專利名稱：tRNA組合物和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及制造tRNA的方法和tRNA組合物以及其用途。本發(fā)明還涉及使用所述tRNA和相關(guān)組合物在細(xì)胞中制造蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
從細(xì)菌到人類，每一種已知有機體的遺傳密碼都編碼相同的二十種常見氨基酸。這二十種相同天然氨基酸的不同組合形成進(jìn)行幾乎所有生命復(fù)雜過程(從光合作用到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng))的蛋白質(zhì)。為研究和改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家們已嘗試操縱蛋白質(zhì)的遺傳密碼和氨基酸序列。然而，難以去除由遺傳密碼所強加的將蛋白質(zhì)局限于二十種遺傳編碼的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)單元(building block)(其中極少見的特例為，硒代半胱氨酸(selenocysteine)(例如參看 A. Bock 等人，(1991), Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(pyrrolysine)(例如參看 G. Srinivasan 等人，(2002), Science296:1459-62))的約束。已取得一些進(jìn)展來去除這些約束，但這一進(jìn)展受到限制并且合理地控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的能力仍不成熟。舉例來說，化學(xué)家們已開發(fā)出合成并且操縱小分子結(jié)構(gòu)的方法和策略(例如參看 E. J. Corey, & X. -M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis(Wiley-Inter science, New York, 1995))。全合成(例如參看 B. Merri fie Id, (1986), Science232:341-7 (1986))和半合成方法(例如參看 D. Y. Jackson 等人,(1994) Science266:243-7 ； 和 P.E. Dawson, & S. B. Kent, (2000), Annual Review of Biochemistry69:923-60)使得合成肽和小蛋白質(zhì)成為可能，但這些方法限制了 10千道爾頓(kiloDalton, kDa)以上蛋白質(zhì)的效用。誘變方法盡管有效，但也局限于有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)改變。在多種情況中，在整個蛋白質(zhì)中競爭性并入常見氨基酸的結(jié)構(gòu)極其接近的類似物已成為可能。例如參看 R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 ;K. Kirshenbaum 等人,(2002). ChemBioChem3:235-7 ；和 V. Poring 等人,(2001). Science 292:501-4?；瘜W(xué)肽連接和天然化學(xué)連接描述于美國專利第6，184，344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO 02/098902和WO 03/04223中，這些專利都是以引用的方式并入本文中。Lu等人于Mol Cell. 2001 Oct;8 (4) :759-69中描述一種以化學(xué)方式將蛋白質(zhì)與含有非天然氨基酸的合成肽連接的方法(稱為蛋白質(zhì)連接)。早期的工作證實，大腸桿菌(E. coli)的翻譯機器將容納結(jié)構(gòu)與常見二十種氨基酸類似的氨基酸。參看 Hortin, G.和 Boime, I. (1983) Methods Enzymol. 96:777-784。通過放寬內(nèi)源性大腸桿菌合成酶的特異性從而使其活化非天然氨基酸以及其同類天然氨基酸，使這項工作得以進(jìn)一步擴充。此外，經(jīng)證實，也可以使用編輯域的突變來擴充內(nèi)源性合成酶的底物范圍。參看Doring，V.等人，(2001) Science 292:501-504。然而，這些策略局限于重新編碼遺傳密碼而非擴展遺傳密碼，并且產(chǎn)生非天然氨基酸對常見二十種氨基酸中的一種的不同程度的取代。隨后證實，可通過將以化學(xué)方式氨?；恼荤暌种菩詔RNA加到活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中而在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質(zhì)中。例如參看 Noren，C.J.等人(1989) Science 244:182-188 ；Bain, J. D.等人,(1989) T. Am.Chem.Soc. 111:8013-8014 ;Dougherty,D.A. (2000)Curr.Opin. Chem. Biol. 4, 645-652 ；Cornish, V. ff.等人(1995) Angew. Chem. Int. Ed. 34 : 621-633 I. A. Ellman 等人，(1992). Science255:197-200 和 D. Mendel 等人，(1995). Annual Review ofBiophysics and Biomolecular Structure 24:435-462。這些研究表明，核糖體和翻譯因子可與大量非天然氨基酸、甚至具有不常見結(jié)構(gòu)的氨基酸相容。不幸的是，tRNA的化學(xué)氨 酰基化很難，并且這種方法的化學(xué)計量特性極大限制了能夠產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。已將非天然氨基酸顯微注射到細(xì)胞中。舉例來說，通過顯微注射以化學(xué)方式錯酸基化的嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，M. E. Saks 等人(1996), Anengineered Tetrahymena tRNA Gln for in vivo incorporation of unnatural aminoacids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem. 271:23169-23175)和相關(guān)mRNA而將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopus oocyte)中的煙堿型乙酰膽堿受體中(例如，M. ff. Nowak 等人(1998), In vivo incorporation of unnatural amino acids intoion channels in Xenopus oocyte expression system，Method EnzymoI. 293:504-529)。還參看 D. A. Dougherty (2000), Unnatural amino acids as probes of proteinstructure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652 和 M. ff. Nowak, P. C. Kearney,J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, ff. G. Zhong, J. Thorson, J.N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 和 H. A. Lester, Science, 268:439 (I995)。將爪蟾卵母細(xì)胞與活體外制得的以下兩種RNA物質(zhì)共注射編碼在所關(guān)注的氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的靶蛋白的mRNA，和經(jīng)所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制性tRNA。隨后所述卵母細(xì)胞的翻譯機器將非天然氨基酸插入UAG指定的位置處。不幸的是，這種方法局限于細(xì)胞中可進(jìn)行顯微注射的蛋白質(zhì)，并且由于相關(guān)tRNA是在活體外以化學(xué)方式?；⑶覠o法再酰基化，故蛋白質(zhì)的產(chǎn)率極低。為克服這些缺點，將新穎組件(例如，正交tRNA、正交氨?；鵷RNA合成酶和正交tRNA/正交氨酰基tRNA合成酶對)加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli，E. coli)(例如參看 L. Wang 等人，(2001)，Science 292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromycescerevisia, S. cerevisiae)(例如 J. Chin 等人，Science 301:964-7 (2003))的蛋白質(zhì)生物合成機器中，所述蛋白質(zhì)生物合成機器能夠在活體內(nèi)將非遺傳編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應(yīng)(例如)琥珀密碼子(TAG)以高保真度將多種具有新穎化學(xué)、物理或生物特性的新穎氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述新穎氨基酸包括光親和標(biāo)記和光致異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看Chin，J.W.等人(2002)Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人，(2002) T. Am. Chem.Soc. 124:9026-9027)、酮某氡某酸(例如參看 Wang, L.