本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是一種最常見的生殖障礙和代謝性綜合征，一直以其高發(fā)生率(5％～10％)、多系統(tǒng)廣泛遷延以及各年齡段持續(xù)深遠(yuǎn)的病理影響而成為婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前PCOS病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，胰島素抵抗(insulinresistance，IR)和高雄激素血癥(hyperandrogenemia，HA)是其主要的病理特征，也常伴有肥胖、糖代謝異常、心血管疾病等合并癥的發(fā)生。由于PCOS的異質(zhì)性、臨床表現(xiàn)的多態(tài)性，給臨床診斷和治療帶來極大困難，PCOS的診斷一直是極具爭(zhēng)議的話題。目前，國(guó)際上先后有三個(gè)PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用。第一個(gè)是來源于由NIH(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)于1990年4月舉行的專家會(huì)議的報(bào)告。報(bào)告中指出PCOS的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括:雄激素過多癥和/或高雄激素血癥，月經(jīng)失調(diào)，并排除其它已知疾病。這一調(diào)查把PCOS定義為是一種經(jīng)過排除診斷后的雄激素過量性疾病，伴有卵巢的原因和/或結(jié)果。第二個(gè)是成形于2003年5月在鹿特丹召開的歐洲生殖和人類胚胎學(xué)會(huì)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)舉辦的專家會(huì)議。會(huì)議中提出PCOS的定義需至少滿足以下3個(gè)特點(diǎn)中的2個(gè):①稀發(fā)和/或無排卵；②雄激素過多癥的臨床和/或生化表現(xiàn)；③多囊卵巢。診斷PCOS前也需要首先排除其它雄激素過量或相關(guān)疾病。2006年，AES(美國(guó)雄激素過多協(xié)會(huì))提出第三個(gè)PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)，指出PCOS診斷必需滿足高雄激素這一特點(diǎn)，而排卵障礙和多囊卵巢存在二者之一即可診斷。三種標(biāo)準(zhǔn)從不同出發(fā)點(diǎn)給出了PCOS的定義，也凸顯出了對(duì)疾病不完全相同的認(rèn)識(shí)，多個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)的并存給臨床工作造成較大困難。一項(xiàng)涵蓋106項(xiàng)研究共15129例受試者的Meta分析顯示，PCOS患者發(fā)生超重、肥胖和中心性肥胖的風(fēng)險(xiǎn)比分別為1.95、2.77和1.73。對(duì)于糖耐量受損、糖尿病和代謝綜合征的識(shí)別在PCOS治療選擇時(shí)也有重要意義。數(shù)據(jù)表明與正常對(duì)照相比，PCOS患者上述三種代謝改變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別增加2.48、4.43、2.88倍。多中心大數(shù)據(jù)的研究顯示，肥胖和糖代謝異?？勺鳛镻COS的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于初診的PCOS患者，臨床一般是通過B超檢測(cè)、雄激素水平進(jìn)行排除性診斷，國(guó)內(nèi)外尚缺乏針對(duì)肥胖和糖代謝異常的PCOS診斷標(biāo)志物。Asprosin是2016年4月《Cell》期刊報(bào)道的一種新型的葡萄糖調(diào)控蛋白質(zhì)激素，由白色脂肪組織分泌、釋放并運(yùn)輸至肝臟。研究發(fā)現(xiàn)，Asprosin可與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過激活G蛋白-cAMP-PKA信號(hào)通路來增加肝細(xì)胞中葡萄糖的釋放。同時(shí)Asprosin的作用是跟胰島素功能亢進(jìn)相關(guān)，Asprosin含量的增加會(huì)導(dǎo)致胰島素的耐受性，進(jìn)一步提高血糖的含量。上述研究表明，asprosin的含量和肥胖及高血糖呈正相關(guān)?？赡艹蔀榉逝旨疤谴x異常的標(biāo)志物，亦可能成為PCOS的生物標(biāo)志物，并作為輔助檢測(cè)來確診PCOS。目前，對(duì)Asprosin的研究?jī)H有2016年《Cell》期刊上的一篇文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外尚無對(duì)其應(yīng)用價(jià)值的報(bào)道，也無任何關(guān)于定量檢測(cè)人源性Asprosin含量的報(bào)道。其他研究中心獲悉asprosin及其意義后，雖然可能考慮也研制針對(duì)asprosin的Elisa試劑盒，但此試劑盒的研發(fā)和驗(yàn)證不僅需要復(fù)雜的分析、實(shí)驗(yàn)，還需要大量的樣本數(shù)據(jù)支持，常規(guī)的有限實(shí)驗(yàn)很難完成這一探究過程，實(shí)現(xiàn)其臨床價(jià)值及推廣應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的初衷是克服目前PCOS患者尚無明確診斷的問題，提出一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。