D-二聚體膠體金法檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種D-二聚體膠體金法檢測試劑盒及其 制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] D-二聚體是交聯(lián)纖維特異性降解產(chǎn)物，也是繼發(fā)性纖溶特有代謝產(chǎn)物。D-二聚 體是在各種病理或生理狀態(tài)下，凝血系統(tǒng)激活導(dǎo)致凝血活酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白 體，并在活化因子XIII的作用下形成交聯(lián)纖維蛋白。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶講 解過程中所釋放碎片進(jìn)一步降級產(chǎn)生的含有γ鏈的片段。受到病理因素影響，機(jī)體凝血及 纖溶動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，凝血傾向不斷增加，從而導(dǎo)致纖維蛋白降解產(chǎn)物增加。因此，D-二 聚體含量升高，表明機(jī)體內(nèi)存在纖維蛋白血栓形成和纖溶發(fā)生，臨床上也將D-二聚體含量 的變化作為機(jī)體高凝狀態(tài)與纖溶亢進(jìn)狀態(tài)的分子標(biāo)志物。
[0003] D-二聚體的檢測是臨床對繼發(fā)性纖溶靈敏度較高、特異性強(qiáng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，是目前 判斷機(jī)體高凝狀態(tài)和鑒別原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶、觀察溶栓治療效果等方面有重要臨床價(jià)值 的指標(biāo)。D-二聚體的檢測有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值：可用于彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC)的早期 診斷，深靜脈血栓（DVT)及肺栓塞的篩查，急性腦梗死的早期診斷、治療和愈后觀察，肝病 的治療和診斷及對惡性腫瘤的療效和愈后觀察等。
[0004] 因此，對D-二聚體的快速、全面、準(zhǔn)確、特異檢測顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種D-二聚體膠體金法 檢測試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供一種D-二聚體膠體金法檢測試劑盒，包括試紙卡，所述 試紙卡包括底板、及位于底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素 膜和吸水墊，所述金標(biāo)墊上包含膠體金標(biāo)記的抗D-二聚體單克隆抗體-1，所述硝酸纖維素 膜上包被有檢測線和質(zhì)控線。
[0008] 優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
[0009] 優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上，檢測線位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線位于離加樣 端較遠(yuǎn)一側(cè)。
[0010] 優(yōu)選的，所述檢測線上包被有抗D-二聚體單克隆抗體-2。
[0011] 優(yōu)選的，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
[0012] 所述抗D-二聚體單克隆抗體-1和抗D-二聚體單克隆抗體-2可以是相同的單克 隆抗體，也可以是不同的單克隆抗體。
[0013] 優(yōu)選的，所述抗D-二聚體單克隆抗體-1為Abeam:? Anti-D-Dimer抗體[DD1]， 所述抗D-二聚體單克隆抗體-2為Abcam：](. Anti-D-Dimer抗體[DD1]，或所述抗D-二聚體 單克隆抗體_1為Abeam? Anti-D-Dimer抗體[DD1]，所述抗D-二聚體單克隆抗體-2為 AbcarrKljC Anti-D-Dimer 抗體[DD2]。
[0014] 優(yōu)選的，所述樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖 液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液 的濃度為50-100mM。
[0015] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選 自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 10-40mM〇
[0016] 更優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，所述緩沖液還包括 NaCl和冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種 的組合，NaCl在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml。
[0017] 更優(yōu)選的，NaCl在緩沖液中的濃度為0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為 4_8mg/ml〇
[0018] 所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
[0019] 所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0020] 所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。
[0021] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上蓋，所述背卡設(shè)有試紙卡 卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè)有測試窗和加樣孔，所述測試窗的位 置與所述檢測線和質(zhì)控線的位置相配合，所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。
[0022] 更優(yōu)選的，所述卡殼為塑料卡殼。
[0023] 優(yōu)選的，所述檢測試劑盒用于檢測樣品中的D-二聚體，所述樣品選自人全血、血 清或血漿中的一種或多種的組合。
[0024] 本發(fā)明第二方面提供所述D-二聚體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，包括如下 步驟：
[0025] 1)用膠體金標(biāo)記的抗D-二聚體單克隆抗體-1溶液噴涂金標(biāo)墊，制得包含抗D-二 聚體單克隆抗體-1的金標(biāo)墊；
[0026] 2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂抗D-二聚體單克隆抗體-2及羊 抗鼠免疫球蛋白IgG，制得包被后的硝酸纖維素膜；
[0027] 3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼 在底板上，切裁制得檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。
[0028] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選 自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 10-40mM〇
[0029] 更優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，所述緩沖液還包括 NaCl和冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種 的組合，NaCl在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml。
[0030] 更優(yōu)選的，NaCl在緩沖液中的濃度為0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為 4_8mg/ml〇
[0031] 所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
[0032] 所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0033] 所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。
[0034] 本發(fā)明第三方面提供所述D-二聚體膠體金法檢測試劑盒在D-二聚體檢測領(lǐng)域的 用途。
[0035] 本發(fā)明的有益效果為：
[0036] 本發(fā)明所提供的D-二聚體膠體金法檢測試劑盒兼具高靈敏性和高特異性，能夠 快速檢測D-二聚體。此外，所述檢測試劑盒具有操作快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu) 點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0038] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0039] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0040] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin