專利名稱：一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組和蛋白表達(dá)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因及其制備和應(yīng)用，構(gòu)建了一種利用TrxA促進(jìn)外源蛋白可溶性表達(dá)的原核表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
大腸桿菌硫氧還蛋白作為一種氧化還原蛋白，具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵還原的功能，可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊。實(shí)驗(yàn)證明將TrxA基因融合表達(dá)于外源基因的上游，可以增加外源蛋白的可溶性。但是表達(dá)的外源蛋白由于氨基端融合了較大的TrxA蛋白，對(duì)其自身的生物學(xué)功能將造成一定影響，必須使用特殊的多肽酶(如腸激酶)切下TrxA.且切割效率很低。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者用不同質(zhì)粒游離共表達(dá)TrxA的方法取代TrxA融合蛋白。利用TrxA具有類似分子伴侶的特點(diǎn)，將外源蛋白的表達(dá)質(zhì)粒與TrxA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化同一宿主菌并共表達(dá)，顯著地增加了外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物的可溶性。但由于質(zhì)粒的不相容性，使該方法的使用受到一定限制。而在同一質(zhì)粒中共表達(dá)游離TrxA的方法尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因及其制備和應(yīng)用，獲得一種利用TrxA游離共表達(dá)促進(jìn)外源蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的新型原核表達(dá)載體。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為克隆TrxA的表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因，包含SphI和BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、T7啟動(dòng)子(T7 promoter)、乳糖操縱子(Lac Operator)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，tbs)及成熟TrxA蛋白編碼區(qū)和中止子的融合基因，其具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列；TrxA的調(diào)控及編碼區(qū)基因的制備方法，以表達(dá)載體pET-32a基因?yàn)槟０?，采用引物TrxA-F，5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’TrxA-R，5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’。
通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出TrxA的表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因片段；克隆出的TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因堿基序列如下SEQ ID NO1GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGG 40Promoter Lac Operator
CCTCTAGAAA TAATTTTGTT TAACTTTAA 80 ATAT ACATATGAGC GATAAAATTA TTCACCTGAC120RBSCDSTGACGACAGT TTTGACACGG ATGTACTCAA AGCGGACGGG160GCGATCCTCG TCGATTTCTG GGCAGAGTGG TGCGGTCCGT200GCAAAATGAT CGCCCCGATT CTGGATGAAA TCGCTGACGA240ATATCAGGGC AAACTGACCG TTGCAAAACT GAACATCGAT 280CAAAACCCTG GCACTGCGCC GAAATATGGC ATCCGTGGTA320TCCCGACTCT GCTGCTGTTC AAAAACGGTG AAGTGGCGGC360AACCAAAGTG GGTGCACTGT CTAAAGGTCA GTTGAAAGAG400TTCCTCGACG CTAACCTGGC CTAAAGATCT430利用限制性核酸內(nèi)切酶SphI和BglII的酶切連接技術(shù)，將克隆的TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因(序列表SEQ ID NO1中堿基序列)整合入表達(dá)載體pET-28a克隆表達(dá)區(qū)上游(替代原pET28-a表達(dá)載體401位至598位的堿基序列)；使在同一質(zhì)粒載體中，利用TrxA與外源蛋白以游離而非融合形式共表達(dá)促進(jìn)外源蛋白可溶性表達(dá)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明采用在單質(zhì)粒中共表達(dá)TrxA和外源蛋白的方法，克服了質(zhì)粒不相容性的問(wèn)題，簡(jiǎn)化了質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的操作。
2.目前國(guó)內(nèi)外利用TrxA促外源蛋白可溶性表達(dá)的方式都為同質(zhì)粒融合共表達(dá)或不同質(zhì)粒游離共表達(dá)；本發(fā)明采用使TrxA蛋白與外源蛋白以非融合形式游離共表達(dá)的策略(同質(zhì)粒游離共表達(dá))，使表達(dá)的外源蛋白不受TrxA蛋白的影響，也無(wú)需表達(dá)后的多肽酶切割。
3.本發(fā)明為人工構(gòu)建的一種新型原核表達(dá)載體trxA-pET-28a，利用TrxA具有類似分子伴侶的特點(diǎn)，該載體可促進(jìn)在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白的正確折疊，提高可溶性表達(dá)水平，減少不溶性包涵體表達(dá)量。
4.對(duì)于實(shí)施例制備的新型表達(dá)載體，本發(fā)明利用兩個(gè)相同的啟動(dòng)子(T7promoter)調(diào)控TrxA與外源蛋白的表達(dá)，可以僅使用一種誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)，并且使TrxA與外源蛋白的表達(dá)同步進(jìn)行(TrxA表達(dá)區(qū)在外源蛋白表達(dá)區(qū)的上游，引入新的酶切位點(diǎn)和中止子)，實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。共表達(dá)的TrxA可以明顯促進(jìn)外源蛋白單鏈抗體ML3.9(scFv-ML)、3-羥基苯甲酸-6-單加氧酶(3HBA)的可溶性表達(dá)，并明顯減少腸毒素C2(SEC2)、結(jié)核桿菌螺旋酶A亞基(GYRA)的包涵體表達(dá)。該新型表達(dá)載體的構(gòu)建將有利于基因工程方法制備各種可溶性外源蛋白。


圖1為PCR擴(kuò)增的TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因以1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果圖，其中1.trxA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；