該試劑盒能夠快速檢測(cè)人或者動(dòng)物標(biāo)本中的asprosin蛋白含量，耗時(shí)少，使用簡(jiǎn)便，而且結(jié)果特異性強(qiáng)、敏感度高。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明利用ELISA技術(shù)建立了檢測(cè)人源性asprosin蛋白的試劑盒，并首次證實(shí)在PCOS患者的血漿中，asprosin蛋白的含量顯著高于正常人群。本發(fā)明第一方面，提供了一種人源性asprosin蛋白的多克隆抗體制備方法，步驟如下：步驟一，根據(jù)asprosin基因(以下簡(jiǎn)寫為A基因)序列，以及大腸桿菌原核蛋白表達(dá)的偏好，在保證A基因的氨基酸序列一致的前提下，優(yōu)化A基因的原始密碼子，并設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(原始密碼子、優(yōu)化后的密碼子、引物見表1)；步驟二，將PCR擴(kuò)增到的A基因和載體質(zhì)粒pET15b和分別用NdeI和XhoI雙酶切并分別回收，之后將A基因的酶切產(chǎn)物連接到酶切后的pET15b載體質(zhì)粒上，得到pET15b-A重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定，獲得序列正確的pET15b-A重組質(zhì)粒進(jìn)行保存；步驟三，將步驟二所述的測(cè)序正確的pET15b-A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21表達(dá)宿主菌體中，優(yōu)化重組A蛋白的誘導(dǎo)條件；步驟四，超聲破碎步驟三所述的BL21表達(dá)宿主菌體，12000rpm，4℃，離心20min，收集沉淀后用包涵體溶解液進(jìn)行重溶，之后采用12％的SDS-PAGE膠檢測(cè)重組A蛋白的表達(dá)情況；步驟五，采用Ni-瓊脂糖親和層析法，純化步驟四所述的重組A蛋白，采用12％的SDS-PAGE膠檢測(cè)重組A蛋白的純化效果；步驟六，用純化得到的asprosin免疫健康雌性新西蘭大白兔(4月齡，2.1kg)，初免蛋白劑量為0.5mg/只，二免、三免、四免蛋白劑量為0.25mg/只，初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化；步驟七，四免后(第56天)耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求，第57天，頸動(dòng)脈終放血收集抗血清。步驟八，親和層析法純化抗血清中的抗體，ELISA檢測(cè)純化后所得抗體的效價(jià)，確定最佳的抗體稀釋比。優(yōu)化的，為了提高目的蛋白的表達(dá)水平，優(yōu)化其誘導(dǎo)條件，最終確定為在菌液OD值達(dá)到0.6時(shí)，添加終濃度為0.5mM的IPTG，220rpm，37℃誘導(dǎo)4h。優(yōu)化的，為了提高ELISA檢測(cè)asprosin蛋白濃度的靈敏度，針對(duì)此抗體添加生物素標(biāo)簽，用于將來ELISA檢測(cè)時(shí)與二抗進(jìn)行特異性結(jié)合，從而提高ELISA的靈敏度。本發(fā)明第二方面，提供了一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒，包括以下組分：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、二抗、抗體稀釋液、顯色液和終止液；所述酶標(biāo)板采用上述添加有生物素標(biāo)簽的多克隆抗體包被，并用封閉緩沖液封閉；所述二抗能夠與作為一抗的所述添加有生物素標(biāo)簽的多克隆抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合。優(yōu)化的，二抗選擇HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，效果最佳。優(yōu)化的，酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板，具體采用美國(guó)Corning的聚苯乙烯塑料板。優(yōu)化的，所述封閉緩沖液由3％牛血清白蛋白(BSA)、3％的脫脂奶粉和0.05％的PBST組成，37℃條件封閉1h；所述樣品稀釋液：樣品為血漿、血清時(shí)，樣品稀釋液為pH7.4的1×PBS；或者樣品為細(xì)胞上清液時(shí)，樣品稀釋液為無血清培養(yǎng)基；所述洗滌緩沖液為pH7.4的0.05％PBST；所述抗體稀釋液為5％的脫脂奶粉；所述顯色液為底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；所述終止液為2M的硫酸?；谝陨螮LISA檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明構(gòu)建了用于輔助診斷多囊卵巢綜合征(PCOS)的檢測(cè)設(shè)備體系，該檢測(cè)設(shè)備體系還包括37℃溫箱、移液器和酶標(biāo)儀。上述ELISA檢測(cè)試劑盒的使用步驟如下(實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫)：步驟一，標(biāo)本的采集及保存：血清：全血標(biāo)室溫放置30分鐘或4℃過夜后，室溫，1000g離心10min，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)，室溫，1000g離心10min，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；其它生物標(biāo)本：請(qǐng)2000g離心10分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。