等人，(2003)Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 100:56-61 和 Zhang, Z.等人，Biochem. 42 (22) : 6735-6746 (2003))、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem3(11) : 1135-1137 和 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002)，Chem. Comm. . 1:1—11。已報導(dǎo)若干其它正交對。已針對大腸桿菌中非天然氨基酸并入的可能性描述自釀酒酵母tRNA和合成酶獲得的谷氨酰胺?；?例如參看Liu，D. R.和Schultz，P. G. (1999)Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. 96:4780-4785)、天冬氨酸基(例如參看 Pastrnak, M.等人，(2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286)和酪氨?；?例如參看 Ohno, S.等人，(1998)I. Biochem. (Tokyo, Tpn. ) 124:1065-1068 ；和 Kowal，A. K.等人(2001)Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 98:2268-2273)系統(tǒng)。也已描述自大腸桿菌谷氨酰胺酰基(例如參看Kowal，A.K.等人，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. .98:2268-227)和酪氨?；?例如參看Edwards, H.和 Schimmel, P. (1990)Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641)合成酶獲得的系統(tǒng)以用于釀酒酵母中。已使用大腸桿菌酪氨?；到y(tǒng)在活體內(nèi)將3-碘-L-酪氨酸并入哺乳動物細(xì)胞中。參看 Sakamoto, K.等人，(2002)Nucleic Acids Res. 30:4692-4699。通常,這些系統(tǒng)都利用琥珀終止密碼子。為進(jìn)一步擴展遺傳密碼，需要開發(fā)生物合成機器(例如，tRNA)的經(jīng)改進(jìn)和/或額外組件。如在評估以下揭示內(nèi)容后將顯而易見，本發(fā)明滿足這些要求和其它要求。

發(fā)明內(nèi)容
為擴展遺傳密碼，本發(fā)明提供制造正交tRNA的組合物和方法。氨?；鵷RNA合成酶利用非天然編碼的氨基酸使本發(fā)明的tRNA氨?；??？墒褂眠@些翻譯組件響應(yīng)tRNA所識別的選擇性密碼子將所選氨基酸并入正在生長的多肽鏈(在核酸翻譯的過程中)的特定位置中。在細(xì)胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的蛋白質(zhì)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來說，一種方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)胞生長，其中所述細(xì)胞包含包括至少一個選擇性密碼子并且編碼蛋白質(zhì)的核酸；和提供所選氨基酸。所述細(xì)胞另外包含正交tRNA(0-tRNA)，其在細(xì)胞中起作用并且識別選擇性密碼子；和正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)，其優(yōu)先利用所選氨基酸使0-tRNA氨?；?。通常，0-tRNA在存在同類合成酶的情況下包含抑制活性。由本方法制造的蛋白質(zhì)也為本發(fā)明的特征。


圖I一繪示具有TVC莖干突變位點的J17 tRNA的三葉草結(jié)構(gòu)；圖2-繪示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)進(jìn)行的人生長激素中琥珀突變的抑制。通過SDS PAGE分析各樣本的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物；圖3-繪示在不同細(xì)胞系中使用F13進(jìn)行的人生長激素中琥珀突變的抑制。
具體實施方式
定義
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不限于特定生物系統(tǒng)，其當(dāng)然可以變化。還應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語只是出于描述特定實施例的目的，并且不打算限制僅受隨附權(quán)利要求限制的本發(fā)明的范圍。除非另作明確指示，否則如本文和隨附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一”和“所述”包括多個參考物。因此，例如提及“一細(xì)胞”包括兩個或兩個以上細(xì)胞的組合并且包括所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物等。對“細(xì)菌”的提及包括細(xì)菌的混合物等。除非本文和下文說明書的剩余部分中另作定義，否則本文所使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解相同的含義。本文所提及的所有公開案和專利都是以引用的方式并入本文中以達(dá)到描述和揭示(例如)所述公開案中所述的可能與當(dāng)前所述的發(fā)明結(jié)合使用的構(gòu)筑體和方法的目的。僅提供本文所討論的公開案在本申請案申請日期之前的揭示內(nèi)容。本文在任何方面都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明者無權(quán)由于現(xiàn)有發(fā)明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。MM :當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列是天然或以人工方式從共同的祖先蛋白質(zhì)或蛋 白質(zhì)序列得到時，其為“同源”的。類似地，當(dāng)核酸和/或核酸序列是天然或以人工方式從共同的祖先核酸或核酸序列得到時，其為“同源”的。舉例來說，可通過任何可用的誘變方法來修飾任何天然存在的核酸以使其包括一個或一個以上選擇性密碼子。當(dāng)表達(dá)時，這一經(jīng)誘變核酸將編碼包含一個或一個以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。當(dāng)然，突變方法可另外改變一個或一個以上標(biāo)準(zhǔn)密碼子，借此也使所得突變蛋白質(zhì)中的一個或一個以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸改變?？蓪⑺鲆粋€或一個以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸變?yōu)榉翘烊话被峄蛱烊话被帷Ｍ葱砸话闶菑膬煞N或兩種以上核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間的序列相似性推斷得出?？捎糜诖_定同源性的序列之間相似性的確切百分比隨所討論的核酸和蛋白質(zhì)而變化，但通常使用僅25%的序列相似性確定同源性。較高的序列相似性水平(例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%，或99%以上)也可用于確定同源性。測定序列相似性百分比的方法(例如，使用默認(rèn)參數(shù)的BLASTP和BLASTN)在本文中加以描述并且一般可用。正交如本文所使用，術(shù)語“正交”是指以降低的效率被所關(guān)注的系統(tǒng)(例如，翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞)使用的分子(例如，正交tRNA (0-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)).正交是指正交tRNA和/或正交RS無法在所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中起作用或以降低的效率(例如，低于20%的效率、低于10%的效率、低于5%的效率或例如低于1%的效率)在所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中起作用。舉例來說，當(dāng)與通過內(nèi)源性RS使內(nèi)源性tRNA氨酰基化相比較時，所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA氨?；Ｔ诹硪粋€實例中，當(dāng)與通過內(nèi)源性RS使內(nèi)源性tRNA氨酰基化相比較時，正交RS以降低的效率或甚至為零的效率使所關(guān)注的翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性tRNA氨酰基化?？蓪⒌诙环肿右爰?xì)胞中從而與第一正交分子一起作用。舉例來說，正交tRNA/RS對包括所引入的在細(xì)胞中相對于相應(yīng)內(nèi)源性tRNA/RS對以一定效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或更高效率)一起作用的互補組件?！罢恍缘母倪M(jìn)”是指與原材料或天然存在的tRNA或RS相比正交性增強。同類物:術(shù)語“同類物”是指一起作用的組件，例如tRNA和氨酰基tRNA合成酶。所述組件也可稱為互補體。優(yōu)先氨?；?術(shù)語“優(yōu)先氨?；笔侵概cO-RS使天然存在的tRNA或用于產(chǎn)生0-tRNA的原材料氨酰基化相比，O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使0-tRNA氨?；男?