一種河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及食品、農(nóng)產(chǎn)品快速檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種河豚毒素的膠體金 快速檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX)是豚魚類（俗稱河豚魚）、其它多種海洋生物以 及蠑螈、火蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形蟲等動物體內(nèi)含有的一種生物堿（氨基全氫喹唑啉型化 合物），是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，其分子式為C11H1708N3,分子量為 319,是小分子量、非蛋白質(zhì)的神經(jīng)性毒素，其毒性比劇毒的氰化鈉還要高1250多倍，0. 5mg 即可致人于死命。河豚毒素對腸道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神經(jīng)末梢和神經(jīng)中 樞，阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)，從而引起神經(jīng)麻痹而致死亡。其具體作用機(jī)制是通過與鈉離子通道受 體結(jié)合，阻斷電壓依賴性鈉通道，從而阻滯動作電位，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理活動的阻礙，主 要是神經(jīng)肌肉的麻痹，河豚毒素對呼吸和心血管的抑制是對中樞和外周神經(jīng)共同作用的結(jié) 果。河豚毒素的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般烹調(diào)手段難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施。因 此TTX的檢測具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 傳統(tǒng)的TTX檢測技術(shù)主要包括以小鼠檢測法為代表的生物檢測技術(shù)；以熒光分光 光度法、液相色譜檢測法為代表的儀器檢測技術(shù)。小鼠檢測法是利用河豚毒素的毒性特點(diǎn) 進(jìn)行的小鼠毒性檢測的方法，方法簡便，但定量不準(zhǔn)確且重復(fù)性差、目標(biāo)性差，已少用。熒光 分光光度法是最早建立的測定TTX的儀器方法，操作簡便，但靈敏度低、專一性差。液相色 譜檢測法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但需要專業(yè)人士操作、且儀器昂貴、檢測成本高，因此應(yīng)用范 圍受很大限制，檢測樣本量大大減少且不能進(jìn)行現(xiàn)場檢測。免疫分析技術(shù)為河豚毒素的檢 測提供了新的檢測手段，其中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法 特異性好、靈敏度高、可定量檢測，但仍需專業(yè)人士操作，且操作復(fù)雜。膠體金免疫層析法以 其靈敏、快速、準(zhǔn)確、操作簡便得到越來越廣泛的應(yīng)用，但目前的膠體金檢測產(chǎn)品仍存在靈 敏度低的狀況。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種河豚毒素膠體金快速檢測試 劑盒。本實(shí)用新型在傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，將膠體金標(biāo)記抗體復(fù) 合物直接凍干于微孔中，使得檢測過程中待測樣本與金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，提高檢測靈敏度。
[0005] 本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下：
[0006] -種河豚毒素膠體金快速檢測試劑盒，由檢測試紙和微孔試劑（8)組成；所述檢 測試紙由底板（7)、吸水板（1)、硝酸纖維素膜（5)、樣品吸液板（2)、MX線（6)組成；
[0007] 所述硝酸纖維素膜（5)疊放在底板（7)的中部上面；所述吸水板（1)疊放在底板 (7)的其中一端的端頭部分上面，所述樣品吸液板（2)疊放在底板（7)的另一端的端頭部分 上面；
[0008] 所述硝酸纖維素膜（5)兩端分別與吸水板（1)和樣品吸液板（2)相交疊，且所述 硝酸纖維素膜（5)位于吸水板（1)和樣品吸液板（2)的下方；
[0009] 從所述硝酸纖維素膜（5)靠近樣品吸液板（2)的那一端開始，依次設(shè)置試驗(yàn)線（3) 和控制線（4);所述試驗(yàn)線（3)由河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物包被；所述控制線（4)由羊 抗鼠多克隆抗體包被；
[0010] 所述微孔試劑（8)為凍干后的膠體金標(biāo)記河豚毒素單克隆抗體復(fù)合物。
[0011] 底板（7)是PVC背板，樣品吸液板⑵是玻璃纖維材料，微孔試劑⑶的微孔是聚 苯乙稀材料。
[0012] 所述硝酸纖維素膜（5)兩端與吸水板（1)和樣品吸液板（2)相交疊的部分長度分 別為1~2毫米。
