一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]GST標(biāo)簽是來自日本血吸蟲中的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶蛋白，其結(jié)構(gòu)非常保守。在基因工程中，蛋白質(zhì)的表達(dá)經(jīng)常用到各種融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其中就包括GST標(biāo)簽表達(dá)體系，其具有蛋白表達(dá)產(chǎn)率高、表達(dá)產(chǎn)物純化方便以及利于抗體制備等優(yōu)點，目前已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因時，對融合表達(dá)產(chǎn)物的檢測非常重要。目前常用的檢測谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽蛋白的方法是Western blot和ELIESA，但周期較長且靈敏度不高。因此，研究開發(fā)一種快速、靈敏、檢測成本低的檢測方法成為科學(xué)家們的強(qiáng)烈需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對目前對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶檢測不方便、耗時長、檢測成本高等現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，而提供一種電化學(xué)納米免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無需對樣品進(jìn)行純化、富集等預(yù)處理，操作簡單，檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，能夠用于對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行快速定量檢測。
[0004]本發(fā)明提供下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種電化學(xué)納米免疫傳感器，所述傳感器以海藻酸鈉為橋聯(lián)劑將納米金和辣根過氧化物酶固定于電極表面，所述納米金吸附有抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體。
[0006]所述抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體為本領(lǐng)域常規(guī)，其來源和類型均沒有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0007]所述電極可以是本領(lǐng)域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是:前述電化學(xué)納米免疫傳感器的制備方法，其包括如下步驟:
[0009](1)對電極進(jìn)行預(yù)處理，然后在電極上包被由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液；
[0010](2)繼續(xù)在電極上包被抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體；
[0011](3)封閉液封閉后即得。
[0012]步驟(1)為對電極進(jìn)行預(yù)處理，然后在電極上包被由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液。
[0013]其中，所述電極可以是本領(lǐng)域常規(guī)所述的各類電極，優(yōu)選玻碳電極(glassycarbon electrode，GCE)。
[0014]如本領(lǐng)域常規(guī)，所述包被為將電極置于溶液中進(jìn)行包被或者將包被溶液滴涂于電極表面。優(yōu)選地，所述包被為將電極置于由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液中進(jìn)行包被，或者將由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液滴涂于電極表面。
[0015]所述海藻酸鈉(Sodium alginate, SA)溶液優(yōu)選以如下方法制得:將海藻酸鈉溶于水得到海藻酸鈉溶液，備用。更優(yōu)選地，將2g海藻酸鈉溶于100mL雙蒸水中，得到2%的海藻酸鈉溶液，備用。
[0016]所述納米金(AU)溶膠優(yōu)選以如下方法制得:取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8_10min，待自然冷卻后用超純水補充至104mL，即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0017]所述辣根過氧化物酶溶液優(yōu)選以如下方法制得:將辣根過氧化物酶(HRP)溶于磷酸緩沖液(PBS)中，即得辣根過氧化物酶溶液。更優(yōu)選地，將0.02g辣根過氧化物酶(HRP)溶于10mL 0.01M pH值為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，即得2.0g/L辣根過氧化物酶溶液。
[0018]所述封閉液為免疫檢測領(lǐng)域常規(guī)的封閉液，優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。
[0019]所述抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體為本領(lǐng)域常規(guī)，其來源和類型均沒有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體，更優(yōu)選Balb/c小鼠單克隆抗體，且純化后抗體的濃度不低于0.5mg/mL。
[0020]在所述包被的操作過程中，如本領(lǐng)域常規(guī)，一般都需要經(jīng)過恒溫孵育和清洗的步驟。
[0021]在所述封閉的操作過程中，如本領(lǐng)域常規(guī)，一般也需要經(jīng)過恒溫孵育和清洗的步驟。
[0022]所述制備方法較佳地包括如下步驟:
[0023](1)將玻碳電極預(yù)處理后，取由海藻酸鈉溶液、納米金溶膠和辣根過氧化物酶溶液組成的混合溶液滴涂于處理后的玻碳電極表面，置于4°C冰箱自然干燥24h后，浸于質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%的CaCl2溶液中5min固化成膜，超純水清洗至洗出水在600nm下無吸光值，除去玻碳電極表面的CaCl2溶液，得到SA/HRP/AU/GCE傳感電極；
[0024](2)將SA/HRP/AU/GCE傳感電極置于純化的抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)單克隆抗體溶液中，4°C自組裝至少24h，得到GST/SA/HRP/AU/GCE傳感電極；
[0025](3)最后將GST/SA/HRP/AU/GCE傳感電極置于濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液中，37°C溫育至少lh，以封閉非特異性位點，再以含體積百分比為0.05% Tween-20的磷酸緩沖液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白，自然晾干即得谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)納米免疫傳感器。
[0026]本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法，原子力顯微鏡等表征電極組裝的各個階段。利用電流時間曲線法等方法可以實現(xiàn)對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的定量檢測，實驗結(jié)果表明該傳感器靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術(shù)參數(shù)均良好。
[0027]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是:前述電化學(xué)納米免疫傳感器的在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶檢測中的應(yīng)用。
[0028]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0029]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0030]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0031]本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器不受樣品的濁度、顏色的影響，無需對樣品進(jìn)行純化、富集等預(yù)處理，操作簡單，檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠用于對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行快速定量檢測，且靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及使用壽命等技術(shù)參數(shù)均良好，具有非常好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明的電化學(xué)納米免疫傳感器的結(jié)構(gòu)圖，其中，由下往上，GCE指玻碳電極層，SA/HRP/AU指海藻酸鈉/辣根過氧化物酶/納米金層，Ant1-GST指抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗體層，BSA指封閉液牛血清白蛋白。
【具體實施方式】
[0033]以下實施例用于說明本發(fā)明，但并不用來限制本發(fā)明的范圍。下述各實施例中，所使用的各類設(shè)備、試劑和材料若無特別說明，均為常規(guī)市售可得。
[0034]實施例1電化學(xué)納米免疫傳感器的制備
[0035]1、玻碳電極的預(yù)處理:
[0036]將玻碳電極依次分別用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μ m粒徑的α _Α1203漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HN0#P Η 20按體積比1: 1配制的混合液、無水乙醇和超純水清洗。在lmol/L H2S04溶液中用掃描范圍為1.0?一 1.0V，掃描速度為100mV/S的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。上述穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線滿足下述要求:在實驗室條件下預(yù)處理后的電極的循環(huán)伏安曲線的峰電位差應(yīng)在80mV以下，并盡可能地接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環(huán)境中干燥待用。
[0037]2、納米金(Nano-Au)溶膠的制備:
[0038]根據(jù)Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的梓檬酸鈉溶液4mL混勻，置于微波爐中低火保持8-10min，待其自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存?zhèn)溆谩＠梅止夤舛扔媽λ苽涞募{米金溶膠在可見光范圍內(nèi)(400_700nm)進(jìn)行掃描，光吸收性膠