，例如約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或更高效率。隨后將非天然氨基酸以高保真度(例如)以對指定選擇性密碼子大于約70%的效率、對指定選擇性密碼子大于約75%的效率、對指定選擇性密碼子大于約80%的效率、對指定選擇性密碼子大于約85%的效率、對指定選擇性密碼子大于約90%的效率、對指定選擇性密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ㄟx擇性密碼子大于約99%的效率并入正在生長的多肽鏈中。詵擇件密碼子:術(shù)語“選擇性密碼子”是指在翻譯過程中由0-tRNA識別且不被內(nèi)源性tRNA識別的密碼子。0-tRNA反密碼子環(huán)識別mRNA上的選擇性密碼子并且在多肽中的這一位點并入其氨基酸，例如所選氨基酸，諸如非天然氨基酸。選擇性密碼子可例如包括 (但不限于)無義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子；四個或四個以上堿基密碼子；稀有密碼子；自天然或非天然堿基對獲得的密碼子等。對于指定系統(tǒng)來說，選擇性密碼子也可以包括天然的三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或極少使用)所述天然的三堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然的三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或天然的三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。抑制件tRNA :抑制性tRNA是(例如)通過提供響應(yīng)選擇性密碼子將氨基酸并入多肽鏈的機制來改變指定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA。舉例來說，抑制性tRNA可通讀包括(但不限于)終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子的密碼子。抑制活件:術(shù)語“抑制活性”是指tRNA (例如，抑制性tRNA)通讀選擇性密碼子的能力?；钚钥梢援?dāng)與對照(例如缺乏同類合成酶)相比時所觀察到的活性百分比表示。翻譯系統(tǒng):術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”是指將天然存在的氨基酸并入正在生長的多肽鏈(蛋白質(zhì))所需的組件。翻譯系統(tǒng)的組件可包括(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的組件可加到活體外或活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中。翻譯系統(tǒng)的實例包括(但不限于)非真核細(xì)胞，例如細(xì)菌(諸如，大腸桿菌)；真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞；無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物等。翻譯系統(tǒng)可為細(xì)胞翻譯系統(tǒng)或無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，且可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞翻譯系統(tǒng)包括(但不限于)所需核酸序列可轉(zhuǎn)錄成mRNA且所述mRNA可經(jīng)翻譯的全細(xì)胞制劑，諸如透性化細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可為市售，且眾所周知許多不同的類型和系統(tǒng)。無細(xì)胞系統(tǒng)的實例包括(但不限于)原核生物溶解產(chǎn)物(諸如大腸桿菌溶解產(chǎn)物)和真核生物溶解產(chǎn)物(諸如麥芽提取物)、昆蟲細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人類細(xì)胞溶解產(chǎn)物。當(dāng)所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或另外經(jīng)修飾時，由于許多所述修飾僅可能在真核生物系統(tǒng)中，故可優(yōu)選真核生物提取物或溶解產(chǎn)物。這些提取物和溶解產(chǎn)物中的一些可為市售(Promega ;Madison, Wis. ；Stratagene ；LaJolla, Calif. ;Amersham ;Arlington Heights, 111. ；GIBC0/BRL ；Grand Island, N. Y. X 可用于翻譯分泌型蛋白質(zhì)的膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)也可用。也可使用重建的翻譯系統(tǒng)。也已成功地使用純翻譯因子的混合物將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)以及溶解產(chǎn)物或補充有純翻譯因子的溶解產(chǎn)物的組合，所述純翻譯因子諸如起始因子-I (IF-l)、IF-2、IF-3 (a或￠)、延長因子T (EF-Tu)或終止因子。還可使無細(xì)胞系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄 / 翻譯系統(tǒng)偶聯(lián)，其中如 Current Protocols in Molecular BiologyCF. M. Ausubel等人編，Wiley Interscience, 1993)(其是以引用的方式清楚地并入本文)中所述,將DNA弓I入所述系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA且翻譯所述mRNA。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA ChnRNA)或5’端帽子(7-甲基鳥苷)和3’端聚A尾成熟mRNA的形式，此可為某些翻譯系統(tǒng)的優(yōu)勢。舉例來說，在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解系統(tǒng)中以高效率翻譯經(jīng)封端mRNA。所選氨基酸:術(shù)語“所選氨基酸”是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。如本文所使用，術(shù)語“非天然氨基酸”或“非天然編碼的氨基酸”是指不為20種常見的天然存在的氨基酸中的一種或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸和/或氨基酸類似物?？梢耘c術(shù)語“非天然編碼的氨基酸”和“非天然氨基酸(unnatural aminoacid)”以相同意義使用的其它術(shù)語為“非天然氨基酸(“non-natural amino acid”)”、“非天然存在的氨基酸”和其各種以連字符連接和不以連字符連接的型式。術(shù)語“非天然編碼的氨基酸”還包括(但不限于)通過對天然編碼的氨基酸(包括但不限于，20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)進(jìn)行修飾(例如，翻譯后修飾)而產(chǎn)生但其本身未通過翻譯復(fù) 合物天然并入到正在生長的多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。自……獲得:如本文所使用，術(shù)語“自……獲得”是指從特定分子或有機體分離或使用來自特定分子或有機體的信息制得的組件。陽性選擇或篩選標(biāo)記如本文所使用，術(shù)語“陽性選擇或篩選標(biāo)記”是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時導(dǎo)致鑒別具有陽性選擇標(biāo)記的細(xì)胞與不具有陽性選擇標(biāo)記的細(xì)胞的標(biāo)記。陰性選擇或篩選標(biāo)記:如本文所使用，術(shù)語“陰性選擇或篩選標(biāo)記”是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時允許鑒別不具有所需特性(例如，當(dāng)與具有所需特性的細(xì)胞相比較時)的細(xì)胞的標(biāo)記。報告基因如本文所使用，術(shù)語“報告基因”是指可用于選擇所關(guān)注的系統(tǒng)中的革巴組件的組件。舉例來說，報告基因可包括蛋白質(zhì)，例如賦予抗生素抗性或敏感性的酶(包括但不限于，￠-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光篩選標(biāo)記(包括但不限于，綠色熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)、YFP、EGFP, RFP)、發(fā)光標(biāo)記(包括但不限于，螢火蟲熒光素酶蛋白)、基于親和力的篩選標(biāo)記或陽性或陰性選擇標(biāo)記基因(諸如lacZ、^ -gal/lacZ ( ^ -半乳糖苷酶)、ADH (醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2 等)。直孩生鹽如本文所使用，術(shù)語“真核生物”是指屬于系統(tǒng)發(fā)育真核生物領(lǐng)域的有機體，諸如動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括但不限于，單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、小孢子蟲、原生生物等。非真核生物如本文所使用，術(shù)語“非真核生物”是指非真核有機體。