一體化樣品預(yù)處理裝置及方法
【專利說明】一體化樣品預(yù)處理裝置及方法
[0001]本發(fā)明為分案申請，其母案的申請?zhí)枮?01210244790.9，申請日為2012年7月12日且發(fā)明名稱為“一體化樣品預(yù)處理裝置及方法”。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
本申請請求享有2011年7月13日提交的序列號(hào)為61/507,240的美國臨時(shí)申請和2012年5月18日提交的序列號(hào)為61/648，631的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)，兩個(gè)申請的公開內(nèi)容通過引用并入到本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及一體化樣品預(yù)處理裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0004]離心過濾器可用于為了濃縮、脫鹽、純化和分餾的目的而分離生物物質(zhì)，如抗體酶、核酸和蛋白質(zhì)。這些裝置最常用在離心分離器儀器中，離心分離器儀器可由固定角轉(zhuǎn)子構(gòu)造或擺動(dòng)角轉(zhuǎn)子構(gòu)造或可變角轉(zhuǎn)子構(gòu)造構(gòu)成。過濾過程的速度和滯留物樣品的回收對(duì)于用戶而言非常有價(jià)值。通過除去膜囊(持樣器)且使樣品在收納管中反向轉(zhuǎn)動(dòng)，通常會(huì)獲得高于85%的樣品回收值。
[0005]這些裝置通常用于濃縮尿液、血清、血漿和腦脊髓液。例如，尿液中的特定蛋白質(zhì)的測量結(jié)果對(duì)于各種疾病狀態(tài)的診斷和處理可能很重要，但尿液中的這些蛋白質(zhì)的含量通常很小而不能在沒有首先濃縮蛋白質(zhì)的情況下檢測出。常規(guī)裝置大體上包括殼體，殼體具有樣品儲(chǔ)槽；過濾器，過濾器密封在殼體中，以便樣品在受到驅(qū)動(dòng)力(如，離心作用)時(shí)必須穿過過濾器；以及用于收集濃縮樣品的收集室。
[0006]存在一類蛋白質(zhì)純化規(guī)程，該規(guī)程使用抗原-蛋白質(zhì)親和來將相關(guān)的蛋白質(zhì)從混合樣品(如細(xì)胞溶解產(chǎn)物或血清)分離。該規(guī)程通常使用較小珠粒，珠粒與抗體共軛，使得它們結(jié)合至來自于樣品的特定蛋白質(zhì)。一旦蛋白質(zhì)有效地結(jié)合到珠粒上，則需要從珠粒中提取和收集蛋白質(zhì)(抽提物)來用于下游的分析、化驗(yàn)研究等。示例性的下游分析技術(shù)包括2D凝膠電泳和質(zhì)譜分析。
[0007]存在在工藝流程中需要的大量處理步驟。這些步驟可包括在結(jié)合之前使珠粒與中性緩沖劑平衡、在結(jié)合之后清洗珠粒來除去未結(jié)合的污染物、抽提相關(guān)的蛋白質(zhì)、從抽提出的蛋白質(zhì)中交換緩沖劑、濃縮最終稀釋的樣品以及最后回收純化的蛋白質(zhì)樣品。對(duì)于親和純化和免疫沉淀規(guī)程，結(jié)合到珠粒上的蛋白質(zhì)是相關(guān)的蛋白質(zhì)。對(duì)于去除規(guī)程，未結(jié)合的部分(未結(jié)合至珠粒的蛋白質(zhì))為相關(guān)的樣品。
[0008]在這些純化方法中使用的珠粒為磁性的或非磁性的。一種最常用的非磁性珠粒為瓊脂糖。磁性珠粒是可從EMD Millipore市售獲得，如用于從血清中進(jìn)行蛋白和IgG去除的PureProteome蛋白質(zhì)A&G、PureProteome白蛋白和PureProteome白蛋白和IgG，用于染色體免疫沉淀的Magna ChIP蛋白質(zhì)A珠粒以及用于His標(biāo)記重組純化的PureProteome鎳磁性珠粒。
[0009]當(dāng)用磁性珠粒工作時(shí)，當(dāng)前人工方法依靠使用移液管來往返于樣品管(緩沖劑等)移動(dòng)液體，且將樣品從一個(gè)裝置移動(dòng)至另一個(gè)。磁鐵用于將珠粒保持在樣品管的一側(cè)，以便使用者可在不干擾珠粒的情況下吸出緩沖劑。在通常的結(jié)合/清洗/抽提工藝流程中，每個(gè)樣品有大約8個(gè)移液步驟。