[0013] 本試劑盒的使用方法如下：將水相待測樣品加入金標(biāo)微孔試劑（8)至微孔中固體 充分溶解，樣品中若含有河豚毒素，樣品中的河豚毒素將與微孔試劑（8)中河豚毒素單克 隆抗體-膠體金標(biāo)記物發(fā)生特異性結(jié)合。插入試紙條，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條 吸水板端移動，當(dāng)移動至固定有河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物試驗(yàn)線時(shí)，由于河豚毒素單 克隆抗體-膠體金標(biāo)記物與樣品中河豚毒素優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而不能與河豚毒素-大分子 蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，因此顯色的膠體金不能滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處沒有色帶顯示，即只有 一條控制線為陽性。相反如果樣品中沒有河豚毒素，河豚毒素金標(biāo)單克隆抗體移動到試驗(yàn) 線上，河豚毒素單克隆抗體就會與河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金 滯留于試驗(yàn)線上，即二條色帶為陰性。
[0014] 當(dāng)移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無論樣品中有無河豚毒素，控制線都會顯 色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，即檢測時(shí)樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過 期。
[0015] 本實(shí)用新型有益的技術(shù)效果在于：
[0016] 本試劑盒改變了以往在樣品洗液板和硝酸纖維素膜之間設(shè)置膠體金結(jié)合墊的方 法，而是將待測樣品先放入一個(gè)微孔試劑中。這個(gè)微孔試劑是膠體金標(biāo)記了待測毒素的抗 體和膠體金后凍干后得到的，冷凍干燥在低溫下進(jìn)行，不會發(fā)生變性或失去生物活力。在凍 干過程中，微生物的生長和酶的作用無法進(jìn)行，因此能保持原來的性狀。由于在凍結(jié)的狀態(tài) 下進(jìn)行干燥，因此制品的體積、形狀幾乎不變，保持了原來的結(jié)構(gòu)，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象。干燥 后的物質(zhì)疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復(fù)原來的性狀。
[0017] 本實(shí)用新型所提供的檢測試劑盒具有靈敏度高、操作簡便、方便攜帶、成本低、檢 測結(jié)果可靠等特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本實(shí)用新型中檢測試紙的結(jié)構(gòu)圖；
[0019] 圖2為本實(shí)用新型中微孔試劑的結(jié)構(gòu)圖；
[0020] 圖3為本實(shí)用新型的使用方法圖；
[0021] 圖4為本實(shí)用新型的陰性結(jié)果圖；
[0022] 圖5為本實(shí)用新型的陽性結(jié)果圖；
[0023] 圖6為本實(shí)用新型的無效結(jié)果圖；
[0024] 圖中：1、吸水板，2、樣品吸液板，3、試驗(yàn)線，4、控制線，5、硝酸纖維素膜，6、MAX線， 7、底板，8、微孔試劑。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖，對本實(shí)用新型進(jìn)行具體描述。
[0026] 一、本試劑盒的組成：
[0027] 本實(shí)用新型所涉及的試劑盒是由檢測試紙和微孔試劑8組成，如圖1所示。其中 檢測試紙由底板7、吸水板1、硝酸纖維素膜5、樣品吸液板2、MAX線6組成。底板7中部上 方疊加硝酸纖維素膜5,硝酸纖維素膜上5有平行的一條試驗(yàn)線（T線）3和一條控制線（C 線）4 ;底板7 -端端頭上方疊加吸水板1，另一端端頭上方疊加樣品吸液板2,硝酸纖維素 膜5兩端分別與吸水板1和樣品吸液板2相互交疊連接（交疊連接部分1~2毫米），且位 于吸水板1和樣品吸液板2的下方。其中試驗(yàn)線3由河豚毒素-大分子蛋白偶聯(lián)物包被，控 制線4靠近吸水板，由羊抗鼠多克隆抗體包被。微孔試劑8為將河豚毒素單克隆抗體-膠 體金標(biāo)記物直接凍干于微孔中制成，如圖2所示。
[0028] 二、河豚毒素膠體金檢測試劑盒的制備：
[0029] 1、河豚毒素免疫原合成：
[0030] 在小燒杯中依次加入30mg的BSA，6.OmL乙酸鈉緩沖液，4.Omg的TTX，加入180μL 的37%的甲醛，混勾，其余同KLH-HCH0-TTX制備，但不用A1 (S04) 2 · 12Η20和1.OmL的lmol/ L的NaOH沉淀，PBS透析結(jié)束后將產(chǎn)物直接凍干備用，即為免疫原。
[0031] 2、河豚毒素單克隆抗體的制備。
[0032] (1)免疫動物
[0033] 選擇6周齡雌性BALB/C小鼠，將抗原與福氏完全佐劑等量混合、乳化，經(jīng)腹部皮下 多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。
[0034] 分別隔4周，進(jìn)行第二、三次免疫。第三次免疫后第7~10天，斷尾取血，分離血 清，用ELISA方法檢測血清效價(jià)。用生理鹽水稀釋免疫原對高效價(jià)小鼠進(jìn)行連續(xù)加強(qiáng)免疫。
[0035] 處死小鼠，浸泡于75%酒精lmin。將小鼠仰臥在解剖板上，剪開胸部皮膚，縱向拉 開皮膚，暴