專利名稱：豬鏈球菌2型一個新毒力基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬鏈球菌2型一個新的毒力基因VirA及其用途，屬于分子生物學和應用微生物學領域。
背景技術：
豬鏈球菌是一種世界范圍流行的病原菌，共有35個血清型，包括1-34型和1/2 型。其中豬鏈球菌2型(SS2)是一種人獸共患病原菌，它毒力最強、分布范圍最廣，也是臨床上分離到最多的豬鏈球菌血清型。SS2不僅可引起豬急性敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎及急性死亡，也可導致與病豬密切接觸的相關人員感染，出現(xiàn)中毒性休克綜合癥、 腦膜炎、敗血癥及突然死亡等。豬鏈球病菌呈世界分布，以前主要為零星散發(fā)，近年來在世界各地養(yǎng)豬業(yè)頻繁爆發(fā)。其自然感染途徑主要在上呼吸道，常棲居于豬的扁桃體、鼻咽、生殖器、消化道等器官。以前對SS2毒力因子的研究主要集中在莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、 胞外因子、溶血素等。近年來，也發(fā)現(xiàn)了一些SS2新的毒力相關因子，包括纖連蛋白和纖連蛋白接合蛋白、谷氨酰胺合成酶、肽聚糖等，但是這些毒力因子在SS2致病中的作用仍不能確定。有研究表明，不帶這些毒力因子的SS2自然分離株或敲除上述某種毒力基因的SS2 強毒株細菌仍然具有毒力。因此認為SS2 —定還帶有更重要的新毒力因子。Wilson等利用信號標簽突變技術對SS2的毒力因子進行研究，共篩選了 22個弱毒突變菌株，提供了一些新毒力相關基因的證據(jù)。本研究在此基礎上，進一步對SS2的毒力基因進行研究，發(fā)現(xiàn)了一個SS2新毒力基因virA，該基因只存在于SS2強毒菌株，而在無毒株中均發(fā)生了不同程度的變異，因此可以將該基因作為檢測SS2強毒株的標志基因，并可能作為保護性抗原用于構建SS2疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對豬鏈球菌2型的研究，發(fā)掘其新毒力基因，特別是找到豬鏈球菌2型強毒菌株特有的標志性基因片段。為達到上述目的，本發(fā)明人深入研究，結果發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2型一個新的毒力基因 virA，該基因僅存在于豬鏈球菌2型強毒菌株，而在無毒株中發(fā)生了根本性的變異或缺失。本發(fā)明包括以下內(nèi)容(1) 一種新基因，是豬鏈球菌2型強毒株特有的新毒力基因。(2)根據(jù)(1)所述的基因，含有序列表中SEQ ID NO 1所示的堿基序列第1至1206 個的序列。(3)根據(jù)(1)所述的基因，可用于鑒別豬鏈球菌2型強毒株和無毒株。以下詳細敘述本發(fā)明。本實驗室從2005年四川資陽地區(qū)豬鏈球菌2型病死豬中分離到了豬鏈球菌2型強毒菌株，并分離到了多株豬鏈球菌2型無毒菌株，對這些菌株的生物學特性進行了研究。 通過PCR方法對豬鏈球菌2型強毒株和無毒株的分析發(fā)現(xiàn)VirA基因只存在于豬鏈球菌2型強毒株。在此基礎上，我們利用溫度敏型穿梭自殺質粒PSEI^s技術和同源重組的原理， 定點敲除了豬鏈球菌2型強毒株VirA基因，構建了 VirA基因缺失突變菌株，并利用基因互補技術，構建了缺失互補菌株，利用兔感染模型對豬鏈球菌2型強毒株、基因缺失突變菌株和缺失互補菌株的毒性進行了研究，并對這三株菌的生長速率和形態(tài)學上的變化進行了研究。結果表明，構建的VirA基因突變菌株的生長速率與形態(tài)學和野生菌株沒有區(qū)別，VirA 基因對豬鏈球菌2型的生長和細菌的形態(tài)沒有明顯影響。家兔感染實驗表明，VirA基因缺失突變菌株對家兔的致死性喪失。家兔接種野生菌株或互補菌株后，出現(xiàn)明顯臨床癥狀，體重下降，并引起死亡；而接種virA基因缺失突變菌株的家兔與陰性對照組家兔相似，未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，體重正常。這些結果證實VirA在豬鏈球菌2型的致病過程中具有關鍵作用。為了進一步研究VirA基因與豬鏈球菌2型致病性之間的關系，了解其基因結構， 推斷其基因功能。本研究對豬鏈球菌2型強毒株和無毒株的VirA基因進行鑒定以及基因結構和序列分析，結果表明完整的VirA基因只存在于強毒菌株，而無毒菌株的VirA相應序列發(fā)生了根本性的突變。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例一豬鏈球菌2型VirA基因缺失突變菌株的構建利用溫度敏感型穿梭自殺質粒pSEI^s，對豬鏈球菌2型ZW58強毒菌株的virA基因進行定點敲除，構建virA基因缺失菌株。同時為了進一步深入研究virA基因對毒力的關系，擴增出virA基因及其啟動子序列，把virA基因克隆到基因缺失菌株，構建了 virA基因毒力回復互補菌株。具體的用PCR方法擴增VirA缺失基因片段，將該片段克隆到溫度敏感型穿梭自殺質粒pSEI^s，構建重組自殺性質粒PSE1Ms Δ virA。然后將該重組自殺性質粒電轉化到豬鏈球菌2型強毒菌株，利用溫度敏感型自殺質粒pSET4s: AvirA的特性篩選virA基因缺失突變菌株。其具體篩選過程是將帶重組溫敏自殺質粒pSEI^s: AvirA的豬鏈球菌2 型強毒株在^°C、含壯觀霉素(100yg/mL)抗性的鏈球菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長早期，按照1 10的比例，取500yL培養(yǎng)物加入到5mL無抗性的液體鏈球菌培養(yǎng)基中，先在
