本發(fā)明涉及共聚焦顯微成像領(lǐng)域，具體地，涉及基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)和方法。

背景技術(shù)：

激光共聚焦顯微鏡采用激光作為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機對成像進行輸出和顯示，激光共聚焦顯微鏡經(jīng)照明小孔形成點光源，點光源照射樣本激發(fā)熒光，熒光發(fā)出光子經(jīng)過物鏡和小孔被探測器收集，樣本平面和像平面是點對點成像。為了有效地排除焦平面以外的散色光對成像精度的影響，探測小孔的直徑一般取的很小，常取為1au(airyunit，艾里單位)，如果再減小小孔的直徑，為了保證成像的亮度，需增加相應(yīng)的曝光時間，從而影響圖像的采集速度。此外，光共焦系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用了非常昂貴的硬件系統(tǒng)，因此其價格也非常昂貴。如何平衡成像精度、速度與成本等之間的矛盾是如今研究的重點。

傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡成像方法是設(shè)置一個小孔與點探測器(雪崩光電二極管apd或者光電倍增管pmt)，本發(fā)明是用scmos相機替代小孔和點探測器，并提出使用虛擬小孔和像素重分配理論來提升成像分辨率。其中，scmos是pco公司與其他公司聯(lián)合開發(fā)的科學(xué)cmos芯片，避除了傳統(tǒng)cmos芯片高暗電流、高讀出噪聲、低填充因數(shù)和一致性差等缺點，繼承了cmos高速、低消耗等優(yōu)點；scmos相機屬于科學(xué)級相機。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)和方法。

根據(jù)本發(fā)明提供的一種基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)，包括scmos相機，還包括反射鏡組、激光振鏡系統(tǒng)、第一聚光透鏡、第二聚光透鏡、第三聚光透鏡、第四聚光透鏡、分光鏡、樣品面；

經(jīng)反射鏡組反射的激光依次通過激光振鏡系統(tǒng)、第一聚光透鏡、第二聚光透鏡到達分光鏡，得到第一分光、第二分光；

所述第一分光經(jīng)過第三聚光透鏡到達樣品面；

所述第二分光經(jīng)過第四聚光透鏡到達scmos相機；

優(yōu)選地，樣品面經(jīng)激光激發(fā)的激發(fā)光依次經(jīng)過第三聚光透鏡、分光鏡、第四聚光透鏡到達scmos相機。

根據(jù)本發(fā)明提供的一種基于scmos的共聚焦超分辨成像方法，包括：

步驟1：通過掃描樣本，獲取各掃描點對應(yīng)的子圖像；

步驟2：確定所述子圖像的激發(fā)光中心；

步驟3：為各子圖像添加虛擬小孔，其中，虛擬小孔是指窗函數(shù)；

步驟4：像素重分配；

步驟5：組合虛擬小孔內(nèi)像元采集到的像素形成分圖像，并對所述分圖像作去卷積處理；

步驟6：將各分圖像合成最終的圖像。

優(yōu)選地，掃描樣本共獲得n個掃描點，每個掃描點在scmos上所形成子圖像的像元個數(shù)為n1×n2，則共獲取了n×n1×n2個像素值s^ki,j(1≤k≤n,1≤i≤n1,1≤j≤n2)；

n為大于等于2的正整數(shù)；

n1為大于等于2的正整數(shù)；

n2為大于等于2的正整數(shù)；

表示對應(yīng)第k個掃描點的第i行第j列的像元的像素值。

優(yōu)選地，選取各子圖像中像素值最大的像元作為激發(fā)光中心，激發(fā)光中心的行列坐標(biāo)位置為(u,v)，則：

表示對應(yīng)第k個掃描點的第m行第n列的像元的像素值；

m與n的取值范圍1≤m≤n1；1≤n≤n2。

優(yōu)選地，以激發(fā)光中心為中心軸，對各子圖像添加虛擬小孔，獲得窗函數(shù)圖像；

子圖像的像素矩陣為s，添加的窗函數(shù)h為：

獲得的與窗函數(shù)卷積以后的像素矩陣s1為：

s1(i,j)＝h(i,j)s(i-u,j-v)

