一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。所述制備方法包括以下步驟：1)將胖大海對(duì)半縱切；2)對(duì)半縱切后的胖大海在37～65℃烘干72～168h；3)將步驟2得到的胖大海進(jìn)行種皮和子葉分離；4)將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內(nèi)進(jìn)行鋨酸熏染；5)熏染后的樣品在通風(fēng)廚中通風(fēng)15～30min使樣品表面殘存鋨酸揮發(fā)；6)將步驟5得到的樣品放入真空干燥器干燥2～4h；7)用鑷子輕夾取樣品的側(cè)面，保證觀察面向上，使用導(dǎo)電膠按順序?qū)悠防喂陶吃诮饘贅悠放_(tái)上，放入離子濺射儀中進(jìn)行噴金鍍膜及掃描電鏡觀測(cè)采圖。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制成的樣品中保持胖大海較完整的外觀形態(tài)，掃描電鏡觀察時(shí)組織結(jié)構(gòu)清晰，圖像立體感強(qiáng)，具有高效、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
_種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及掃描電鏡樣品的制備方法，具體是一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]梧桐科植物干燥成熟種子胖大海具有清熱潤肺，利咽解毒，潤腸通便等作用，是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材。由于其具有較強(qiáng)的吸水膨脹特性，近年來還在滲透活性和推動(dòng)劑等藥劑學(xué)研究領(lǐng)域引起重視。通過對(duì)胖大海超微結(jié)構(gòu)的分析研究，對(duì)于深度挖掘其在生物醫(yī)學(xué)研究中的作用具有重要意義。
[0003]由于胖大海具有強(qiáng)的吸水膨脹特性，常規(guī)的掃描電鏡樣品制備時(shí)使用戊二醛固定液浸泡固定會(huì)使胖大海膨脹，外層種皮破裂，剝離脫落，中層和內(nèi)層種皮剝離，在后續(xù)漂洗、脫水等制備過程中容易破損和丟失，影響整體結(jié)構(gòu)的觀察和分析。
[0004]掃描電鏡技術(shù)是使用高能電子束對(duì)樣品表面進(jìn)行轟擊，樣品被激發(fā)發(fā)射二次電子成像，獲得比光學(xué)顯微鏡觀察更精細(xì)的樣品結(jié)構(gòu)特征，是醫(yī)學(xué)生物研究的重要手段。傳統(tǒng)的生物樣品掃描電鏡標(biāo)本制備須使樣品內(nèi)的游離水分充分置換出來，以免在掃描電鏡觀察時(shí)樣品因電子束轟擊產(chǎn)生水蒸氣遭遇高能電子流電離而放電，導(dǎo)致圖像模糊、霧狀，甚至無法成像的現(xiàn)象。因此，樣品的干燥程度成為成功制備掃描電鏡樣品的關(guān)鍵因素。
[0005]鋨酸是一種非電解質(zhì)強(qiáng)氧化劑，作為生物樣品的固定劑，能與各種氨基酸、肽及蛋白質(zhì)反應(yīng)，在蛋白質(zhì)分子間形成交聯(lián)，使蛋白質(zhì)分子固定，還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，通過形成鋨酸二酯鍵，使脂肪得以固定。鋨酸有較強(qiáng)的電子染色作用，經(jīng)過鋨酸固定的樣品圖像有較好的反差，是電鏡技術(shù)中廣泛使用的優(yōu)良固定劑，但鋨酸有劇毒且易升華揮發(fā)，對(duì)眼、鼻、喉粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用，容易對(duì)人體和環(huán)境造成污染傷害。
[0006]由于胖大海獨(dú)特的吸水膨脹特性，導(dǎo)致在常規(guī)樣品制備過程中需要消耗大量的戊二醛和鋨酸固定液，而戊二醛和鋨酸為揮發(fā)性毒性試劑，不僅大大增加了實(shí)驗(yàn)成本，也容易對(duì)操作人員和環(huán)境造成更大的污染。
[0007]目前，對(duì)胖大海顯微結(jié)構(gòu)方面的研究技術(shù)尚不成熟，傳統(tǒng)的掃描電鏡樣品制備技術(shù)尚難以通過進(jìn)行常規(guī)的固定、漂洗和脫水等而獲得胖大海結(jié)構(gòu)完整的樣品，在掃描電鏡下觀察時(shí)存在胖大海結(jié)構(gòu)破損的問題，而不固定和染色的樣品在觀察時(shí)則存在圖像不清晰的問題。因此，在國家自然科學(xué)基金(N0.81560608)、廣西自然科學(xué)基金(N0.2015GXNSFA139123)、廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金(N0.GXMUYSF2014022)廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金的資助下，本課題組對(duì)胖大海掃描電鏡制樣技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使得胖大海較完整的組織超微結(jié)構(gòu)得到更好的呈現(xiàn)，解決了胖大海在常規(guī)掃描電鏡制樣過程中固定、漂洗和脫水過程中所出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)破壞丟失以及非固定染色樣品采集圖像不清晰等問題。同時(shí)也對(duì)解決該技術(shù)在應(yīng)用于其他研究領(lǐng)域時(shí)所出現(xiàn)的類似問題提供一定的參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法。