舉例來說，非真核有機體可屬于系統(tǒng)發(fā)育真細(xì)菌領(lǐng)域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)或系統(tǒng)發(fā)育古細(xì)菌領(lǐng)域(例如詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii);嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum);嗜鹽古菌(Halobacterium),諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)和嗜鹽古菌NRC-1(Halobacterium species NRC-1);閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus);強烈火球菌(Pyrococcus furiosus);掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii);嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeuropyrum pernix)等)。保守變異體:術(shù)語“保守變異體”是指在功能上與得到保守變異體的組件(例如0-tRNA或0-RS)類似但序列變異的翻譯組件，例如保守變異體0-tRNA或保守變異體0-RS。舉例來說，O-RS將利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使互補0-tRNA或保守變異體0-tRNA氨?；?-tRNA和所述保守變異體0-tRN A不具有相同序列。類似地，可通過互補O-RS或保守變異體O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使tRNA氨?；?，但所述O-RS和所述保守變異體O-RS不具有相同序列。保守變異體的序列可具有(例如)一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或五處以上變異，只要保守變異體與相應(yīng)0-tRNA或O-RS互補即可。選擇或篩選劑:如本文所使用，術(shù)語“選擇或篩選劑”是指當(dāng)存在時允許從群體中選擇/篩選某些組件的試劑。舉例來說，選擇或篩選劑例如包括(但不限于)養(yǎng)分、抗生素、光波長、抗體、經(jīng)表達(dá)聚核苷酸等。選擇劑的(例如)濃度、強度等可變化。術(shù)語“未有效識別”是指來自一種有機體的RS使0-tRNA氨?；男?例如)小于約10%、小于約5%或小于約1%。適于制造包括一個或一個以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)已描述于名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS” 的美國專利申請案 10/126，931 和名稱為 “INVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS. ”的 10/126, 927 中。此外，參看名稱為“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”的USSN 10/825，867。這些申請案的每一個都是以全文引用的方式并入本文。所述翻譯系統(tǒng)一般包含包括正交tRNA(0-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)和所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的細(xì)胞，其中O-RS利用所選氨基酸使0-tRNA氨?；１景l(fā)明的正交對由0-tRNA (例如，抑制性tRNA、移碼tRNA等)和O-RS構(gòu)成。0-tRNA識別第一選擇性密碼子并且在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子而具有抑制活性。細(xì)胞使用所述組件將所選氨基酸并入正在生長的多肽鏈中。舉例來說，也可存在包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子。翻譯系統(tǒng)也可以是活體外系統(tǒng)。本發(fā)明的tRNA分子可用于任何翻譯系統(tǒng)中，包括在翻譯中利用核糖體的系統(tǒng)。翻譯系統(tǒng)也可為無細(xì)胞(活體外)翻譯系統(tǒng)。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(活體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的組合)的這些系統(tǒng)中，活體外合成是由核糖體指導(dǎo)。已將相當(dāng)多的努力用于開發(fā)無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中。例如參看Kim, D. M. 和 J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering,74:309-316 (2001)；Kim, D. M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542，(2000) ；Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390，(2000) ；Kim, D. M.和J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering,66,180-188, (1999)；和 Patnaik, R.和 J. R. Swartz, Biotechniques 24，862-868，(1998);美國專利第 6，337，191 號；美國專利公開案第2002/008 1660號；W000/55353 ;W0 90/05785，所述專利文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文?？蓱?yīng)用的另一種方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。例如參看R. Roberts和 J.Szostak,Proc. Natl Acad.Sci. (USA)94:12297-12302 (1997) ；A.Frankel 等人，Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)。以本方法，在核糖體上將與嘌呤霉素連接的mRNA模板翻譯成肽。如果已對一個或一個以上tRNA分子進(jìn)行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。閱讀最后一個mRNA密碼子后，嘌呤霉素將俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽連結(jié)物具有引人關(guān)注的特性，那么可輕易地從mRNA序列揭示其身份。以此方式，可篩選包含一個或一個以上非天然編碼的氨基酸的多肽的文庫以鑒別具有所需特性的多肽。目前，據(jù)報導(dǎo)，以純組件進(jìn)行的活體外核糖體翻譯將允許合成經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的妝。例如參看A. Forster 等人，Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)。在某些實施例中，包含本發(fā)明的tRNA的大腸桿菌細(xì)胞包括所述翻譯系統(tǒng)。舉例來說，本發(fā)明的大腸桿菌細(xì)胞包括正交tRNA(0-tRNA)，其中所述0-tRNA在存在同類合成酶的 情況下響應(yīng)選擇性密碼子而包含抑制活性；正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS);所選氨基酸；和核酸，其包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子。本發(fā)明還在細(xì)胞中提供多個0-tRNA/0-RS對，其允許并入一個以上所選氨基酸。在某些實施例中，細(xì)胞可另外包括另一不同的0-tRNA/0-RS對和第二所選氨基酸，其中所述0-tRNA識別第二選擇性密碼子并且所述O-RS優(yōu)先利用第二所選氨基酸使0-tRNA氨?；?。舉例來說，細(xì)胞可另外包含(例如)自詹氏甲烷球菌的酪氨?；鵷RNA合成酶獲得的琥珀抑制性tRNA-氨酰基tRNA合成酶對。0-tRNA和/或O-RS可天然存在或者可通過來自多種有機體的天然存在的tRNA和/或RS的突變(例如，其產(chǎn)生tRNA文庫和/或RS文庫)得到。舉例來說，制造正交tRNA/氨?；鵷RNA合成酶對的一種策略涉及將來自(例如)除宿主細(xì)胞外的其它來源或多種來源的異源tRNA/合成酶對輸入宿主細(xì)胞中。異源合成酶候選物的特性包括(例如)其不負(fù)載任何宿主細(xì)胞tRNA，并且異源tRNA候選物的特性包括(例如)其不經(jīng)任何宿主合成酶氨?；?。此外，異源tRNA與所有宿主細(xì)胞合成酶正交。產(chǎn)生正交對的另一種策略涉及產(chǎn)生突變體文庫以篩選和/或選擇0-tRNA或O-RS。這些策略也可以組合。在各種實施例中，0-tRNA和O-RS是自至少一種有機體獲得。在另一個實施例中，0-tRNA是自第一有機體的天然存在或突變的天然存在的tRNA獲得，并且O-RS是自第二有機體的天然存在或突變的天然存在的RS獲得。在一個實施例中，第一有機體與第二有機體不同。舉例來說，正交對可包括自嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌獲得的tRNA合成酶和自古細(xì)菌tRNA(例如，自嗜鹽古菌NRC-I)獲得的tRNA?；蛘?，第一有機體與第二有機體相同。參看本文中標(biāo)題為“來源和宿主有機體”的章節(jié)以得到額外信息。在本發(fā)明的某些實施例中，本發(fā)明的0-tRNA包含如SEQ ID NO. :1、2或3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體，或由所述聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。也參看本文中標(biāo)題為“核酸和多肽序列和變異體”的早下。tRNA (0-tRNA)正交tRNA (0-tRNA)介導(dǎo)(例如)活體內(nèi)或活體外將所選氨基酸并入由包含經(jīng)0-tRNA識別的選擇性密碼子的聚核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。可通過任何方法或技術(shù)(包括但不限于，化學(xué)或酶促氨?；椒?利用所需氨基酸使本發(fā)明的0-tRNA氨?；?。本發(fā)明的氨酰基化0-tRNA可直接加到翻譯系統(tǒng)中?？稍诨铙w外或活體內(nèi)利用所選氨基酸通過RS使本發(fā)明的0-tRNA氨酰基化。此外，RS可為O-RS?？蓪⒈景l(fā)明的0-tRNA直接提供到翻譯系統(tǒng)(例如，活體外翻譯組件，或細(xì)胞)中，或通過提供編碼0-tRNA或其部分的聚核苷酸將其提供到翻譯系統(tǒng)中。舉例來說，0-tRNA或其部分是由如SEQ IDN0. : 1、2、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼。本發(fā)明的0-tRNA在存在同類合成酶的情況下響應(yīng)選擇性密碼子而包含抑制活性。抑制活性可通過所屬領(lǐng)域中已知的多種檢定中的任一種來測定。舉例來說，可使用
