本發(fā)明涉及到一種西洋參中人參皂苷類成分的含量測(cè)定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
西洋參(學(xué)名：Panax quinquefolius)是五加科人參屬多年生草木植物，別名花旗參、洋參、西洋人參、American ginseng，原產(chǎn)于加拿大的大魁北克與美國(guó)的威斯康辛州，中國(guó)北京懷柔與長(zhǎng)白山等地也有種植。西洋參性涼，味甘、微苦；可補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津。用于氣虛陰虧，內(nèi)熱，咳喘痰血，虛熱煩倦，消渴，口燥喉干。西洋參益肺陰，清虛火，生津止渴。治肺虛久嗽，失血，咽干口渴，虛熱煩倦。西洋參中主要成分為人參皂苷類，西洋參所含有效成分與人參單體皂苷類別基本相同，甚至所含皂苷元也完全一致，均系齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。但由于人參二醇單體皂苷的Rb1的含量高于人參，因此，形成二者療效和應(yīng)用上的差異，各有特色不可互相替代。建立西洋參皂苷類成分的含量標(biāo)準(zhǔn)，有利于指導(dǎo)臨床合理用藥，目前尚沒有西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方 法。
本發(fā)明含量測(cè)定方法采用超高效液相色譜法，該方法如下：
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-6分鐘，流動(dòng)相A由18％漸變至21％；6-10分鐘，流動(dòng)相A由21％漸變至30％；10-18分鐘，流動(dòng)相A為30％漸變至35％；18-20分鐘，流動(dòng)相A為35％漸變至55％；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氣壓40psi，增益100，漂移管溫度60℃，流速0.4ml/min；柱溫為40℃；
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加80％甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液，即得；
供試品溶液的制備取西洋參，粉碎，過4號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30-60min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得；
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1-2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。
本發(fā)明含量測(cè)定方法中，供試品溶液制備中水浴回流提取時(shí)間優(yōu)選為45min；測(cè)定法中分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液的量?jī)?yōu)選為2μl，注入液相色譜儀。
本發(fā)明含量測(cè)定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-6分鐘，流動(dòng)相A由18％漸變至21％；6-10分鐘，流動(dòng)相A由21％漸變至30％；10-18分鐘，流動(dòng)相A為30％漸變至35％；18-20分鐘，流動(dòng)相A為35％漸變至55％；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氣壓40psi，增益100，漂移管溫度60℃，流速0.4ml/min；柱溫為40℃；
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加80％甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液，即得；
供試品溶液的制備取西洋參，粉碎，過4號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30-60min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得；
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。
為了驗(yàn)證測(cè)定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確保該含量測(cè)定方法可以用于西洋參的質(zhì)量控制。
1儀器與試藥
1.1儀器
超高效液相色譜儀：Acquity，美國(guó)沃特世(WATERS)；色譜柱：Acquity BEH C18(1.7μm，2.1mm×100mm)；電子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超純水儀：Integral 10(MILLIPORE)。
1.2試藥與試劑
對(duì)照品：人參皂苷Rg1(中檢院提供，批號(hào)110703-201529，含量以95.0％計(jì))、人參皂苷Re(中檢院提供，批號(hào)110754-201525，含量以92.3％計(jì))、人參皂苷Rb1(中檢院提供，批號(hào)110704-201424，含量以93.7％計(jì))及擬人參皂苷F11(中檢院提供，批號(hào)110841-201406)。
試劑：乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。
2方法確定
2.1色譜條件
2.1.1測(cè)定方式的選擇
人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的測(cè)定波長(zhǎng)通常采用紫外203nm，但是因擬人參皂苷F11無紫外吸收，故采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。皂苷類成分極性大，用高效液相色譜儀耗時(shí)長(zhǎng)，故采用UPLC在20分鐘內(nèi)完成測(cè)定。
2.1.2流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相選用乙腈-0.01％甲酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，主要目標(biāo)是將人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離良好，擬人參皂苷F11及人參皂苷Rb1與雜質(zhì)分離良好。經(jīng)系統(tǒng)考察最終選定正文色譜條件，得到色譜圖基線平穩(wěn)，成分峰形對(duì)稱、分離良好，見圖1，依次為人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1。
色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為40℃。
2.2供試品溶液的制備
2.2.1提取方式的考察
取同一批樣品適量，分別超聲處理(功率400W，頻率40kHz)45分鐘、加熱回流45分鐘，按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明加熱回流比超聲處理提取率略高。(結(jié)果見表1)。
表1 不同提取方式的含量測(cè)定結(jié)果
2.2.2提取時(shí)間的考察
取同一批樣品適量，分別加熱回流30、45、60min，按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明加熱回流30、45、60min含量基本無差別，為確保提取完全的同時(shí)節(jié)約資源，故選擇提取時(shí)間為45分鐘(結(jié)果見表2)。
