缺血性腦卒中多種生物標(biāo)志物臨床檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】
1、技術(shù)領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明涉及在缺血性腦卒中血清差異表達(dá)的多個和單個生物標(biāo)志物的鑒定和選擇與在缺血性腦卒中血清中差異表達(dá)的生物標(biāo)志物任意組合或單個標(biāo)志物的鑒定和選擇，以及選擇所述生物標(biāo)志物組合的方法。本發(fā)明還涉及生物標(biāo)志物以用于缺血性腦卒中疾病的預(yù)警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預(yù)測以及判斷預(yù)后和治療效果平價的臨床檢測用途及其試劑盒。本發(fā)明還涉及監(jiān)測干預(yù)方案效果。該發(fā)明專利屬于臨床醫(yī)學(xué)、急診醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)、實驗診斷學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域交叉學(xué)科的創(chuàng)新技術(shù)研究，
2、【背景技術(shù)】:
[0002]腦卒中是我國最常見的慢性病之一。2000年我國腦卒中死亡率在城市地區(qū)為127.96/10萬，農(nóng)村地區(qū)為115.2/10萬。每年用于卒中的治療費用400億，如果按各類危險因素人群(糖尿病患者1.36億，血脂異常2億，高血壓患者2.66億，吸煙人群3.5億，房顫患者800萬人，肥胖者7000萬人)計10.3億人次已處于腦卒中危險地帶。目前腦卒中已成為我國第一大致殘和第二大致死疾病，位于世界腦卒中發(fā)病地圖中處于“高死亡帶”。
[0003]隨著中國邁向老齡化社會的腳步不斷加快，全國> 60歲老人2億，每年因腦卒中死亡270萬，是歐美4-5倍，每年還有250萬的新發(fā)病例正以8.7%速度增長，超過⑶P的增長速度，幸存病例750萬。腦卒中的死亡率還在不斷攀升。據(jù)統(tǒng)計目前每12秒鐘就有I名腦卒中新發(fā)病者，每21秒鐘就有I人死于腦卒中[1，2]。
[0004]腦卒中病程進(jìn)展慢，但發(fā)病率、病死率和致殘率都很高，給患者、家庭、社會帶來了巨大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，對于腦卒中患者來說早期預(yù)警和診斷、評價并迅速實施干預(yù)治療是非常重要的。目前，對于急性缺血性腦卒中(AIS)的診斷主要依賴于患者的臨床表現(xiàn)和神經(jīng)影像學(xué)資料，如CT或MRI。然而CT對于缺血性腦卒中尤其是程度較輕的病例作用不大；而腦部的MRI價格昂貴、耗費時間長，且很多急診醫(yī)療部門無能力配置，同時由于一些患者自身的原因限制了 MRI的廣泛使用。因此建立蛋白質(zhì)微陣列芯片近紅外熒光標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合檢測急性缺血性腦卒中血清8種血清標(biāo)志物水平與急性缺血性腦卒中臨床評價非常重要。解決目前還尚無MR1、CT的醫(yī)療機構(gòu)對急性缺血性腦卒中病人的診療問題和影像學(xué)診斷時間窗的問題。用于腦卒中危險因素人群的篩查，以便早期干預(yù)治療，節(jié)約醫(yī)療資源。
[0005]本發(fā)明的8種血清蛋白標(biāo)志物應(yīng)用蛋白質(zhì)微陣列芯片近紅外熒光標(biāo)記技術(shù)、酶免技術(shù)、發(fā)光技術(shù)等與其配對抗原/抗體結(jié)合的原理，在固相基質(zhì)中結(jié)合此8種標(biāo)志物的單克隆抗體，捕捉被檢測血清中特異蛋白，并經(jīng)特異的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號，根據(jù)光強度的強弱對蛋白標(biāo)志物進(jìn)行定量分析；擬研發(fā)的蛋白質(zhì)微陣列芯片試劑盒將解決目前缺血性腦卒中診斷方法主要依賴MR1、CT、成本高、時間窗長等局限性問題，為這一重大疾病的預(yù)警和早期診斷提供技術(shù)支撐。該試劑盒的問世給缺血性腦卒中的早期預(yù)警、早期臨床診斷和早期干預(yù)治療提供幫助，對于降低醫(yī)療費用，提高診療率和生存質(zhì)量具有明顯的社會經(jīng)濟(jì)意義。為解決目前還沒有MRI和CT檢查設(shè)備的中小醫(yī)院、社區(qū)衛(wèi)生院提供更好的診斷工具，縮短缺血性腦卒中的診斷時間，為其救治爭取更多的機會，從而加強對腦卒中的三級預(yù)防防控措施產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。該試劑盒的問世也填補了國內(nèi)尚無用于缺血性腦卒中(AIS)特異性的臨床實驗室診斷工具。
3、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及SHIP-1，IGF-1, SDPR, MBL, I CAM-1, Hs-CRP, LP (a)，MMP-9 芯片臨床診斷試劑，除Hs-CRP生化試劑外的其余項目的任意組合或單味的任意方法學(xué)的臨床診斷試劑和方法學(xué)包含在權(quán)利要求書1-6項，以及8種血清蛋白標(biāo)志物的鑒定和選擇及其生物標(biāo)志物任意組合的鑒定和選擇，所述8種血清蛋白標(biāo)志物在血液中差異表達(dá)并可用于缺血性腦卒中疾病的預(yù)警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預(yù)測以及判斷預(yù)后和治療效果平價的臨床檢測。本發(fā)明生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物組合的測定結(jié)果被用于缺血性腦卒中的預(yù)警、診斷及判斷預(yù)后。為了測定本發(fā)明生物標(biāo)志物的血清表達(dá)量，所述的8種生物標(biāo)志物的任意組合和所述方法學(xué)研發(fā)的臨床應(yīng)用試劑盒及其用途均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明還包括所述8種生物標(biāo)志物的抗原和其對應(yīng)抗體的制備方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的生物標(biāo)志物的鑒定方法。
[0007](I)利用基因擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建工程菌以獲得8種蛋白的純化抗原和抗原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