步驟二，加樣：實(shí)驗(yàn)時(shí)依次添加標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品和1：10稀釋的待測(cè)樣品100ul(用樣品稀釋液1：10進(jìn)行稀釋)，酶標(biāo)板加蓋，37℃孵育1小時(shí)(加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，注意不要有氣泡，盡量不觸及孔壁。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)必須使用標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品)，甩去各孔中的液體，加入洗滌緩沖液每孔200ul，洗滌3次，甩干；步驟三，將HRP標(biāo)記的鏈霉親和素二抗用抗體稀釋液按1：1000稀釋，100ul/孔加入酶標(biāo)板中，37℃孵育1小時(shí)，甩去各孔中的液體，加入洗滌緩沖液每孔200ul，洗滌3次，甩干；步驟五，加入顯色液100ul/孔，室溫避光反應(yīng)15min，最后加入50ul終止液以停止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)450nm)測(cè)定OD值。優(yōu)選的，所述的96孔酶標(biāo)板為美國(guó)Corning的聚苯乙烯塑料板(表面經(jīng)過特殊處理，有利于樣品的吸附)，且為了減少操作時(shí)間，用生物素標(biāo)記的A蛋白抗體提前包被96孔酶標(biāo)板，制成固相抗體＝并用優(yōu)化封閉緩沖液進(jìn)行封閉，實(shí)驗(yàn)時(shí)依次添加標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品和待測(cè)樣品即可；且96孔酶標(biāo)板可拆卸，可以根據(jù)樣品數(shù)確定孔數(shù)，可用于多次實(shí)驗(yàn)，減少浪費(fèi)。優(yōu)選的，為了便于操作，本試劑盒提供稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(A蛋白濃度為100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，10ng/ml，3ng/ml，0ng/ml)，陰性對(duì)照品(A蛋白濃度為2.32ng/ml)，陽性對(duì)照品(A蛋白濃度為24.65ng/ml)。本發(fā)明的有益效果：1)準(zhǔn)確：目前市場(chǎng)上無商業(yè)化的人源性asprosin蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒，經(jīng)文獻(xiàn)檢索沒有定量檢測(cè)人源性asprosin蛋白含量的方法，因此對(duì)于人血漿中asprosin蛋白無法精確定量。此ELISA試劑盒可準(zhǔn)確檢測(cè)人血漿中asprosin蛋白的含量，結(jié)果由酶標(biāo)儀定量分析，排除了免疫組化、免疫熒光、Westernblot等半定量方法的主觀性。且重組A蛋白與抗體的反應(yīng)具有良好的濃度依賴關(guān)系，成明顯的線性關(guān)系(y＝0.0206x-0.0105R2＝0.9851)，如圖5所示。2)靈敏度高：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中Asprosin水平，為Asprosin抗體進(jìn)行生物素標(biāo)簽，從而可以標(biāo)記有親和素二抗形成生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin-System，BAS)，其高親合力的牢固結(jié)合可以起到生化反應(yīng)多級(jí)放大的效應(yīng)，使BAS免疫標(biāo)記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏，用該方法檢測(cè)到的Asprosin蛋白最低可至500ng/ml，敏感性明顯高于普通的westernblot和免疫組化等半定量方法，敏感性實(shí)驗(yàn)見附圖4。3)簡(jiǎn)單方便：本方法中所用試劑和實(shí)驗(yàn)耗材均為商業(yè)化產(chǎn)品，容易獲得；檢測(cè)中僅需移液器、37℃溫箱、酶標(biāo)儀進(jìn)行加樣、孵育和讀數(shù)，普通的實(shí)驗(yàn)室均可開展此項(xiàng)檢測(cè)。4)通用性：本發(fā)明也可用于肥胖、2型糖尿病、高血脂等病人標(biāo)本中A蛋白含量的檢測(cè)，基礎(chǔ)研究中各種生物學(xué)樣品(如脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清液、動(dòng)物血漿中的)A蛋白含量檢測(cè)。5)實(shí)用價(jià)值高：本發(fā)明檢測(cè)時(shí)不需要復(fù)雜儀器，易于在科研院校和醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用，可大規(guī)模檢測(cè)臨床標(biāo)本，快速獲得A蛋白相關(guān)的海量數(shù)據(jù)和信息，為A相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研研究推波助瀾，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。