半乳糖苷酶報告基因檢定。使用在啟動子控制下表達(dá)IacZ基因的質(zhì)粒的衍生物，例如，其中IacZ的肽VVLQRRDWEN中的Leu_25經(jīng)選擇性密碼子(例如，TAG、TGA、AGGA等密碼子，或酪氨酸、絲氨酸、亮氨酸等的有義密碼子(作為對照))置換。將衍生化的IacZ質(zhì)粒以及包含本發(fā)明的0-tRNA的質(zhì)粒引入來自適當(dāng)有機體(例如，可使用正交組件的有機體)的細(xì)胞 中。還可引入同類合成酶(當(dāng)表達(dá)時作為編碼同類合成酶的多肽或聚核苷酸)。使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長到所需密度(例如，達(dá)到約0. 5的0D_)，并且例如使用BetaFluor ^ -半乳糖苷酶檢定試劑盒(Novagen)進(jìn)行P _半乳糖苷酶檢定。以樣本相對于可比較對照(例如，由衍生化IacZ構(gòu)筑體觀察得到的值)的活性百分比計算抑制百分比，其中所述構(gòu)筑體在所需位置處具有相應(yīng)的有義密碼子而非選擇性密碼子。在tRNA分子中，胸腺嘧啶(T)經(jīng)尿嘧啶(U)置換。此外，可存在對堿基的其它修飾。本發(fā)明還包括0-tRNA的保守變異體。舉例來說，0-tRNA的保守變異體包括與0-tRNA功能類似并且保持tRNA的L形結(jié)構(gòu)但不具有相同序列的分子(且為除野生型tRNA分子之外的分子)。也參看本文中標(biāo)題為“核酸和多肽序列以及變異體”的章節(jié)。包含0-tRNA的組合物可另外包括正交氨?；鵷RNA合成酶(0-RS)，其中所述O-RS優(yōu)先利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)使0-tRNA氨酰基化。在某些實施例中，包括0-tRNA的組合物可另外包括翻譯系統(tǒng)(例如，活體外或活體內(nèi)翻譯系統(tǒng))。細(xì)胞或其它翻譯系統(tǒng)中也可存在包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸的核酸，其中所述聚核苷酸包含一個或一個以上由0-tRNA識別的選擇性密碼子，或一個或一個以上所述密碼子的組合。也參看本文中標(biāo)題為“正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS) ”的章節(jié)。制造正交tRNA (0-tRNA)(例如，0-tRNA)的方法也為本發(fā)明的特征。由所述方法制造的tRNA (例如，0-tRNA)也為本發(fā)明的特征。制造正交tRNA的方法包括使tRNA池中的每一 tRNA的反密碼子環(huán)突變以允許識別選擇性密碼子(例如，琥珀密碼子、蛋白石密碼子、四堿基密碼子等)，借此提供多個潛在的0-tRNA ;并且分析所述多個潛在0-tRNA的成員的二級結(jié)構(gòu)以鑒別二級結(jié)構(gòu)中的非規(guī)范堿基對；且視情況使所述非規(guī)范堿基對突變(例如，使非規(guī)范堿基對突變?yōu)橐?guī)范堿基對)。非規(guī)范堿基對可位于二級結(jié)構(gòu)的莖干區(qū)中。0-tRNA可具有一種或一種以上特征或活性的改進(jìn)(諸如與原材料(例如，多個tRNA序列)相比對于所需有機體的正交性的改進(jìn))，而同時保持其對所需RS的親和力。或者，可通過使已知tRNA突變以調(diào)節(jié)其與一個或一個以上影響翻譯或作為翻譯機器組件的分子的相互作用或與所述分子的結(jié)合親和力來產(chǎn)生0-tRNA。所述組件包括(但不限于)延長因子。細(xì)菌延長因子EF-Tu對于蛋白質(zhì)合成中的延長步驟起到關(guān)鍵作用。在tRNA合成酶使tRNA氨酰基化后，EF-Tu結(jié)合氨?；膖RNA并且將其帶到核糖體的A位點。帶電氨基酸與tRNA之間的酯鍵因EF-Tu與氨?；痶RNA之間的結(jié)合而避免發(fā)生自發(fā)水解。Stortchevoi等人已對大腸桿菌起始tRNAfMet的T VC莖干中的U50:G64擺動堿基對的突變體進(jìn)行研究，這是因為已發(fā)現(xiàn)這一堿基對是在延長過程中阻斷tRNA活性的二級負(fù)決定因子(secondary negative determinant),推測這是由EF_Tu. GTP與氨酸基化tRNA之間減弱的相互作用引起(JBC 2003 278(20) : 17672-17679)。同樣，LaRiviere等人于Science, 2001年10月5日;294 (5540) : 165-8中描述氨基酸和tRNA主體對與EF-Tu的總結(jié)合親和力的熱動力學(xué)貢獻(xiàn)。其表明，tRNA主體和氨基酸的貢獻(xiàn)彼此無關(guān)，并且當(dāng)tRNA經(jīng)正確?；瘯r，所述tRNA主體與所述氨基酸彼此補償。EF-Tu. GTP與經(jīng)非天然氨基酸氨?；膖RNA之間相互作用的改變可能影響將tRNA負(fù)載到核糖體A位點的效率。也可以通過分析tRNA與翻譯機器其它組件(諸如EF-Tu)的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來發(fā)現(xiàn)潛在的突變位點。舉例來說，Nissen等人已指出，EF-Tu. GTP與酵母苯丙氨?；D(zhuǎn)移RNA (Phe-tRNA)的T VC 莖干的磷酸主鏈直接結(jié)合(Science 1995270 (5241) : 1464-1472)。所述方法視情況包括分析tRNA和/或氨酰基tRNA合成酶的序列的同源性以確定 似乎對于特定有機體正交的0-tRNA、0-RS和/或0-tRNA/0-RS對的潛在候選物。所屬領(lǐng)域中已知并且本文描述的計算機程序可用于所述分析。在一個實例中，為選擇用于原核有機體中的潛在正交翻譯組件，選擇不顯示與原核有機體的異常同源性的合成酶和/或tRNA。還可以通過一致性策略制造tRNA池。舉例來說，通過比對多個tRNA序列；確定一致序列；并且使用所述一致序列的至少一部分、大部分或全部產(chǎn)生tRNA文庫來制造tRNA池。舉例來說，可用計算機程序(例如，GCG程序pileup)來編譯一致序列。視情況，將由所述程序所測定的簡并位置變?yōu)樗鑫恢锰幍淖畛Ｒ妷A基。文庫是通過所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)使用一致序列合成。舉例來說，可使用寡核苷酸的重疊延伸提供基于一致序列的文庫，其中tRNA基因的各個位點可合成為90%—致序列與10%其它三堿基混合物的摻雜混合物。也可以使用其它混合物，例如75% —致序列和25%其它三堿基混合物；80% —致序列和20%其它三堿基混合物；95%—致序列和5%其它三堿基混合物等。突變體tRNA文庫可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生。舉例來說，可通過位點特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合產(chǎn)生突變體tRNA?？蓪⑵渌蛔円雝RNA的所需環(huán)或區(qū)域(例如，反密碼子環(huán)、受體莖干、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TurC臂或環(huán)、tRNA分子的其它區(qū)域或其組合)中的特定位置(例如，非保守性位置或保守性位置、隨機位置或其組合)處。突變可包括在莖干區(qū)中相配的堿基對。通常，通過使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)歷陰性選擇來獲得0-tRNA，其中所述細(xì)胞包含多個潛在0-tRNA中的成員。陰性選擇將除去包含經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性氨?；鵷RNA合成酶(RS)氨酰基化的多個潛在0-tRNA的成員的細(xì)胞。這提供與第一物種的細(xì)胞正交的tRNA池。在陰性選擇的某些實施例中，將選擇性密碼子弓I入編碼陰性選擇標(biāo)記(例如，賦予抗生素抗性的酶，例如￠-內(nèi)酰胺酶；賦予可檢測的產(chǎn)物的酶，例如￠-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT);例如在非必需位置處的有毒產(chǎn)物，諸如barnase等)的聚核苷酸中。篩選/選擇可通過使細(xì)胞群體在存在選擇劑(例如，抗生素，諸如氨比西林(ampicillin))的情況下生長來進(jìn)行。在一個實施例中，選擇劑的濃度可變化。舉例來說，為測量抑制性tRNA的活性，使用基于選擇性密碼子的活體內(nèi)抑制(例如，引入編碼陰性選擇標(biāo)記(例如，￠-內(nèi)酰胺酶的基因(bla))的聚核苷酸中的無義或移碼突變)的選擇系統(tǒng)。舉例來說，構(gòu)建在一定位置(即某一位置)處具有(例如)TAG、AGGA和TGA的聚核苷酸變異體，例如bla變異體。