[0010]對(duì)于與珠粒結(jié)合的最佳蛋白質(zhì)，對(duì)這些方法需要孵育。包含珠粒和樣品的裝置通常在立式圓筒形混合機(jī)中轉(zhuǎn)動(dòng)10至30分鐘，或放置在振蕩器(例如，漩渦振蕩器)中振蕩10至30分鐘。當(dāng)添加新緩沖劑如清洗緩沖劑和抽提緩沖劑時(shí)，使用者將使裝置旋動(dòng)一分鐘左右來混合和清洗。
[0011]清洗和抽提步驟需要重復(fù)若干次，以便有效。例如，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在于將清洗緩沖劑加至樣品瓶，旋動(dòng)(混合)一分鐘左右，除去緩沖劑且重復(fù)兩次或多次。在磁性珠粒的情況下，結(jié)合/清洗/抽提過程花費(fèi)大約45分鐘。
[0012]磁性珠粒的備選方案為瓊脂糖珠粒。使用瓊脂糖珠粒的一種可市售獲得的裝置包括帶有開口底部和定位在開口底部上的多孔玻璃料(porous frit)的管。臺(tái)式離心機(jī)用于驅(qū)動(dòng)流體穿過玻璃料且進(jìn)入收集管(通常地為4mL或15mL的管)中，從而代替使用移液管從樣品管除去流體。玻璃料的孔徑選擇成用以保持珠粒，同時(shí)允許緩沖劑和蛋白質(zhì)穿過。
[0013]取決于使用的轉(zhuǎn)動(dòng)柱的尺寸，該工藝流程相比于使用磁性珠粒的方法可能很麻煩且耗時(shí)。臺(tái)式離心機(jī)通常為定位在公共場所處的設(shè)備的共用件；這不同于各使用者可在其工作區(qū)域處已經(jīng)擺放的微離心機(jī)。
[0014]該過程需要每個(gè)樣品有16個(gè)移液步驟，且花費(fèi)大約1小時(shí)來完成。
[0015]對(duì)于磁性工藝流程和瓊脂糖工藝流程兩者而言，下游步驟可包括交換載體緩沖劑和濃縮稀釋的樣品。在期望樣品的緩沖劑交換，或許用以除去抽提物(如咪唑)的情況下，通常用夾具等將樣品轉(zhuǎn)移至透析膜管，當(dāng)通過擴(kuò)散的方式逐漸地交換緩沖劑時(shí)，透析膜管然后就放置在交換緩沖劑的槽內(nèi)達(dá)到24小時(shí)。
[0016]在期望緩沖劑交換和濃縮的情況下，可使用透析過濾/蛋白質(zhì)濃縮裝置，如帶有多孔UF膜的離心裝置，多孔UF膜的尺寸確定為用以保持蛋白質(zhì)，但允許緩沖劑穿過。通過控制轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間和選擇適合的裝置設(shè)計(jì)，可控制最終濃度。為了使緩沖劑交換有效，緩沖劑交換步驟需要重復(fù)兩次或三次(像用清洗步驟和抽提步驟完成的那樣)。這些裝置花費(fèi)30至45分鐘，且需要在離心機(jī)中進(jìn)行若干次轉(zhuǎn)動(dòng)。在可由EMD Millipore市售獲得的AmiconUltra裝置中，有5個(gè)移液步驟用于緩沖劑交換和濃縮。
[0017]當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品的體積變得較小時(shí)，由裝置內(nèi)的滯留體積造成的不期望的樣品的潛在損失已經(jīng)變得比平常更重要。當(dāng)前數(shù)據(jù)間接表明50 μ L的濃縮樣品中的10 μ L的損失表示80%的蛋白質(zhì)回收。如果蛋白質(zhì)損失從10 yL至1 μπι減小了一個(gè)數(shù)量級(jí)，則蛋白質(zhì)樣品回收可從80%增大至98%。蛋白質(zhì)樣品回收中的18%的改善可能很有價(jià)值。
[0018]將期望的是，提供一種裝置和方法，該裝置和方法高效地且有效地執(zhí)行結(jié)合和清洗、緩沖劑交換和濃縮和/或在單個(gè)裝置中進(jìn)行完整的結(jié)合、清洗和抽提、緩沖劑交換和濃縮，而不需要移液管在裝置之間轉(zhuǎn)移貴重的樣品，特別是對(duì)于大小達(dá)到大約llmL的樣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]通過本文公開的實(shí)施例已經(jīng)克服了現(xiàn)有技術(shù)的問題，在某些實(shí)施例中，本文包括一種樣品預(yù)處理裝置，該樣品預(yù)處理裝置允許結(jié)合和清洗、緩沖劑交換和濃縮，和/或在沒有在若干裝置之間轉(zhuǎn)移樣品的情況下執(zhí)行完整的結(jié)合、清洗、抽提、緩沖劑交換和濃縮過程。