下培養(yǎng)約4h，然后在37°C溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)10h，溫敏自殺質粒pSEI^s Δ virA丟失，完成自殺過程。然后將培養(yǎng)物用鏈球菌培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋涂布于無抗性的鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基平板，放置37°C溫箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落過夜培養(yǎng)后進行進行PCR篩選缺失了 I^bp 的virA缺失基因片段菌株。實施例二 豬鏈球菌2型virA基因回復互補菌株的構建通過PCR方法擴增virA基因及其上游的啟動子序列，克隆到穿梭質粒pAT18中， 然后電轉化到豬鏈球菌2型virA基因缺失突變菌株，構建豬鏈球菌2型virA基因回復互補菌株。具體的，PCR擴增virA基因及其上游的啟動子序列，克隆到載體pMDIS-T后進行酶切鑒定和測序鑒定，然后將virA基因片段酶切后定向克隆到穿梭質粒pAT18的BamHI/EcoR I位點之間，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，提取質粒進行PCR鑒定和酶切鑒定。將鑒定正確的重組質粒電轉化到豬鏈球菌2型VirA基因缺失突變菌株，利用紅霉素 (50 μ g/mL)抗性平板進行篩選，然后進行PCR鑒定，鑒定正確的菌株即豬鏈球菌2型virA 基因回復互補菌株。實施例三豬鏈球菌2型VirA基因突變菌株生長速率實驗分別接種豬鏈球菌2型野生型強毒菌株、VirA基因缺失菌株和互補回復菌株到 IOOmL不含抗生素的鏈球菌液體培養(yǎng)基中，37°C溫箱靜置培養(yǎng)。以未接種細菌的鏈球菌液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔Ih利用分光光度計測量培養(yǎng)物在600nm波長下的OD值，連續(xù)測量 13h。結果這三個菌株在生長曲線上沒有明顯差別，說明virA基因對豬鏈球菌2型的生長情況沒有明顯影響。電鏡下的形態(tài)學觀察也證實豬鏈球菌2型野毒菌株和基因缺失菌株以及毒力回復互補菌株在形態(tài)學上沒有區(qū)別。實施例四豬鏈球菌2型VirA基因突變菌株對家兔模型的毒性實驗20只日本大耳白兔分成4組，每組5只。觀察2-3天后進行試驗，第1組接種豬鏈球菌2型野生型強毒菌液，第2組接種VirA基因缺失菌液，第3組接種互補回復菌液，第4 組為陰性對照。接種途徑為腹腔注射，接種劑量為ImL(IXlO9CFU/只)。每天測體溫，觀察家兔的臨床癥狀和死亡情況，觀察期為15d。結果接種野生強毒菌株和互補回復菌株的家兔體重明顯下降，都出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，如精神沉郁、發(fā)熱、食欲減退、消瘦、眼睛腫脹、神經(jīng)紊亂等。強毒菌株接種組5只家兔4天內(nèi)全部死亡，互補回復菌株接種組5只家兔7天內(nèi)有4只死亡，一只瀕臨死亡。接種VirA基因缺失突變菌株的5只家兔體重與對照組體重一致，生長正常，均未表現(xiàn)出任何明顯的臨床癥狀，無家兔死亡。說明VirA基因是豬鏈球菌2 型關鍵的毒力基因之一。實施例五豬鏈球菌2型強毒株與無毒株中VirA基因的分布以豬鏈球菌2型強毒株與無毒株基因組為模板，對豬鏈球菌2型強毒株與無毒株的VirA基因進行PCR擴增鑒定，PCR擴增結果通過電泳或測序進行分析。結果所有受試豬鏈球菌2型強毒菌株中均有完整的VirA基因，基因全長1206bp，而所有受試豬鏈球菌2型無毒菌株中VirA基因均發(fā)生了缺失或根本性的突變。實驗結果表明VirA基因是豬鏈球菌 2型重要的毒力基因，可作為豬鏈球菌2型強毒菌株的標志性基因片段，以用于鑒定區(qū)分豬鏈球菌2型強毒菌株與無毒菌株。
權利要求
1.一個新毒力基因片段，該基因來源于豬鏈球菌2型，該基因包含序列表SEQ ID NO 1所示第1至1206的堿基序列。
2.根據(jù)權利要求1其中所說的新毒力基因片段只存在于豬鏈球菌2型強毒菌株，而在無毒菌株中發(fā)生了缺失或根本性的突變。
3.根據(jù)權利要求1所說的新毒力基因片段可用于鑒別診斷豬鏈球菌2型強毒菌株與無毒菌株。
4.利用根據(jù)權利要求1所說的新毒力基因片段建立的鑒別診斷豬鏈球菌2型強毒菌株與無毒菌株的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬鏈球菌2型的新毒力基因，特別是涉及豬鏈球菌2型新的標志性毒力基因virA。本發(fā)明進一步涉及利用該毒力基因建立鑒定區(qū)別豬鏈球菌2型強毒菌株與無毒菌株中的應用。本發(fā)明通過對豬鏈球菌2型強毒株virA基因的定點敲除和互補回復，證實其是新毒力基因。對virA基因在強毒株與無毒株中的分布研究證實其是豬鏈球菌2型強毒菌株特有的標志性毒力基因，可用于對強毒株與無毒株的鑒別診斷。
文檔編號C12Q1/14GK102260688SQ20101018703
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權日2010年5月31日
發(fā)明者馮書章, 劉軍, 李鵬 申請人:馮書章