附圖說明圖1為融合蛋白小試SDS-PAGE分析圖。圖2為鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析圖。圖3為蛋白最終純化SDS-PAGE分析圖。圖4為PCOS患者血漿樣本的Westernblot分析圖。圖5為重組A蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖6為本試劑盒中所提供的酶標(biāo)板樣品分布圖。圖7為ELISA試劑盒檢測(cè)不同體重女性血漿中A蛋白濃度分析圖。圖8為ELISA試劑盒檢測(cè)2型糖尿病人血漿中A蛋白濃度分析圖。具體實(shí)施方式根據(jù)A蛋白的基因序列，以及大腸桿菌原核蛋白表達(dá)的偏好，在保證A基因的氨基酸序列一致的前提下，優(yōu)化A基因的原始密碼子，并設(shè)計(jì)引物，原始密碼子、優(yōu)化后的密碼子、引物見表1；表1.Asprosin蛋白基因及氨基酸序列圖1是A蛋白不同條件下誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，其中M代表蛋白Marker；泳道1為誘導(dǎo)前表達(dá)的總蛋白；泳道2為20℃誘導(dǎo)過夜后，菌體破碎后上清中的蛋白；泳道3為20℃誘導(dǎo)過夜后，菌體破碎后沉淀中的蛋白；泳道4為37℃誘導(dǎo)4h后，菌體破碎后上清中的蛋白；泳道5為37℃誘導(dǎo)4h后，菌體破碎后沉淀中的蛋白。圖2是asprosin蛋白經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析純化后各流出組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，其中M代表蛋白Marker；泳道1為上柱前的蛋白樣品；泳道2為從鎳柱直接流出后收集的蛋白樣品；泳道3為經(jīng)過20mM咪唑洗脫后收集的蛋白樣品；泳道4為經(jīng)過50mM咪唑洗脫后收集的蛋白樣品；泳道5為經(jīng)過500mM咪唑洗脫后收集的蛋白樣品。圖3是最終純化得到的asprosin蛋白SDS-PAGE分析，asprosin蛋白分子量約為20KDa，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明asprosin蛋白成功得到了純化，且純度很高。其中M代表蛋白Marker；泳道1為最終純化得到的asprosin蛋白。特異性試驗(yàn)：用所建立的ELISA方法隨機(jī)檢測(cè)100例不孕女性的血漿樣本，將重組A蛋白作為陽性對(duì)照，根據(jù)所得OD值將血漿樣本分為PCOS患者組(總計(jì)6名疑似為PCOS患者，臨床診斷是8名確診為PCOS，此ELISA方法的PCOS檢出率為75％)和非PCOS患者組，進(jìn)一步用Westernblot方法對(duì)此6名PCOS患者的血漿樣本進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4所示，Westernblot結(jié)果雖然能檢測(cè)出A蛋白，但是由于其血漿中含量較低，因此A蛋白條帶非常模糊，不能用于臨床的診斷分析。敏感性試驗(yàn)：將重組標(biāo)準(zhǔn)A蛋白(200ng/ml)用1×PBS作2倍比連續(xù)稀釋，并排設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，得出標(biāo)準(zhǔn)蛋白各個(gè)稀釋點(diǎn)的平均OD值與空白組OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最高稀釋倍數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組標(biāo)準(zhǔn)A蛋白稀釋256倍后的OD值與空白組OD值仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明可檢測(cè)的可溶型CD74蛋白最低濃度為782pg/ml。將重組標(biāo)準(zhǔn)A蛋白按比例進(jìn)行稀釋，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，10ng/ml，3ng/ml，0ng/ml，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，100ul/孔，按照上述所述的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果相似，如圖5所示，重組A蛋白與抗體的反應(yīng)具有良好的濃度依賴關(guān)系，且成明顯的線性關(guān)系，y＝0.0206x-0.0105R2＝0.9851。本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定血漿中A蛋白的含量。用生物素標(biāo)記的A蛋白抗體包被96孔酶標(biāo)板，制成固相抗體，實(shí)驗(yàn)時(shí)按圖6依次添加標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品和待測(cè)樣品(S是待測(cè)樣品Sample的縮寫)，待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)空，此酶標(biāo)板最多每次可檢測(cè)24人，另外，96孔酶標(biāo)板可拆卸，可以根據(jù)樣品數(shù)確定孔數(shù)，可用于多次實(shí)驗(yàn)，減少浪費(fèi)。選取已經(jīng)確診為PCOS的不孕患者200人，同時(shí)選取健康人群200人，兩組在年齡、體重指數(shù)上匹配。