圖2為游離共表達(dá)的TrxA促scFv-ML3.9可溶性表達(dá)的12％SDS-PAGE電泳分析圖，其中1.未誘導(dǎo)的pET-28a-ml陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的pET-28a-ml陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；3.誘導(dǎo)的pET-28a-ml陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；4.誘導(dǎo)的pET-28a-ml陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；5.未誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-ml陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-ml陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；7.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-ml陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；8.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-ml陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；9.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3為游離共表達(dá)的TrxA促3HBA可溶性表達(dá)的12％SDS-PAGE電泳分析圖，其中1.未誘導(dǎo)的pET-28a-3hba陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；3.誘導(dǎo)的pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；4.誘導(dǎo)的pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；5.未誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-3hba陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；7.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；8.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-3hba陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；9.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖4為游離共表達(dá)的TrxA促SEC2可溶性表達(dá)的12％SDS-PAGE電泳分析圖，其中1.未誘導(dǎo)的pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆；2.誘導(dǎo)的pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；3.誘導(dǎo)的pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；4.誘導(dǎo)的pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；5.未誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-sec2陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；7.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；8.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-sec2陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；9.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖5為游離共表達(dá)的TrxA促GYRA可溶性表達(dá)的12％SDS-PAGE電泳分析圖，其中1.未誘導(dǎo)的pET-28a-gyra陽(yáng)性克?。?.誘導(dǎo)的pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；3.誘導(dǎo)的pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；4.誘導(dǎo)的pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；5.未誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-gyra陽(yáng)性克??；6.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆全細(xì)胞表達(dá)；7.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆可溶性表達(dá)；8.誘導(dǎo)的trxA-pET-28a-gyra陽(yáng)性克隆包涵體表達(dá)；9.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；具體實(shí)施方式
實(shí)施例1TrxA的表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因的制備，其具有序列表SEQ ID NO1中所示的堿基序列(1)SEQ ID NO.1的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度430堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源載體pET32-a質(zhì)粒DNA(2)TrxA的調(diào)控及編碼區(qū)基因的PCR擴(kuò)增1)PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件根據(jù)TrxA基因序列和pET32-a的DNA序列，設(shè)計(jì)一組引物正向引物TrxA-F5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’；反向引物TrxA-R5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’PCR反應(yīng)體系為10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板pET32-a質(zhì)粒DNA 0.1μg、PyrobestDNA聚合酶2U，無(wú)菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。
PCR反應(yīng)條件為第一階段95℃，5分鐘；第二階段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，35秒；共30個(gè)循環(huán)；第三階段72℃，10分鐘；2)PCR產(chǎn)物的回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(附圖1)，切下大小為430bp的目的帶，按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收；3)回收后產(chǎn)物的雙酶切回收后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SphI和BglII充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，再次膠回收。
實(shí)施例2新型表達(dá)載體trxA-pET-28a的構(gòu)建(1)pET-28a載體的雙酶切將美國(guó)Novagen公司pET-28a載體質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SphI和BglII充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收純化5100bp大片段(2)酶切產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化將經(jīng)雙酶切的PCR產(chǎn)物片段和pET-28a載體大片段以3∶1的摩爾比例混合，并以T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建成表達(dá)載體trxA-pET-28a。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆?tīng)?，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約JohnWiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)，以卡那霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。
(3)表達(dá)載體trxA-pET-28a的驗(yàn)證將挑選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培，提取質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒DNA提取方法按J.薩姆布魯克，E.F.費(fèi)里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，經(jīng)SphI和BglII雙酶切鑒定，并以鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒為模板，用T7啟動(dòng)子和終止子為引物，以Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)序證實(shí)。
實(shí)施例3