用這些聚核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞(例如，細(xì)菌)。在無法被內(nèi)源大腸桿菌合成酶有效負(fù)載的正交tRNA的情況中，抗生素抗性(例如，氨比西林抗性)應(yīng)與不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的抗性類似或比不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的抗性低。如果tRNA不為正交tRNA，或者如果在所述系統(tǒng)中共表達(dá)能夠負(fù)載tRNA的異源合成酶，那么將觀察到較高水平的抗生素(例如，氨比西林)抗性。選擇在與不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大致相同的抗生素濃度下無法在LB瓊脂平板上生長的細(xì)胞，例如細(xì)菌。在有毒產(chǎn)物(例如，核糖核酸酶barnase)的情況中，當(dāng)通過內(nèi)源宿主(例如,大腸桿菌)合成酶(即，其不與宿主正交，例如大腸桿菌合成酶)使多個潛在tRNA中的成員氨?；瘯r，選擇性密碼子受抑制并且所產(chǎn)生的有毒的聚核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。具有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞存活。 在一個實施例中，隨后使與所需有機體正交的tRNA池經(jīng)歷陽性選擇，其中選擇性密碼子放入(例如)由藥物抗性基因(諸如￠-內(nèi)酰胺酶基因)編碼的陽性選擇標(biāo)記中。陽性選擇是對包含編碼或包含tRNA池的成員的聚核苷酸、編碼陽性選擇標(biāo)記的聚核苷酸和編碼同類RS的聚核苷酸的細(xì)胞進(jìn)行。這些聚核苷酸都在所述細(xì)胞中表達(dá)，并且所述細(xì)胞是在存在選擇劑(例如，氨比西林)的情況下生長。隨后，針對tRNA經(jīng)共表達(dá)的同類合成酶氨?；⑶翼憫?yīng)此選擇性密碼子插入氨基酸的能力來選擇tRNA。通常，與具有非功能性tRNA或無法被所關(guān)注的合成酶有效識別的tRNA的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞展現(xiàn)出抑制效率的增強。具有非功能性tRNA或不被所關(guān)注的合成酶有效識別的tRNA的細(xì)胞對抗生素敏感。因此，以下tRNA在兩種選擇下都存活(i)不為內(nèi)源宿主(諸如，大腸桿菌)合成酶的底物的tRNA ；
(ii)可經(jīng)所關(guān)注的合成酶氨?；膖RNA jP(iii)在翻譯過程中起作用的tRNA。在上述方法中，選擇(例如，陽性選擇、陰性選擇或陽性選擇與陰性選擇)的嚴(yán)格度視情況可變化。舉例來說，由于barnase為劇毒蛋白質(zhì)，故陰性選擇的嚴(yán)格度可通過將不同數(shù)量的選擇性密碼子引入barnase基因中和/或通過使用可誘導(dǎo)啟動子來控制。在另一個實例中，選擇劑或篩選劑(例如氨比西林)的濃度可變化。一方面，由于在早期回合中所需活性較低，故嚴(yán)格度是變化的。因此，在早期回合中應(yīng)用較低嚴(yán)格度的選擇標(biāo)準(zhǔn)并且在隨后的選擇回合中應(yīng)用較高嚴(yán)格度的標(biāo)準(zhǔn)。在某些實施例中，陰性選擇、陽性選擇或陰性選擇和陽性選擇可重復(fù)多次?？墒褂枚喾N不同的陰性選擇標(biāo)記、陽性選擇標(biāo)記或陰性選擇和陽性選擇標(biāo)記。在某些實施例中，陽性選擇標(biāo)記與陰性選擇標(biāo)記可相同?？蓪⑵渌愋偷倪x擇/篩選用于本發(fā)明中以制造正交翻譯組件，例如0-tRNA、O-RS和0-tRNA/0-RS對。舉例來說，陰性選擇標(biāo)記、陽性選擇標(biāo)記或陽性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記可包括發(fā)熒光或在存在適當(dāng)反應(yīng)物的情況下催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。在另一實施例中，標(biāo)記的產(chǎn)物是通過熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過發(fā)光來檢測。視情況，標(biāo)記包括基于親和力的篩選標(biāo)記。參看Francisco, J. A.等人，(1993)Production andfluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functionalantibodyfragment on the external surface.Proc Natl Acad Sci USA. 90:10444-8。
制造重組正交tRNA的其它方法可見于(例如)名稱為“Methods and Compositionsfor the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs，， 的美國專利申請案 10/126，93 和名稱為 “In vivo Incorporation of Unnatural AminoAcids” 的 10/126，127 以及名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE. ”的 USSN10/825，867 中。也參看 Forster 等人，(2003) Programming peptidomimetic synthetasesby translating genetic codes designed de novo. PNAS 100(11):6353-6357 ;和 Feng等人，(2003)，Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single aminoacid change, PNAS 100 (10):5676-5681。可通過任何方法或技術(shù)(包括但不限于，化學(xué) 或酶促氨酰基化方法)利用所需氨基酸使本發(fā)明的tRNA氨?；?。氨?；赏ㄟ^氨?；鵷RNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于，核糖酶)實現(xiàn)。術(shù)語“核糖酶”可與“催化性RNA”互換使用。Cech和同事(Cech, 1987，Science, 236:1532-1539 ;McCorkle等人，1987, Concepts Biochem. 64:221-226)證實可充當(dāng)催化劑的天然存在的RNA (核糖酶)的存在。然而，盡管僅已證實這些天然RNA催化劑對裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但近期有關(guān)人工核糖酶進(jìn)展的研究已擴展對各種化學(xué)反應(yīng)的催化作用的型式。相關(guān)研究已鑒別出可催化自身(2’)3’末端的氨酰基RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995 Science 267:643-647)和可將氨基酸從一個RNA分子轉(zhuǎn)移到另一 RNA分子的RNA 分子(Lohse 等人，1996, Nature 381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593 (其是以引用的方式并入本文)描述構(gòu)建核糖酶的方法和其對于用天然編碼的氨基酸和非天然編碼的氨基酸氨酰基化tRNA的用途?？墒箃RNA氨?；幕|(zhì)固定形式的酶分子(包括但不限于，核糖酶)能夠有效地親和純化氨?；a(chǎn)物。適當(dāng)基質(zhì)的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。供氨酰基化作用的基質(zhì)固定形式的核糖酶的制造和用途已描述于Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述專利文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文?；瘜W(xué)氨酰基化方法包括(但不限于)由Hecht和同事(Hecht, S. M. Ace.Chem. Res. 1992, 25, 545 ;Heckler, T. G. ; Roesser, J. R. ; Xu, C; Chang, P. ; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7254 ；Hecht, S. M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y. ; Kitano, S. J. Biol.Chem.1978，253，4517)和 Schultz, Chamberlin, Dougherty 等(Cornish, V. W. ; Mendel,D.;Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621 ；Robertson, S. A. ; Ellman, J.A. ; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722 ；Noren, C. J. ; Anthony-Cahi 11, S. J.;Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989，244，182 ；Bain, J. D. ; Glabe, C. G. ; Dix, T. A.;Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013 ；Bain, J. D.等人 Nature 1992, 356, 537 ；Gallivan, J. P. ; Lester, H. A. ;Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740 ；Turcatti 等人J. Biol. Chem. 1996，271，19991 ；Nowak, M. ff.