收集兩組的基本資料，并對(duì)其血漿中的A蛋白含量進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果以Mean±SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采取配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.01為結(jié)果有極顯著差異。研究結(jié)果如表2所示，兩組在年齡、體重指數(shù)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是PCOS患者的A蛋白含量極顯著高于健康組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此實(shí)驗(yàn)也指明血漿中A蛋白含量高于12.83ng/mL，可作為不孕患者疑似為PCOS的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)。表2健康組(n＝200)PCOS患者(n＝200)P值年齡29.45±5.1630.38±4.650.285體重指數(shù)24.16±1.8725.24±1.430.112A蛋白含量(ng/mL)3.51±2.3512.83±4.070.008體重指數(shù)(BodyMassIndex，簡(jiǎn)稱BMI)，是用體重公斤數(shù)除以身高米數(shù)平方得出的數(shù)字，是目前國(guó)際上常用的衡量人體胖瘦程度以及是否健康的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取身體健康的人群總計(jì)200人，根據(jù)中國(guó)的BMI標(biāo)準(zhǔn)，將其分為偏瘦組BMI≤18.5kg/m2，正常體重組(18.5-24kg/m2)，偏胖組(24-28kg/m2)，肥胖組(BMI≥28kg/m2)。結(jié)果以Mean±SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采取配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，*:P＜0.05為結(jié)果有顯著差異，**:P＜0.01為結(jié)果有極顯著差異。圖7是ELISA方法檢測(cè)4組人群血漿中A蛋白濃度結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，偏瘦組血漿中A蛋白濃度顯著低于正常體重組，偏胖組血漿中A蛋白濃度顯著高于正常體重組，肥胖組血漿中A蛋白濃度極顯著高于正常體重組，且血漿中A蛋白濃度與BMI指數(shù)呈正相關(guān)趨勢(shì)。糖尿病是由于胰島素的缺陷(絕對(duì)量的缺少或相對(duì)量的不足)，使得機(jī)體糖類、脂類、蛋白質(zhì)、水及電解質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，從而導(dǎo)致血糖慢性升高，最終成為一種多病因的復(fù)雜代謝疾病。糖尿病診斷和分型專家委員會(huì)在1997年更新了分型標(biāo)準(zhǔn)，將糖尿病分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類型糖尿病(包括各種遺傳的、內(nèi)分泌的、藥物引起和感染性疾病導(dǎo)致)，其中95％的糖尿病患者為2型糖尿病。2型糖尿病的癥狀與代謝紊亂有關(guān)的表現(xiàn)，尤其是“三多一少”，表現(xiàn)為多尿、多飲、多食但體重下降。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活方式的改變(能量攝入增加和運(yùn)動(dòng)減少等)及人口老齡化，2型糖尿病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增高趨勢(shì)，尤其在發(fā)展中國(guó)家增加速度將更快(預(yù)計(jì)到2025年可能增加170％)，呈現(xiàn)流行勢(shì)態(tài)。糖尿病現(xiàn)已成為繼心血管病和腫瘤之后，第3位威脅人們健康和生命的非傳染性疾病。目前普遍認(rèn)為，胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的主要病因之一，而脂代謝異常所導(dǎo)致的脂肪異常分布、過度堆積則是胰島素抵抗的主要因素，因此血漿中A蛋白的含量可以作為2型糖尿病的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究選取已經(jīng)確診為2型糖尿病的患者100人，同時(shí)選取健康人群100人，兩組在年齡、體重指數(shù)上匹配。收集兩組的基本資料，兩組在年齡、體重指數(shù)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)其血漿中的A蛋白含量進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果以Mean±SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采取配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.01為結(jié)果有顯著差異。研究結(jié)果如圖8所示，2型糖尿病患者血漿中A蛋白含量極顯著高于健康組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此實(shí)驗(yàn)也指明血漿中A蛋白含量高于18.06ng/mL，可作為伴有“三多一少”癥狀的患者疑似為2型糖尿病的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3