表2 不同提取時(shí)間的含量測(cè)定結(jié)果
2.2.3提取溶劑的考察
取同一批樣品適量，分別用50％甲醇、80％甲醇、甲醇為提取溶劑，按正文方法試驗(yàn)。結(jié)果表明不同濃度的甲醇對(duì)樣品含量測(cè)定有影響，為確保提取率選用80％甲醇作為提取溶劑(見表3)。
表3 不同提取溶劑的含量測(cè)定結(jié)果
3方法學(xué)考察
3.1線性關(guān)系考察
精密量取適當(dāng)濃度的混合對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在22.93μg～229.32μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝1.508x+26.28(r＝1)；人參皂苷Re在110.80μg～886.38μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝1.566x+26.62(r＝1)；擬人參皂苷F11在24.14μg～241.44μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝1.573x+27.00(r＝0.999)；人參皂苷Rb1在0.144mg～1.152mg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝1.575x+26.90(r＝0.999)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4 線性關(guān)系考察結(jié)果
3.3重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品，研細(xì)，取0.5g、1.0g、1.5g各三份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好(結(jié)果見表5-6)。
表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果1
表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果2
3.4回收率試驗(yàn)
取已知含量的樣品(含量見重復(fù)性結(jié)果)粉末9份，每份約0.25g，精密稱定，每三份為一組，分別加入用80％甲醇配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按正文方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表7-10。表明本方法回收率較好。
表7 人參皂苷Rg1回收率試驗(yàn)結(jié)果
表8 人參皂苷Re回收率試驗(yàn)結(jié)果
表9 人參皂苷Rb1回收率試驗(yàn)結(jié)果
表10 擬人參皂苷F11回收率試驗(yàn)結(jié)果
3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一份供試品溶液，于0小時(shí)開始測(cè)定，以后間隔一段時(shí)間測(cè)定一次，記錄峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(結(jié)果見表11)。
表11 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
3.6樣品測(cè)定
取收集到的西洋參藥材共10批，依法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表12。
表12 西洋參樣品含量測(cè)定結(jié)果
附圖說明
圖1西洋參中四種人參皂苷類成分含量測(cè)定色譜圖(峰1人參皂苷Rg1、峰2人參皂苷Re、峰3擬人參皂苷F11、峰4人參皂苷Rb1)；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-6分鐘，流動(dòng)相A由18％漸變至21％；6-10分鐘，流動(dòng)相A由21％漸變至30％；10-18分鐘，流動(dòng)相A為30％漸變至35％；18-20分鐘，流動(dòng)相A為35％漸變至55％；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氣壓40psi，增益100，漂移管溫度60℃，流速0.4ml/min；柱溫為40℃；
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加80％甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液，即得；
供試品溶液的制備取西洋參，粉碎，過4號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流45min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得；
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。
實(shí)施例2
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-6分鐘，流動(dòng)相A由18％漸變至21％；6-10分鐘，流動(dòng)相A由21％漸變至30％；10-18分鐘，流動(dòng)相A為30％漸變至35％；18-20分鐘，流動(dòng)相A為35％漸變至55％；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氣壓40psi，增益100，漂移管溫度60℃，流速0.4ml/min；柱溫為40℃；
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加80％甲醇分別制成每1ml含人參 皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液，即得；
供試品溶液的制備取西洋參，粉碎，過4號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得；
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。。
實(shí)施例3
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01％甲酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0-6分鐘，流動(dòng)相A由18％漸變至21％；6-10分鐘，流動(dòng)相A由21％漸變至30％；10-18分鐘，流動(dòng)相A為30％漸變至35％；18-20分鐘，流動(dòng)相A為35％漸變至55％；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，氣壓40psi，增益100，漂移管溫度60℃，流速0.4ml/min；柱溫為40℃；
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加80％甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液，即得；
供試品溶液的制備取西洋參，粉碎，過4號(hào)篩，取1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流60min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得；
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。。
上述實(shí)施例均按照藥典進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。