷、冰片、蟾酥制成，具有益氣活血，開竅止痛的功能，用于用于氣虛血瘀所致的中風、胸痹癥見頭暈?zāi)垦?，半身不遂，胸悶心痛，心悸氣短；缺血性中風恢復(fù)期、冠心病心絞痛見上述證候者?！吨袊幍洹?015年版中血栓心脈寧片片的標準中僅對人參皂苷re和人參皂苷rg1進行了含量測定，眾所周知，人參皂苷re和人參皂苷rg1為人參、西洋參、三七等五加科植物的共有成分，專屬性差，為提高血栓心脈寧片的質(zhì)量控制水平，有必要增加血栓心脈寧片中人參莖葉皂苷的特有成分(如20(s)-人參皂苷f1)及其他皂苷類成分的測定，有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障藥品的安全有效，質(zhì)量可控。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種血栓心脈寧片中五種人參皂苷類成分的含量測定方法，五種人參類皂苷成分為20(s)-人參皂苷f1及人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rd。

本發(fā)明測定方法采用超高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法，其色譜條件及測定法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相a為乙腈，流動相b為水，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-2分鐘，流動相a由20％線性變化到50％，2.01分鐘，流動相a變?yōu)?0％，保持3分鐘；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液；

系列標準溶液：按照人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rd、人參皂苷rb1系列標準溶液濃度為0.01μg/ml-1.00μg/ml，20(s)-人參皂苷f1系列標準溶液濃度為0.05μg/ml-1.00μg/ml，精密吸取標準儲備溶液，置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液。

供試品溶液的制備：取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流60-90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用；

測定法：分別精密吸取對照品系列溶液與供試品溶液各2-5μl，注入液相色譜儀，測定，以標準曲線法計算含量，即得。

本發(fā)明含量測定方法中，供試品溶液制備中水浴回流提取時間優(yōu)選為75分鐘；測定法中分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液的量優(yōu)選為5μl，注入液相色譜儀。

本發(fā)明含量測定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相a為乙腈，流動相b為水，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-2分鐘，流動相a由20％線性變化到50％，2.01分鐘，流動相a變?yōu)?0％，保持3分鐘；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液。

系列標準溶液：按照人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rd、人參皂苷rb1系列標準溶液濃度為0.01μg/ml-1.00μg/ml，20(s)-人參皂苷f1系列標準溶液濃度為0.05μg/ml-1.00μg/ml，精密吸取標準儲備溶液，置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液；

供試品溶液的制備：取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用；

測定法：分別精密吸取對照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定，以標準曲線法計算含量，即得。

為了驗證測定含量方法的穩(wěn)定性、準確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對方法進行了以下方法學驗證實驗，以確保該含量測定方法可以用于血栓心脈寧片的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器：watersacquityuplc/xevotq-s超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；分析天平：mettlerae240(感量0.0001g)；精密移液器；超純水儀：integral10(millipore)；色譜柱：watersbehc18(1.7μm，2.1×100mm)。

1.2試藥與試劑

對照品：人參皂苷re(中檢院提供，批號：110754-201525，標示量92.3％)

人參皂苷rg1(中檢院提供，批號：110703-201530，標示量91.7％)

人參皂苷rb1(中檢院提供，批號：110704-201424，標示量93.7％)

人參皂苷rd(中檢院提供，批號：111818-201302，標示量94.2％)

20(s)-人參皂苷f1(南通飛宇生物科技有限公司，批號：fy15401226)

試劑：甲醇、乙腈均為為色譜純，水為超純水。

2方法確定

2.1色譜條件

色譜柱：watersbehc18(1.7μm，2.1×100mm)

色譜條件：流動相a為乙腈，流動相b為水，梯度洗脫程序(見表1)。

柱溫：40℃；進樣量：5μl。

表1梯度洗脫程序

2.2質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源(esi源)；

監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定(見表2)；

脫溶劑氣溫度：500℃；

毛細管電壓：3.00kv；

錐孔電壓：20v；

表25種成分定性和定量離子及質(zhì)譜條件

2.3流動相的優(yōu)化

經(jīng)反復(fù)試驗，最終選定正文的方法，能夠在5分鐘內(nèi)完成測定，建立的方法能夠快速、準確、高效的完成目標成分的檢測。

2.4對照品溶液的配制：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10.0mg(精確到0.1mg)置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液。