新型表達(dá)載體trxA-pET-28a的實(shí)際應(yīng)用及效果評(píng)價(jià)(1)將外源基因片段連接入新型表達(dá)載體trxA-pET-28a將trxA-pET-28a質(zhì)粒DNA和含有單鏈抗體ML3.9基因的pET-28a-ml質(zhì)粒DNA分別用Nco I、Not I雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收770bp的scFv-ml片段及trxA-pET-28a質(zhì)粒5500bp片段，以T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建單鏈抗體ML3.9與TrxA共表達(dá)載體trxA-pET-28a-ml。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。以卡那霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，挑選重組克隆擴(kuò)培，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Nco I、Not I雙酶切鑒定正確重組克隆。同樣方法以Nhe I、EcoR I雙酶切構(gòu)建3-羥基苯甲酸-6-單加氧酶(3HBA)與TrxA共表達(dá)載體trxA-pET-28a-3hba；以EcoRI、XhoI雙酶切構(gòu)建腸毒素C2(SEC2)與TrxA共表達(dá)載體trxA-pET-28a-sec2；以EcoRI、XhoI雙酶切構(gòu)建結(jié)核桿菌螺旋酶A亞基(GYRA)與TrxA共表達(dá)載體trxA-pET-28a-gyra(2)TrxA與外源蛋白的共表達(dá)分別接種轉(zhuǎn)化了各重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含40μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜活化培養(yǎng)，以1％接種量轉(zhuǎn)接下一級(jí)，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度1.0mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)(3)TrxA促外源蛋白可溶性表達(dá)的分析離心收集菌體，用pH7.4的1/10原培養(yǎng)基體積的PBS緩沖液清洗菌體一次并重懸，于0℃超聲破碎直至菌液變得清亮，12000r/min離心20分鐘，取上清，用1/30原培養(yǎng)基體積的PBS緩沖液重懸沉淀。分別取超聲后的總樣及離心后得到的上清和沉淀重懸液，以5×上樣緩沖液處理(緩沖液配方和處理方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》科學(xué)出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析表達(dá)產(chǎn)物，薄層掃描儀在波長(zhǎng)560nm處掃描結(jié)果TrxA蛋白、scFvML3.9蛋白、3-HBA蛋白、SEC2蛋白和GYRA蛋白的分子量分別為12kD、36kD、45kD、31kD和96kD，經(jīng)1.0mmol/L的IPTG的誘導(dǎo)，克隆的trxA基因得到大量表達(dá)，且可以和在同一質(zhì)粒載體中的外源基因游離共表達(dá)。
在與TrxA蛋白共表達(dá)作用下，scFv-ML3.9蛋白和3-HBA蛋白的可溶性表達(dá)量均有顯著增加(附圖2，3)，SEC2蛋白和GYRA蛋白的包涵體表達(dá)顯著降低(附圖4，5)，可見(jiàn)，TrxA的游離共表達(dá)促進(jìn)了外源蛋白的正確折疊，減少了包涵體的形成，促使蛋白更多地以可溶形式存在。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所<120>一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因及共制備和應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>430<212>DNA<213>載體pET32-a質(zhì)粒DNA<220>
<221>CDS<222>(95)..(430)<223>
<400>1gcatgctaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaatt cc cctctagaaa60taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg agc gat aaa att att cac115Met Ser Asp Lys Ile Ile His1 5ctg act gac gac agt ttt gac acg gat gta ctc aaa gcg gac ggg gcg 163Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala10 15 20atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg tgc ggt ccg tgc aaa atg atc 211Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile25 30 35gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac gaa tat cag ggc aaa ctg acc 259Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr40 45 50 55gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac cct ggc act gcg ccg aaa tat 307Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr60 65 70ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg 355Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val75 80 85gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct aaa ggt cag ttg aaa gag ttc 403Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe90 95 100ctc gac gct aac ctg gcc taa aga tct 430Leu Asp Ala Asn Leu Ala Arg Ser105 110
<210>2<211>109<212>PRT<213>載體pET32-a質(zhì)粒DNA<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala100 10權(quán)利要求
1.一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中堿基序列。
2.一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因的制備，其特征在于以表達(dá)載體pET-32a基因?yàn)槟０澹捎靡颰rxA-F，5’-CGT GCA TGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’；TrxA-R，5’-ATG AGA TCT TTA GGC CAG GTT AGC GTC-3’用PCR技術(shù)擴(kuò)增出具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列的基因片段。
3.一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因的應(yīng)用，其特征在于將序列表SEQ ID NO1中堿基序列克隆入pET28-a表達(dá)載體401位至598位，構(gòu)建成促可溶性表達(dá)的原核表達(dá)載體TrxA-pET28-a。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組和蛋白表達(dá)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種TrxA表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)基因及其制備和應(yīng)用，利用PCR技術(shù)克隆大腸桿菌硫氧還蛋白(TrxA)的表達(dá)調(diào)控及編碼區(qū)，其具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列；將其克隆至pET－28a啟動(dòng)子上游，構(gòu)建了一種在單質(zhì)粒中利用兩個(gè)相同的啟動(dòng)子游離共表達(dá)硫氧還蛋白與目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，以促進(jìn)外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。結(jié)果表明TrxA可與外源蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中以非融合形式高效共表達(dá)，并促進(jìn)了表達(dá)的外源蛋白的可溶性。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1834246SQ20051004603
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者徐明愷, 張成剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所