[0008](2)利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)8種蛋白的特異性單克隆抗體(含二抗的單抗和多抗，人源的和合成的)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
[0009](3)將8種血清蛋白標(biāo)志物的配對抗體，應(yīng)用蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)和抗原抗體結(jié)合的原理，在固相基質(zhì)中結(jié)合此8種標(biāo)志物的配對單克隆抗體，捕捉被檢測血清中特異蛋白，并經(jīng)特異的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號，根據(jù)光強度的強弱對蛋白標(biāo)志物進(jìn)行定量分析。
[0010](4)試制蛋白質(zhì)微陣列芯片臨床診斷試劑盒，分析病例組和條件匹配的對照組，確定檢測結(jié)果與急性缺血性腦卒中診斷的符合程度，確定該試劑對于疾病早期預(yù)警和早期診斷的時間敏感性和特異性
[0011]4、原材料質(zhì)量控制
[0012]A、進(jìn)行反應(yīng)模塊的研究及蛋白芯片最佳反應(yīng)模塊；
[0013]B、對抗體稀釋緩沖液、芯片封閉液體系進(jìn)行研究及最佳配制方案；
[0014]C、進(jìn)行抗體點樣量的研究及抗體點樣時稀釋方案設(shè)計原則；
[0015]D、對蛋白芯片點樣生產(chǎn)工藝及蛋白芯片點樣生產(chǎn)工藝流程；
[0016]E、對蛋白芯片裝配工藝及蛋白芯片裝配工藝流程及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
[0017]5、反應(yīng)液體系生產(chǎn)
[0018]I)濃縮洗滌液的生產(chǎn):
[0019]2)反應(yīng)體系的確定:
[0020]3)廣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定:
[0021]4)產(chǎn)品性能評估
[0022]A、分析靈敏度:達(dá)到pg/ml水平；
[0023]B、檢測信號線性范圍:106數(shù)量級；
[0024]C、檢測濃度線性范圍:104數(shù)量級；
[0025]D、檢測準(zhǔn)確性:90%?110% ;
[0026]E、檢測精密性:小于15% ；
[0027]F、熒光檢測分辨力小于50um;
[0028]G、探測靈敏度:0.2熒光分子/um2 ；
[0029]H、準(zhǔn)確度:90%?110% ；
[0030]1、分析靈敏度:小于各指標(biāo)l/10cutoff值濃度；
[0031]J、檢測濃度線性范圍:0.5cutoff?50cutoff值濃度；
[0032]K、檢測精密性:小于15% ；
[0033]L、臨床靈敏度:大于80% ；
[0034]M、臨床特異度:大于90 %。
6、【具體實施方式】:
[0035]本發(fā)明涉及從血液中鑒定和選擇在缺血性腦卒中患者與正常人之間差異表達(dá)和可單獨和聯(lián)合用于診斷的試劑。如此，本發(fā)明涉及能用于檢測和監(jiān)測生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物組合的差異蛋白表達(dá)以用于缺血性腦卒中疾病的預(yù)警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預(yù)測以及判斷預(yù)后和治療效果平價的臨床檢測。本發(fā)明還涉及鑒定特別有用的生物標(biāo)志物各組合的方法。
[0036]I)定義除非另外指明，本發(fā)明的實施將利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，它們在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已被解釋。
[0037]2)本發(fā)明所述的缺血性腦卒中患者血清8種生物標(biāo)志物的任意組合和方法學(xué)技術(shù)均經(jīng)引用并入本文。
[0038]3)本文設(shè)計的“擴(kuò)增”為分子生物學(xué)范圍
[0039]4)本文涉及的“微陣列”包括固定到固相支持物上的一組特異性蛋白，或一組對應(yīng)的特異性抗體以獲得缺血性腦卒中診斷的相同結(jié)果。
[0040]5)術(shù)語“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合片段。本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”(或簡稱“抗體部分”或“片段”)表示保留特異性結(jié)合多肽能力的全長抗體的一個或多個片段
[0041]6)本文所用術(shù)語“生物標(biāo)志物”表示在缺血性腦卒中患者個體和正常個體(無缺血性腦卒中個體)之間受差異調(diào)節(jié)的蛋白。
[0042]7)本文所用術(shù)語“差異表達(dá)”表示與對照樣品中相同的一種或多種本發(fā)明生物標(biāo)志物的表達(dá)水平比較
[0043]8)適用于本發(fā)明的可檢測標(biāo)記物包括可以通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電、光或化學(xué)手段檢測的任何組分?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記物包括用標(biāo)記的鏈親合素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠、熒光染料(如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標(biāo)記物(如3H、1251、35S、14C或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色標(biāo)記物如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。檢測這些標(biāo)記物的手段對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
[0044]9)在一個優(yōu)選實施方案中,用于比較的一種或多種樣品用產(chǎn)生可區(qū)分檢測信號的不同的突光染料標(biāo)記，不同標(biāo)記的革G樣品同時雜交到同一微陣列上。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白樣品將包括一種或多種對照分子，它們與微陣列上的特異性抗原或抗體結(jié)合以標(biāo)準(zhǔn)化微陣列產(chǎn)生的信號。優(yōu)選的是，標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化蛋白樣品是與上述點到微陣列上的特異性抗原或抗體完全對應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)化對