系列標準溶液：分別精密量取一定體積的標準儲備溶液置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液。

2.5供試品的制備

取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用。

3方法學考察

3.1專屬性考察

分別取混合對照品溶液、血栓心脈寧片片樣品，按“2.5”方法項下處理，進樣分析。五種成分峰形良好，無干擾物質(zhì)，色譜峰依次為人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd，見圖1-2。

3.2標準曲線

將質(zhì)量濃度約為0.005，0.01，0.05，0.5，1.0μg/ml的標準系列溶液5μl分別注入超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，進行分析，以各成分進樣濃度(μg/ml)為橫坐標，各成分峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，建立標準曲線，其線性相關(guān)系數(shù)r＞0.999。標準曲線見表3。結(jié)果表明，各成分均在0.005～1.0μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.4重復(fù)性

同一批血栓心脈寧片，研細，取樣量分別0.2、0.5、0.8g，各3份，按“2.5”方法項下處理，進樣分析，計算含量與相對標準偏差。結(jié)果9份供試品rsd值均小于7％，表明方法重復(fù)性良好。

3.5回收率

取重復(fù)性項下樣品粉末，取樣量為0.25g，共9份，每3份為1組，分別加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高3個濃度的混合對照品溶液25ml，按“2.4”方法項下處理，進樣分析。結(jié)果3個濃度水平的9份溶液平均回收率在90-110％，rsd均小于6％。表明方法回收率良好，結(jié)果見表4。

表4各組分方法學實驗結(jié)果

3.6穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，于0小時開始測定，在0、0.5、2、4、6、8、24小時進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷rg1、人參皂苷re、人參皂苷rb1、人參皂苷rd、人參皂苷f1峰面積rsd分別為4.6％、5.3％、3.6％、5.8％、4.9％，表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

4樣品測定

用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品進行測定，結(jié)果見表5。

表5樣品測定結(jié)果(單位：mg·g^-1)

附圖說明

圖1混合對照色譜圖；

圖2血栓心脈寧片樣品色譜圖；

具體實施方式

實施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相a為乙腈，流動相b為水，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-2分鐘，流動相a由20％線性變化到50％，2.01分鐘，流動相a變?yōu)?0％，保持3分鐘；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液；

系列標準溶液：按照人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rd、人參皂苷rb1系列標準溶液濃度為0.01μg/ml-1.00μg/ml，20(s)-人參皂苷f1系列標準溶液濃度為0.05μg/ml-1.00μg/ml，精密吸取標準儲備溶液，置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液。

供試品溶液的制備：取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流75分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用；

測定法：分別精密吸取對照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定，以標準曲線法計算含量，即得。

實施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相a為乙腈，流動相b為水，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-2分鐘，流動相a由20％線性變化到50％，2.01分鐘，流動相a變?yōu)?0％，保持3分鐘；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液；

系列標準溶液：按照人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rd、人參皂苷rb1系列標準溶液濃度為0.01μg/ml-1.00μg/ml，20(s)-人參皂苷f1系列標準溶液濃度為0.05μg/ml-1.00μg/ml，精密吸取標準儲備溶液，置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液。

供試品溶液的制備：取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用；

測定法：分別精密吸取對照品系列溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以標準曲線法計算含量，即得。

實施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相a為乙腈，流動相b為水，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-2分鐘，流動相a由20％線性變化到50％，2.01分鐘，流動相a變?yōu)?0％，保持3分鐘；流速：0.5ml/min；質(zhì)譜條件，離子源：電噴霧離子源(esi源)；監(jiān)測模式：負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑氣溫度：500℃；毛細管電壓：3.00kv；錐孔電壓：20v；監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定如下表：

標準儲備溶液：分別稱取人參皂苷re、人參皂苷rg1、20(s)-人參皂苷f1、人參皂苷rb1、人參皂苷rd標準品各10mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1g/l的標準儲備溶液；

系列標準溶液：按照人參皂苷re、人參皂苷rg1、人參皂苷rd、人參皂苷rb1系列標準溶液濃度為0.01μg/ml-1.00μg/ml，20(s)-人參皂苷f1系列標準溶液濃度為0.05μg/ml-1.00μg/ml，精密吸取標準儲備溶液，置10ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，得不同濃度的系列標準溶液。

供試品溶液的制備：取血栓心脈寧片，研細，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流60分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；再精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，以20％乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，0.2μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測液，備用；

測定法：分別精密吸取對照品系列溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定，以標準曲線法計算含量，即得。

上述實施例均按照藥典進行方法學驗證，結(jié)果顯示方法準確可靠、靈敏、專屬，各項指標均符合質(zhì)量控制的要求。