s(i,j)表示子圖像的像素矩陣s中第i行第j列處的像素值；

h(i,j)表示窗函數(shù)h中第i行第j列處的值；

s1(i,j)表示子圖像的像素矩陣s與窗函數(shù)h卷積以后的像素矩陣s1中第i行第j列處的像素值；

s(i-u,j-v)表示子圖像的像素矩陣s中第i-u行第j-v列處的像素值。

優(yōu)選地，所述像素重分配的步驟包括：

以激發(fā)光中心像元(u,v)為中心軸，令各子圖像中的其它像元向中心軸靠攏，使得行列坐標(biāo)為(i1,j1)的像素被分配到行列坐標(biāo)(i2,j2)，則

[]表示向上取整

對于激發(fā)光中心周圍像元，若分配到2個以上的像素，則對這些像素的像素值取平均值作為像元的像素值。

p為分配到位置點(i2,j2)像素個數(shù)

表示對應(yīng)第k個掃描點的第i2行第j2列的像元的像素值；

表示位置為第k個掃描點的第i2行第j2列的像元分配到的第p個像素的像素值。

優(yōu)選地，設(shè)虛擬小孔由k個像元組成，針對每個像元，由n個掃描點形成原圖像的k個分圖像：

mq表示由n個掃描點形成原圖像的第q個分圖像；

表示應(yīng)第k個掃描點的第i行第j列的像元的像素值。

優(yōu)選地，對各像元形成的分圖像進行去卷積處理，并獲得相應(yīng)的點擴散函數(shù)：

{psf1,psf2,psf3,…psfk}

psfk表示第k個像元的點擴散函數(shù)；

由虛擬小孔內(nèi)的各像元形成的分圖像合成最終的圖像時，以各個像元的點擴散函數(shù)作為權(quán)值參考，對各個分圖像進行加權(quán)求和，獲取最終的圖像m：

fwhm()表示點擴散函數(shù)的半峰全寬值；

psfq表示第q個像元的點擴散函數(shù)；

psfm表示第m個像元的點擴散函數(shù)。

優(yōu)選地，所述的基于scmos的共聚焦超分辨成像方法是權(quán)利要求1或2所述的基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)獲取的圖像的后處理方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

本發(fā)明提用scmos相機代替?zhèn)鹘y(tǒng)的pmt探測器和小孔，由原來的點對點成像轉(zhuǎn)為點對面成像，并選取一定組合的像元組合形成虛擬小孔，在獲取掃描點對應(yīng)子圖像之后，運用像素重分配理論合成小孔內(nèi)各像元對樣本的分圖像，再使用分圖像加權(quán)求和算法合成最終圖像，提升成像的分辨率。本發(fā)明成像系統(tǒng)的特點是結(jié)構(gòu)簡單，且可拓展性較強，添加虛擬小孔(即窗函數(shù))，提升了成像的軸向分辨率，增加了成像系統(tǒng)的信噪比。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)的光路圖。

圖2為圖像信號形成過程示意圖。

圖3為虛擬小孔示意圖，其中，虛擬小孔可稱為數(shù)字小孔。

圖4為基于scmos的共聚焦超分辨成像方法的流程圖。

圖中示出：

1為激光光源；

2、3、4分別為第一反射鏡、第二反射鏡、第三反射鏡；

5為激光振鏡系統(tǒng)(激光掃描器)；

6、7、9、11分別為第一聚光透鏡、第二聚光透鏡、第三聚光透鏡、第四聚光透鏡；

8為分光鏡；

10為樣品面；

12為scmos相機；

13、18、19、23分別為第一像元(第一探測點)、第二像元(第二探測點)、第三像元(第三探測點)、第四像元(第四探測點)；

14為像元面；

15為第二像元18的探測點擴散函數(shù)；

16為掃描點擴散函數(shù)；

17為樣平面物點；

20為區(qū)域；

21為虛擬小孔；

22為激發(fā)光中心。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變化和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供了一種基于像素重分配理論和虛擬小孔的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)，用scmos相機代替?zhèn)鹘y(tǒng)的pmt探測器和小孔，由原來的點對點成像轉(zhuǎn)為點對面成像，并選取一定組合的像元組合形成虛擬小孔，在獲取掃描點對應(yīng)子圖像之后，運用像素重分配理論合成小孔內(nèi)各像元對樣本的分圖像，再使用分圖像加權(quán)求和算法合成最終圖像，提升成像的分辨率。