等人 Science, 1995，268，439 ；Saks, M. E.等人J. Biol. Chem. 1996，271，23169 ；Hohsaka, T.等人 J. Am. Chem. Soc. 1999，121，34)提出的方法以避免在氨?；^程中使用合成酶。所述方法或其它化學(xué)氨?；椒捎糜谑贡景l(fā)明的tRNA分子氨?；Ｒ咽褂美靡曰瘜W(xué)方式修飾的氨?；鵷RNA的生物合成方法將數(shù)個生物物理探針并入活體外合成的蛋白質(zhì)中。參看本文所引用的以下公開案和參考文獻(xiàn)Brunner，J. NewPhotolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem,62:483-514(1993);和Krieg，U. C. , Walter, P. , Hohnson, A. E. Photocrosslinldng of the signal sequence ofnascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognitionparticle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83 (22) : 8604-8608 (1986)。先前已證實，可通過將經(jīng)化學(xué)方法氨?；囊种菩詔RNA加入經(jīng)含有所需琥珀無義突變的基因程式設(shè)計的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，在活體外將非天然氨基酸位點特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，使用特定氨基酸的營養(yǎng)缺陷型菌株，可以結(jié)構(gòu)類似的同源物取代20種常見氨基酸中的多種氨基酸，例如以氟代苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看 Noren, C. J. , Anthony-Cahillj Griffith, M. C. , Schultz, P. G. A general method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science,244:182-188 (1989) ；M. ff. Nowak 等人,Science 268:439-42(1995) ；Bain, J. D. , Glabe, C.G. , Dix, T. A. , Chamberlin, A. R. , Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporationof a non-natural amino acid into a polypeptide, I. Am Chem Soc,111:8013—8014(1989) ;N. Budisa 等人，F(xiàn)ASEB T. 13:41-51 (1999) Ellman. T. A. . Mendel. D. . Anthony-Cahill, S. , Noren, C. J. , Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducingunnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., 第202 卷，301-336(1992)；和 Mendel，D.，Cornish, V. ff. &Schultz, P. G. Site-DirectedMutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24,435-62(1995)。舉例來說，制備識別終止密碼子UAG的抑制性tRNA，并且用非天然氨基酸以化學(xué)方法使其氨?；Ｊ褂贸Ｒ?guī)定點誘變將終止密碼子TAG引入蛋白質(zhì)基因中的所需位點處。例如參看 Sayers, J. R.，Schmidt, W. Eckstein, F. 5’_3’ Exoniicleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutaRensis, Nucleic AcidsRes, 16 (3) : 791-802 (1988)。當(dāng)將?；种菩詔RNA和突變體基因組合于活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時，響應(yīng)UAG密碼子而并入非天然氨基酸，此提供在特定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用[3H]-Phe進(jìn)行的實驗和以a羥基酸進(jìn)行的實驗證實，僅所需氨基酸被并入UAG密碼子指定的位置處，且并未將這一氨基酸并入蛋白質(zhì)中的任何其它位點。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi 等人，(2003)Nature Structural BiologylO (6) :425-432 ;和 Ellman,J.A.，Mendel, D.，Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novelbackbone structures into proteins, Science,255 (5041):197-200 (1992)。產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生單獨隨機核糖酶序列池；對所述池進(jìn)行定向進(jìn)化；針對所需氨酰基化活性篩選所述池；和選擇那些展現(xiàn)所需氨酰基化活性的核糖酶的序列。核糖酶可包含有利于?；钚缘幕蚝?或區(qū)域，諸如GGU基序和富集U的區(qū)域。舉例來說，據(jù)報導(dǎo)，富集U的區(qū)域可有利于識別氨基酸底物，且GGU基序可與tRNA 3’末端形成堿基對?？偟恼f來，GGU和基序以及富集U的區(qū)域有利于同時識別氨基酸與tRNA，且由此有利于使tRNA 3’末端氨?；?。 可通過使用與tRNAAsn CCCG連結(jié)的部分隨機化r24mini進(jìn)行活體外選擇，隨后系統(tǒng)性工程設(shè)計見于活性克隆中的一致序列來產(chǎn)生核糖酶。由本方法獲得的例示性核糖酶稱為“Fx3核糖酶”且描述于美國公開申請案第2003/0228593號中，所述專利的內(nèi)容是以引用的方式并入本文，所述核糖酶充當(dāng)合成載有同類非天然氨基酸的各種氨?；鵷RNA的通用催化劑?？墒褂迷诨|(zhì)上固定以能夠有效親和純化氨酰基化tRNA。適當(dāng)基質(zhì)的實例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。可利用RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)將核糖酶固定于樹脂上，諸如，可以高碘酸鹽氧化RNA的核糖上的3’-順-二醇以得到相應(yīng)二醛以有利于將RNA固定于樹脂上?？墒褂酶黝悩渲?，包括廉價酰肼樹脂，其中還原氨化使得樹脂與核糖酶之間以不可逆連接相互作用?？赏ㄟ^柱上氨?；夹g(shù)顯著有利于氨?；鵷RNA的合成。Kourouklis等人Methods 2005;36:239-4描述基于柱的氨?；到y(tǒng)?？梢远喾N方式實現(xiàn)氨?；痶RNA的分離。一種適當(dāng)方法為用緩沖液從柱中洗提出氨?；痶RNA，所述緩沖液諸如含有IOmM EDTA的乙酸鈉溶液；含有50mM N_(2_羥乙基)哌嗪-N，-(3-丙烷磺酸)、12. 5mM KCl (pH 7. O)、IOmM EDTA的緩沖液；或簡單地為經(jīng)EDTA 緩沖的水(pH 7.0)。
可將本發(fā)明的氨?；痶RNA加入翻譯反應(yīng)中以便將使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻譯反應(yīng)所制造的多肽中選擇的位置中。可使用本發(fā)明的氨?；痶RNA的翻譯系統(tǒng)的實例包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。細(xì)胞溶解產(chǎn)物提供從輸入的mRNA活體外翻譯多肽必需的反應(yīng)組件。所述反應(yīng)組件的實例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延長因子以及與翻譯有關(guān)的其它因子。此外，翻譯系統(tǒng)可為批量翻譯或區(qū)域化翻譯。批量翻譯系統(tǒng)將反應(yīng)組件組合于單一隔室中，而區(qū)域化翻譯系統(tǒng)使翻譯反應(yīng)組件與可抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分離。所述翻譯系統(tǒng)均有市售。另外，可使用偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)的mRNA，其接著經(jīng)反應(yīng)組件翻譯。市售偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(tǒng)(RapidTranslation System) (RTS, Roche Inc.)。所述系統(tǒng)包括含有提供翻譯組件(諸如核糖體和翻譯因子)的大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物。此外，還包括RNA聚合酶以將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成供翻譯使用的mRNA模板。RTS可使用借助插入到反應(yīng)隔室(包括供應(yīng)/廢物隔室和轉(zhuǎn)錄/翻譯隔室)之間的膜區(qū)域化反應(yīng)組件。tRNA的氨?；梢云渌噭┻M(jìn)行，所述試劑包括(但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化抗體、多功能蛋白等。iH交氨釀基tRNA合成酶(O-RS)O-RS優(yōu)先利用所選氨基酸在活體外或活體內(nèi)使本發(fā)明的0-tRNA氨酰基化?？