[0009]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0010]一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，按以下步驟操作:
[0011]1.將胖大海對(duì)半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向?qū)Π肫书_，避免兩片子葉的破損。
[0012]2.將步驟I縱向?qū)Π肫是泻蟮呐执蠛Ｔ?7?65°C烘干72?168h。
[0013]3.將步驟2得到的胖大海進(jìn)行種皮和子葉分離，得到樣品。
[0014]4.將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內(nèi)進(jìn)行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質(zhì)量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品O
[0015]5.將步驟4熏染后的樣品在通風(fēng)廚中通風(fēng)15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發(fā)，得到無殘存鋨酸的樣品。
[0016]6.將步驟5無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品。
[0017]7.用鑷子輕夾取步驟6樣品的側(cè)面，保證觀察面向上，使用導(dǎo)電膠按順序?qū)悠防喂陶吃诮饘贅悠放_(tái)上，放入離子濺射儀中進(jìn)行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時(shí)間總長3?5min，在總噴金時(shí)間內(nèi)分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm。掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)采圖。
[0018]上述步驟3中對(duì)步驟2得到的胖大海子葉側(cè)沿施加適當(dāng)壓力，使干燥后的種皮與子葉實(shí)現(xiàn)鈍性分離并避免破裂。
[0019]上述步驟4中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發(fā)蒸汽進(jìn)行熏染，熏染后可進(jìn)行鋨酸的回收和再利用。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)或有益效果:
[0021]1.本發(fā)明通過將胖大海沿著胚軸縱向?qū)Π肫书_，并對(duì)剖開后的種子進(jìn)行烘干干燥，能夠使外層種皮包裹下的中層種皮、內(nèi)層種皮和子葉組織內(nèi)的水分進(jìn)一步充分蒸發(fā)，利于后續(xù)的掃描電鏡樣品制備。
[0022]2.本發(fā)明解決了胖大海進(jìn)行掃描電鏡樣品制備過程中，戊二醛和鋨酸固定液使用量大、毒性揮發(fā)性試劑容易揮發(fā)對(duì)人體和環(huán)境造成污染、固定液浸泡導(dǎo)致胖大海吸水膨脹，種皮破裂、剝離以致在后續(xù)制備過程中容易缺損和丟失、影響種子整體結(jié)構(gòu)的觀察、樣品脫水不充分在電子束轟擊產(chǎn)生水蒸氣遭遇高能電子流電離放電導(dǎo)致圖像模糊、霧狀，甚至無法成像的現(xiàn)象等問題。
[0023]3.本發(fā)明對(duì)烘干后的種子進(jìn)行鋨酸的熏染并在熏染后進(jìn)行鋨酸的回收，不僅大大減少了劇毒物質(zhì)鋨酸的使用，減少了其對(duì)人體和環(huán)境的影響，也通過使用鋨酸熏染對(duì)種子含有的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分進(jìn)行了固定，有利于組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保存，減少了樣品在處理過程中的變形，增強(qiáng)了種子掃描電鏡成像的反差。
[0024]4.本發(fā)明使最后得到的樣品結(jié)構(gòu)完整，無明顯破損、丟失現(xiàn)象，樣品結(jié)構(gòu)清晰可現(xiàn)，圖像立體感強(qiáng)。
【附圖說明】
[0025]圖1是采用本發(fā)明制備方法得到的胖大海外層種皮的掃描電鏡圖像。