為了減小小孔的直徑，同時保證圖像的亮度(清晰度)，本發(fā)明提出使用scmos面陣探測器替代傳統(tǒng)的小孔與pmt探測器，如附圖1所示，同時提出使用數(shù)字虛擬小孔去除雜散光以及像素重分配實現(xiàn)成像分辨率的提升。

本發(fā)明使用scmos探測器替代傳統(tǒng)的小孔和pmt探測器，簡化了共聚焦系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及省去了小孔的光學(xué)裝調(diào)過程。

為了解決成像速度和分辨率之間的矛盾，本發(fā)明在scmos成像的基礎(chǔ)上，使用像元形成的虛擬小孔替代傳統(tǒng)共聚焦系統(tǒng)中的小孔，由多個像元組合形成虛擬小孔。

傳統(tǒng)的共聚焦系統(tǒng)特性是激光掃描一個點，探測器得到一個值，本發(fā)明提出的成像系統(tǒng)區(qū)別于傳統(tǒng)的共聚焦系統(tǒng)是得到一個探測點的子圖像。對所有掃描得到的子圖像進行組合以提升成像的分辨率。

scmos相機上每個像元可以看成一個微小孔，每個像元對熒光圖像單獨成像，且相互不影響。像元距離激發(fā)光中心的距離越遠，圖像的亮度越低。

類似于傳統(tǒng)的共聚焦系統(tǒng)，本發(fā)明在每個探測到的子圖像增加一個虛擬小孔(即窗函數(shù))，來抑制背景噪聲，提升圖像的軸向分辨率。

根據(jù)本發(fā)明提供的一種基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)，包括scmos相機，利用scmos相機12進行點對面成像。所述基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)還包括反射鏡組、激光振鏡系統(tǒng)5、第一聚光透鏡6、第二聚光透鏡7、第三聚光透鏡9、第四聚光透鏡11、分光鏡8、樣品面10；經(jīng)反射鏡組反射的激光依次通過激光振鏡系統(tǒng)5、第一聚光透鏡6、第二聚光透鏡7到達分光鏡8，得到第一分光、第二分光；所述第一分光經(jīng)過第三聚光透鏡9到達樣品面10；所述第二分光經(jīng)過第四聚光透鏡11到達scmos相機12。樣品面10經(jīng)激光激發(fā)的激發(fā)光到達scmos相機12，例如依次經(jīng)過第三聚光透鏡9、分光鏡8、第四聚光透鏡11到達scmos相機12。

傳統(tǒng)的共聚焦系統(tǒng)中將探測點的像素值直接作為掃描點的圖像，而實際上，系統(tǒng)的點擴散函數(shù)等于掃描點擴散函數(shù)乘以探測點擴散函數(shù)，如圖2所示，第二像元18接收到的熒光最有可能發(fā)自樣平面物點17，在掃描光掃描至掃描點擴散函數(shù)16位置時，第二像元18的接收熒光的是區(qū)域20。在傳統(tǒng)的共聚焦系統(tǒng)中不區(qū)分掃描點擴散函數(shù)16和第二像元18的探測點擴散函數(shù)15的相對位置，所有探測到熒光的探測點均會被分配到掃描點位置。

第二像元18探測的熒光最有可能是由樣平面物點17發(fā)出的，所以第二像元18的像素值對應(yīng)的是樣平面物點17的像素值，在scmos相機形成的子圖像中，應(yīng)將第二像元18的像素值分配到第三像元19的位置。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了對于基于scmos的共聚焦超分辨成像系統(tǒng)獲取的圖像的后處理方法，即一種基于scmos的共聚焦超分辨成像方法，如附圖4所示，包括以下方法：

