一種用于dna氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記分子及標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可用于檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記分子及標(biāo)記方法。該方法操作簡單，特異性高，可用于8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。
【背景技術(shù)】
[0002]8-輕基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxguanosine, 8-oxodG)被公認(rèn)為是最主要的DNA氧化損傷產(chǎn)物標(biāo)記物。8-OxodG的產(chǎn)生主要來自化學(xué)致癌物代謝活化或電離輻射等過程產(chǎn)生的大量活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species, R0S)對DNA脫氧鳥苷C8位置的攻擊。由于8-羥基脫氧鳥苷不僅能夠跟堿基A配對，還可以跟堿基C配對，因此在DNA的復(fù)制過程，這種損傷常常導(dǎo)致G — T的突變。如果這種損傷未能得到及時修復(fù)，就會造成基因不穩(wěn)定，進(jìn)而產(chǎn)生基因或遺傳毒性。在醫(yī)療診斷領(lǐng)域，病人尿液中8-羥基脫氧鳥苷的含量常被作為評價個體癌變危險或診斷與自由基相關(guān)疾病的生物標(biāo)記物。
[0003]科研文章中已經(jīng)有很多關(guān)于8-羥基脫氧鳥苷檢測的描述和報道。Floyd等提出的將DNA酶解后經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分離，然后利用電化學(xué)檢測器(ECD)檢測8-羥基脫氧鳥苷是一種非常有效的定量檢測方法(參見文獻(xiàn):Floyd，RA.et al.Free Radic.Res.Commun.1986，1:163-172.)。該方法具有靈敏度高，樣品需要量小，選擇性好等優(yōu)勢。但實驗操作繁瑣，而且DNA的不完全酶解可能導(dǎo)致檢測值比真實值高的結(jié)果。采用氣質(zhì)聯(lián)用分析法(GC-MS)檢測8-羥基脫氧鳥苷時，需要預(yù)先對8-羥基脫氧鳥苷進(jìn)行衍生化，而衍生化反應(yīng)很容易導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生，造成假陽性的結(jié)果(Ravanat, JL.et al.Chem.Res.Toxicol.1995,8:1039-1045.) ο單克隆抗體和ELISA方法在檢測8-羥基脫氧鳥苷時靈敏度高，重復(fù)性好，但存在交叉反應(yīng)，并且抗體的制備不容易(Osawa T.et al.0xidativeStress and Aging.Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland[C]，1995，ρρ367-374.)。近幾年關(guān)于小分子熒光探針檢測8-羥基脫氧鳥苷的研究逐漸增多。熒光探針不僅能夠檢測完整雙鏈中的受損堿基，而且還可以在活細(xì)胞中實時檢測，因此具有更大的應(yīng)用前景。Sasaki等合成了一系列可用于檢測8-羥基脫氧鳥苷的熒光探針，這類探針能夠與8-羥基脫氧鳥苷形成多個氫鍵，因此具有很高的親和力(Nakagawa, 0.et al.Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47:8983-8983.)。Burrows等發(fā)現(xiàn),8-輕基脫氧鳥苷在氧化劑的作用下可以形成一種醌類物質(zhì)，而該物質(zhì)可以特異性的與精胺發(fā)生加成反應(yīng)(Hosford, Μ.E.et al.J.Am.Chem.Soc.2004, 126:9540-9541.)。基于這個原理，約翰霍普金斯大學(xué)的Greenberg研究組合成了一種精胺-生物素(spermine-b1t1n, SB)化學(xué)標(biāo)簽。該標(biāo)簽中的精胺部分在氧化劑存的條件下可以與8-羥基脫氧鳥苷共價連接，然后利用酶標(biāo)親和素與生物素的作用，建立了一種類似酶聯(lián)免疫熒光的方法檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物(Xue，L.et al.J.Am.Chem.Soc.2007, 129:7010-7011.)。該方法具有很高的特異性和靈敏度。前期研究利用精胺生物素和釕標(biāo)親和素對8-羥基脫氧鳥苷進(jìn)行二步法特異性標(biāo)記，構(gòu)建的光電化學(xué)方法可以從520個正常堿基中檢測一個8-羥基脫氧鳥苷。該檢測中，電極上的8-羥基脫氧鳥苷在氧化劑的作用下先形成一種醌類物質(zhì)，加入精胺-生物素對該醌類物質(zhì)進(jìn)行生物素標(biāo)記，隨后加入信號分子標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素特異性結(jié)合，通過這兩步反應(yīng)完成對8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記。該方法還被用于研究DNA損傷修復(fù)酶Fpg(formamidopyrimidine[fapy]-DNA glycosylase)對 8_ 輕基脫氧鳥苷的修復(fù)作用(Zhang, BT.et al.Anal.Chem.2013，84:6048-6053.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要是針對現(xiàn)有技術(shù)以下幾個方面的不足進(jìn)行了改進(jìn):
[0005]I)現(xiàn)有色譜技術(shù)前處理過程復(fù)雜；2)現(xiàn)有色譜技術(shù)對大型儀器要求高；3)現(xiàn)有熒光和免疫檢測技術(shù)特異性不夠理想；3)現(xiàn)有傳感器技術(shù)需要二步法標(biāo)記，操作較為復(fù)雜。