根據(jù)某些實(shí)施例，提供了一種離心裝置，其包括儲(chǔ)槽，儲(chǔ)槽具有入口、用于保持介質(zhì)(如珠粒填充床)的柱、用于以密封關(guān)系收納過濾裝置的支座區(qū)以及出口。根據(jù)某些實(shí)施例，過濾裝置包括具有樣品儲(chǔ)槽的殼體、設(shè)置在殼體中的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))大致垂直地定向的膜(在存在一個(gè)以上的情況下間隔開)、與各膜相關(guān)聯(lián)的暗溝，使得穿過各膜的流體流過相應(yīng)的暗溝進(jìn)入濾液收集室中。過濾裝置插入離心裝置的支座區(qū)中，且該組件可放置在可選的支座中。具有或沒有可選的支座的組件可放置在用于離心作用的常規(guī)離心管中?？稍跊]有任何移液管轉(zhuǎn)移(和相關(guān)樣品損失)的情況下用該裝置執(zhí)行整個(gè)結(jié)合、清洗、抽提、緩沖劑交換和濃縮步驟，從而導(dǎo)致較好的相關(guān)樣品的回收。該樣品預(yù)處理裝置還可用于結(jié)合和清洗步驟，在此情況下，不需要過濾裝置，且該樣品預(yù)處理裝置還可用于緩沖劑交換和濃縮步驟，在此情況下，不需要介質(zhì)?？稍谙嗤难b置中執(zhí)行若干次緩沖劑交換。
[0020]根據(jù)某些實(shí)施例，該裝置可包括可收縮的供給管，以便有助于減少累積在供給管的內(nèi)部潤濕開孔和外表面上的樣品溶液的損失。
[0021]根據(jù)某些實(shí)施例，樣品與介質(zhì)在裝置中的適當(dāng)位置上進(jìn)行孵育，以便所選擇的目標(biāo)結(jié)合到介質(zhì)上。然后，可清洗掉剩余的未結(jié)合的樣品。通過添加緩沖劑從介質(zhì)中抽提相關(guān)的目標(biāo)樣品來使樣品純化，緩沖劑導(dǎo)致介質(zhì)將獲取的目標(biāo)釋放回溶液中。一旦純化樣品，則樣品可濃縮成可使用的濃度來用于分析或儲(chǔ)存(大多數(shù)蛋白質(zhì)在接近lmg/ml的濃度下儲(chǔ)存時(shí)最穩(wěn)定)。
[0022]根據(jù)某些實(shí)施例，樣品預(yù)處理裝置可包括偏壓部件或隔膜，可促動(dòng)偏壓部件或隔膜來從裝置中抽出較小數(shù)量(value)的樣品(例如，滯留體積)。
[0023]該樣品預(yù)處理裝置導(dǎo)致用于結(jié)合和清洗、緩沖劑交換和/或結(jié)合、清洗、抽提和濃縮規(guī)程的總體時(shí)間的節(jié)省。不需要樣品移液，從而導(dǎo)致較高的樣品回收。利用用于各緩沖劑交換和清洗步驟的單個(gè)離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)步驟，而非先前需要的若干次轉(zhuǎn)動(dòng)步驟，緩沖劑交換就可在大致可能比先前少的時(shí)間內(nèi)執(zhí)行。不需要結(jié)合孵育周期。
[0024]根據(jù)某些實(shí)施例，過濾裝置與交換室之間的組裝界面可允許相對(duì)的移動(dòng)或分離，如通過機(jī)械構(gòu)件(如物理止擋件)或通過自促動(dòng)幾何結(jié)構(gòu)，自促動(dòng)幾何結(jié)構(gòu)受到離心壓力梯度來除去與獲取的目標(biāo)接合的末梢來優(yōu)化樣品回收。
[0025]用所公開的裝置和方法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于縮短用于親和分離過程的孵育時(shí)間；改善一個(gè)裝置平臺(tái)中的樣品濃縮；改善使用反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)出離心裝置的樣品回收；以及改善單次轉(zhuǎn)動(dòng)緩沖劑交換稀釋。
【附圖說明】
[0026]圖1為根據(jù)某些實(shí)施例的儲(chǔ)槽/交換部件的截面形式的透視圖；
圖1B為根據(jù)某些實(shí)施例的包含預(yù)先填充珠粒柱的儲(chǔ)槽/交換部件的截面形式的透視圖；
圖2為根據(jù)某些實(shí)施例的儲(chǔ)槽/交換部件和過濾裝置