步驟1：通過掃描樣本，獲取各掃描點對應(yīng)的子圖像；

步驟2：確定所述子圖像的激發(fā)光中心；

步驟3：為各子圖像添加虛擬小孔，其中，虛擬小孔是指窗函數(shù)；

步驟4：像素重分配；

步驟5：組合虛擬小孔內(nèi)像元采集到的像素形成分圖像，并對所述分圖像作去卷積處理；

步驟6：將各分圖像合成最終的圖像。

優(yōu)選地，假設(shè)共聚焦系統(tǒng)依次對樣品面進行掃描，掃描樣本共獲得n個掃描點，每個掃描點在scmos上所形成子圖像的像元個數(shù)為n1×n2，則共獲取了n×n1×n2個像素值s^ki,j(1≤k≤n,1≤i≤n1,1≤j≤n2)

n為大于等于2的正整數(shù)；

n1為大于等于2的正整數(shù)；

n2為大于等于2的正整數(shù)；

表示對應(yīng)第k個掃描點的第i行第j列的像元的像素值；

優(yōu)選地，選取各子圖像中像素值最大的像元作為激發(fā)光中心，激發(fā)光中心的行列坐標(biāo)位置為(u,v)，則：

表示對應(yīng)第k個掃描點的第m行第n列的像元的像素值；

m與n的取值范圍1≤m≤n1；1≤n≤n2。

優(yōu)選地，為各子圖像添加虛擬小孔，一般小孔函數(shù)的直徑大小可根據(jù)實際的子圖像像素數(shù)目決定。如附圖3所示，以激發(fā)光中心(圖3中白色圓點)為中心軸，7個像元為直徑，對各子圖像添加虛擬小孔，獲得窗函數(shù)圖像。

子圖像的像素矩陣為s，添加的窗函數(shù)h為：

獲得的與窗函數(shù)卷積以后的像素矩陣s1為：

s1(i,j)＝h(i,j)s(i-u,j-v)

s(i,j)表示子圖像的像素矩陣s中第i行第j列處的像素值；

h(i,j)表示窗函數(shù)h中第i行第j列處的值；

s1(i,j)表示子圖像的像素矩陣s與窗函數(shù)h卷積以后的像素矩陣s1中第i行第j列處的像素值；

s(i-u,j-v)表示子圖像的像素矩陣s中第i-u行第j-v列處的像素值。

窗函數(shù)h也即卷積函數(shù)。

優(yōu)選地，像素重分配的具體步驟為：以激發(fā)光中心像元(u,v)為中心軸，令各子圖像中的其它像元向中心軸靠攏，使得行列坐標(biāo)為(i1,j1)的像素被分配到行列坐標(biāo)(i2,j2)，則

[]表示向上取整

對于激發(fā)光中心周圍的8個像元，若分配到2個以上的像素，則對這些像素的像素值取平均值作為像元的像素值。

p為分配到位置點(i2,j2)像素個數(shù)

表示對應(yīng)第k個掃描點的第i2行第j2列的像元的像素值；

表示位置為第k個掃描點的第i2行第j2列的像元分配到的第p個像素的像素值。

優(yōu)選地，如附圖3所示，假設(shè)虛擬小孔由k個像元組成，例如k＝37，針對每個像元，由n個掃描點形成原圖像的k個分圖像：

mq表示由n個掃描點形成原圖像的第q個分圖像；

表示應(yīng)第k個掃描點的第i行第j列的像元的像素值。

這k副分圖像分辨率不同，亮度不同，但均是對原圖像的一種“復(fù)制”。運用維納濾波(wienerfiltering)對各像元形成的分圖像進行去卷積處理，并獲得相應(yīng)的點擴散函數(shù)：

{psf1,psf2,psf3,…psfk}

psfk表示第k個像元的點擴散函數(shù)。

優(yōu)選地，由虛擬小孔內(nèi)的各像元形成的分圖像合成最終的圖像時，以各個像元的點擴散函數(shù)作為權(quán)值參考，對各個分圖像進行加權(quán)求和(權(quán)值的大小受各像單元的點擴散函數(shù)影響)，獲取最終的圖像m：

fwhm()表示點擴散函數(shù)的半峰全寬值；

psfq表示第q個像元的點擴散函數(shù)；

psfm表示第m個像元的點擴散函數(shù)。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變化或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。在不沖突的情況下，本申請的實施例和實施例中的特征可以任意相互組合。