[0006]為實現(xiàn)對以上方面的改進(jìn)，本發(fā)明提供了一種可用于特異性檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記分子及標(biāo)記方法。具體就是，合成一種信號標(biāo)記分子，利用它特異性共價標(biāo)記DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷，最終實現(xiàn)對DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的定量檢測。與熒光探針比較，本方法提供的信號標(biāo)記分子能夠特異性結(jié)合8-羥基脫氧鳥苷，保證檢測的準(zhǔn)確性。與前期的精胺-生物素和標(biāo)記鏈霉親和素二步法相比，本方法提供的信號標(biāo)記分子通過一步反應(yīng)就可以實現(xiàn)對DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的標(biāo)記，操作簡單。
[0007]本發(fā)明的一個方面提供了一種信號標(biāo)記分子，該分子至少含有兩個功能基團(tuán)，其中一個功能基團(tuán)可以與8-羥基脫氧鳥苷通過共價鍵連接，另一個功能基團(tuán)可以產(chǎn)生檢測信號。
[0008]本發(fā)明的第二個方面提供了所述信號標(biāo)記分子的合成方法，其包括下列步驟:
[0009](a)提供含有伯胺的功能基團(tuán)作為與8-羥基脫氧鳥苷共價連接的部分；
[0010](b)提供可以產(chǎn)生檢測信號的有機(jī)或無機(jī)功能基團(tuán)；
[0011](C)將上述兩種功能基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價連接在一起，形成信號標(biāo)記分子，用于檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷；
[0012]本發(fā)明的第三個方面提供了一種快速、簡便、有效的電化學(xué)發(fā)光檢測方法，除了本發(fā)明的第二個方面步驟外，還包括下列步驟:
[0013](d)在氧化物存在的條件下，信號標(biāo)記分子與DNA鏈中的8-羥基脫氧鳥苷共價連接;
[0014](e)測量信號標(biāo)記分子的電化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)信號的強(qiáng)弱對樣品進(jìn)行定性或定量分析；
[0015]其代表性的操作步驟是:
[0016](a)信號標(biāo)記分子的合成與純化；
[0017](b) DNA在表面的固定；
[0018](c)信號標(biāo)記分子在氧化劑存在的條件下特異性地與DNA中8-羥基脫氧鳥苷共價連接；
[0019](d)測量信號標(biāo)記分子給出的信號，根據(jù)信號的強(qiáng)弱對樣品進(jìn)行定性或定量分析。
[0020]在本發(fā)明的一個方面中，所提供的可用于檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記分子，具有如下特征:該分子至少含有兩個功能基團(tuán)，其中一個功能基團(tuán)可以與8-羥基脫氧鳥苷通過共價鍵連接，另一個功能基團(tuán)可以產(chǎn)生檢測信號。與其它化學(xué)探針比較，該信號標(biāo)記分子通過一步反應(yīng)就可以實現(xiàn)對8-羥基脫氧鳥苷的連接和信號標(biāo)記，而且反應(yīng)條件溫和，特異性好，標(biāo)記率高，非常適合8-羥基脫氧鳥苷的快速、定量檢測。與其它探針分子比較，該信號標(biāo)記分子合成簡單，易于制得。
[0021 ] 在本發(fā)明的另一個方面中，所述的信號標(biāo)記分子對DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的標(biāo)記方式為共價標(biāo)記。
[0022]在本發(fā)明的又一個方面中，氧化劑包括鐵氰化鉀、六氯銥酸鈉和六溴銥酸鈉等具有氧化特性的無機(jī)化合物。
[0023]在本發(fā)明的一個實施方案中，DNA包括末端修飾有巰基的單鏈或雙鏈多聚核苷酸。
[0024]本發(fā)明主要是提供了一種可用于檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的信號標(biāo)記分子及標(biāo)記方法，該分子通過簡單的化學(xué)反應(yīng)就可以制得。在氧化劑存在的條件下該信號標(biāo)記分子通過一步反應(yīng)即可完成對DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的連接和信號標(biāo)記，并且反應(yīng)條件溫和，特異性好，標(biāo)記率高，非常適合8-羥基脫氧鳥苷的快速、定量檢測。利用本發(fā)明的方法檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的優(yōu)點是:(I)信號標(biāo)記分子與DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷標(biāo)記之間的反應(yīng)一步完成，操作簡單、快速；(2)信號標(biāo)記分子與8-羥基脫氧鳥苷共價連接，特異性非常好；(3)信號標(biāo)記分子與DNA損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷反應(yīng)時對反應(yīng)條件的要求低，標(biāo)記率高，易于操作；(4)信號標(biāo)記分子不僅可以共價標(biāo)記雙鏈DNA中的8-羥基脫氧鳥苷也可以標(biāo)記單鏈DNA中的8-羥基脫氧鳥苷；
(5)信號標(biāo)記分子制備方法簡單，實驗成本低；(6)信號標(biāo)記分子穩(wěn)定性好，使用前現(xiàn)配，可延長試劑的保質(zhì)期。
[0025]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0026]1.一種用于DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷檢測的信號標(biāo)記