[0026]圖2是圖1中的掃描電鏡圖像進(jìn)一步放大后的圖像。
[0027]圖3是采用本發(fā)明制備方法得到的子葉內(nèi)表面的掃描電鏡圖像。
[0028]圖4是圖3中的掃描電鏡圖像進(jìn)一步放大后的圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0030]一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，按以下步驟操作:
[0031 ] 1.將胖大海對(duì)半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向?qū)Π肫书_，避免兩片子葉的破損。
[0032]2.將步驟I縱向?qū)Π肫是泻蟮呐执蠛Ｔ?7?65°C烘干72?168h。
[0033]3.將步驟2得到的胖大海進(jìn)行種皮和子葉分離，得到樣品。
[0034]4.將步驟3得到的樣品放入熏染裝置內(nèi)進(jìn)行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質(zhì)量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品O
[0035]5.將步驟4熏染后的樣品在通風(fēng)廚中通風(fēng)15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發(fā)，得到無殘存鋨酸的樣品。
[0036]6.將步驟5無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品。
[0037]7.用鑷子輕夾取步驟6樣品的側(cè)面，保證觀察面向上，使用導(dǎo)電膠按順序?qū)悠防喂陶吃诮饘贅悠放_(tái)上，放入離子濺射儀中進(jìn)行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時(shí)間總長3?5min，在總噴金時(shí)間內(nèi)分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm。掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)采圖，得到的樣品圖像如圖1、圖2、圖3和圖4所示。
[0038]上述步驟3中對(duì)步驟2得到的胖大海子葉側(cè)沿施加適當(dāng)壓力，使干燥后的種皮與子葉實(shí)現(xiàn)鈍性分離并避免破裂。
[0039]上述步驟4中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發(fā)蒸汽進(jìn)行熏染，熏染后可進(jìn)行鋨酸的回收和再利用。
[0040]總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:操作步驟如下: 1)將胖大海對(duì)半縱切:用長形直鑷或夾片平行胚軸縱向固定胖大海，使用銳利刀片沿胖大海的胚軸垂直縱向?qū)Π肫书_，避免兩片子葉的破損； 2)將步驟I)縱向?qū)Π肫是泻蟮呐执蠛Ｔ?7?65°C烘干72?168h; 3)將步驟2)得到的胖大海進(jìn)行種皮和子葉分離，得到樣品； 4)將步驟3)得到的樣品放入熏染裝置內(nèi)進(jìn)行鋨酸熏染，熏染條件:鋨酸溶液的質(zhì)量濃度為I?2%，熏染條件為在4°C中熏染15?120min或室溫熏染5?60min，得到熏染后的樣品; 5)將步驟4)熏染后的樣品在通風(fēng)廚中通風(fēng)15?30min使樣品表面殘存鋨酸揮發(fā)，得到無殘存鋨酸的樣品； 6)將步驟5)無殘存鋨酸的樣品放入真空干燥器干燥2?4h，得到干燥無殘存鋨酸的樣品; 7)用鑷子輕夾取步驟6)樣品的側(cè)面，保證觀察面向上，使用導(dǎo)電膠按順序?qū)悠防喂陶吃诮饘贅悠放_(tái)上，放入離子濺射儀中進(jìn)行噴金鍍膜，噴金鍍膜的條件:噴金時(shí)間總長3?5min，在總噴金時(shí)間內(nèi)分5?15次噴鍍，噴鍍金屬膜厚度10?20nm，掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)采圖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中對(duì)步驟2)得到的胖大海子葉側(cè)沿施加適當(dāng)壓力，使干燥后的種皮與子葉實(shí)現(xiàn)鈍性分離并避免破裂。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胖大海掃描電鏡樣品的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的熏染裝置能避免樣品直接接觸鋨酸溶液而利用鋨酸揮發(fā)蒸汽進(jìn)行熏染，熏染后可進(jìn)行鋨酸的回收和再利用。
【文檔編號(hào)】G01N23/22GK106053178SQ201610613599
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日
【發(fā)明人】黃遠(yuǎn)潔, 胡艷玲
【申請(qǐng)人】廣西醫(yī)科大學(xué)