赏ㄟ^包括O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的聚核苷酸將本發(fā)明的O-RS提供到翻譯系統(tǒng)(例如，活體外翻譯組件，或細(xì)胞)中。O-RS或其部分是由聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列或其保守變異體編碼?？赏ㄟ^多種不同的O-RS分子(包括但不限于，本文所述的分子)將本發(fā)明的0-tRNA氨?；?。鑒別與0-tRNA (例如，0-tRNA) 一起使用的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)(例如，0-RS)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來說，方法包括使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)歷陽性選擇，其中所述細(xì)胞各自包含1)多種氨?；鵷RNA合成酶(RS)的成員，其中所述多種RS包含突變體RS、從除第一物種以外的物種得到的RS或突變體RS和從除第一物種以外的物種得到的RS ;2)來自第二物種的正交tRNA (0-tRNA);和3)編碼陽性選擇標(biāo)記并且包含至少一個選擇性密碼子的聚核苷酸。選擇或篩選細(xì)胞中與缺乏多種RS中的成員或具有減少量的多種RS中的成員的細(xì)胞相比展示增強的抑制效率的細(xì)胞。抑制效率增強的細(xì)胞包含使O-tRNA氨?；幕钚訰S。將活性RS使來自第一物種的第一組tRNA氨?；乃?活體外或活體內(nèi))與活性RS使來自第二物種的第二組tRNA氨酰基化的水平(活體外或活體內(nèi))相比較。氨酰基化水平可通過可檢測物質(zhì)(例如，經(jīng)標(biāo)記氨基酸或非天然氨基酸)測定。選擇與第一組tRNA相比使第二組tRNA更有效氨?；幕钚訰S，借此提供與O-tRNA一起使用的正交氨酰基tRNA合成酶。由所述方法鑒別的O-RS (例如，0-RS)也為本發(fā)明的特征。可使用多種檢定中的任一種測定氨?；＿@些檢定可在活體外或活體內(nèi)進(jìn)行。舉例來說，活體外氨?；瘷z定描述于例如Hoben, P.和Soil, D. (1985)MethodsEnzymoI. 113:55-59以及美國專利申請公開案第2003/0228593號中。也可通過使用報告基因和正交翻譯組件，并且檢測表達(dá)包含至少一個選擇性密碼子且編碼蛋白質(zhì)的聚核苷酸的 細(xì)胞中的報告基因來測定氨?；?。也參看名稱為“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS” 的美國專利申請案 10/126,927 ;和名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE” 的 USSN 10/825,867?？蛇M(jìn)一步對經(jīng)鑒別的O-RS進(jìn)行操縱以改變合成酶的底物特異性，從而僅所需非天然氨基酸而非常見20種氨基酸中的任一種載到O-tRNA上。產(chǎn)生對非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨?；鵷RNA合成酶的方法包括使合成酶(例如)在合成酶的活性位點處、合成酶的編輯機制位點處、通過組合合成酶不同域得到的不同位點處等突變，和應(yīng)用選擇方法。使用基于陽性選擇隨后陰性選擇的組合的策略。在陽性選擇中，對陽性標(biāo)記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制使細(xì)胞在陽性選擇壓力下存活。因此，在存在天然和非天然氨基酸的情況下，存活者編碼使正交抑制性tRNA載上天然或非天然氨基酸的活性合成酶。在陰性選擇中，對陰性標(biāo)記的非必需位置處引入的選擇性密碼子的抑制將去除具有天然氨基酸特異性的合成酶。陰性選擇和陽性選擇的存活者編碼僅利用非天然氨基酸使正交抑制性tRNA氨酰基化(裝載)的合成酶。隨后，可使這些合成酶經(jīng)歷進(jìn)一步的誘變，例如DNA改組或其它遞歸式誘變方法?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生突變體O-RS文庫。舉例來說，可通過位點特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合產(chǎn)生突變體RS。舉例來說，可由兩種或兩種以上其它(例如)較小、較少不同的“子文庫”來產(chǎn)生突變體RS文庫。RS的嵌合文庫也包括在本發(fā)明中。應(yīng)注意，視情況構(gòu)建來自各種有機體(例如，微生物，諸如真細(xì)菌或古細(xì)菌)的tRNA合成酶文庫，諸如，包含天然多樣性的文庫(例如參看Short等人的美國專利第6，238，884號；Schallenberger等人的美國專利第5，756，316號；Petersen等人的美國專利第5，783，431號！Thompson等人的美國專利第5，824，485號；Short等人的美國專利第5，958，672號)；并且篩選正交對。使合成酶經(jīng)歷陽性和陰性選擇/篩選策略后，隨后可使這些合成酶經(jīng)歷進(jìn)一步誘變。舉例來說,可分離編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產(chǎn)生(例如，通過隨機誘變、位點特異性誘變、重組或其任何組合)一組編碼突變O-RS的聚核苷酸；并且可重復(fù)這些個別步驟或這些步驟的組合直到獲得優(yōu)先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨?；耐蛔?-RS。在本發(fā)明一個方面中，進(jìn)行所述步驟多次，例如至少2次。
還可將不同程度的選擇/篩選嚴(yán)格度用于本發(fā)明的方法中，以用于產(chǎn)生O-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對。所述方法的一個或兩個步驟的選擇或篩選嚴(yán)格度可變化以產(chǎn)生O-RS0這可包括(例如)改變所使用的選擇劑/篩選劑的量等。也可進(jìn)行其它回合的陽性選擇和/或陰性選擇。選擇或篩選也可包含一次或一次以上陽性或陰性選擇或篩選，所述選擇或篩選包括(例如)氨基酸滲透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯保真度的改變等。通常，一種或一種以上改變是基于使用正交tRNA-tRNA合成酶對制造蛋白質(zhì)的有機體中一個或一個以上基因的突變。可將針對(例如)O-RS、O-tRNA和0-tRNA/0-RS對的其它類選擇用于本發(fā)明中。陽性選擇標(biāo)記可為多種分子中的任一種，包括(但不限于)提供營養(yǎng)補充以供生長的產(chǎn)物，并且在缺乏營養(yǎng)補充的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。編碼陽性選擇標(biāo)記的聚核苷酸的實例包括(但不限于)例如基于補充細(xì)胞的氨基酸營養(yǎng)缺陷型的報告基因、his3基因(例如，其中his3基因編碼通過提供3-氨基三唑(3-AT)檢測的咪唑甘油磷酸脫氫酶)、ura3基因、leu2基因、lys2 基因、IacZ基因、adh基因等。例如參看G. M. Kishore, & D. M. Shah, (1988), Amino acidbiosynthesis inhibitors as herbicides, Annual Review of Biochemistry57:627—663。 在一個實施例中，IacZ的產(chǎn)生是通過鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解檢測。例如參看 I. G. Serebriiskii, & E. A. Golemis, (2000), Uses of IacZ to studygene function: evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeasttwo-hybrid system, Analytical Biochemistry 285:1-15。其它陽性選擇標(biāo)記包括(例如)熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，GAL4)等。視情況，編碼陽性選擇標(biāo)記的聚核苷酸包含選擇性密碼子?？蓪⒕幋a陽性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可操作地連接到反應(yīng)元件。還可存在編碼調(diào)節(jié)反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白且包含至少一個選擇性密碼子的額外聚核苷酸。通過經(jīng)非天然氨基酸氨?；腛-tRNA將非天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中將引起編碼陽性選擇標(biāo)記的聚核苷酸(例如，報告基因)的轉(zhuǎn)錄。視情況，選擇性密碼子位于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合域的一部分聚核苷酸中或?qū)嵸|(zhì)上臨近編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合域的一部分聚核苷酸。也可將編碼陰性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可操作地連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)元件。例如參看 A. J. DeMaggio 等人，(2000)，The yeast split-hybridsystem, Method Enzymol. 328:128-137 ；H. M. Shih 等人，(1996)，A positive geneticselection for disrupting protein-protein interactions:identification ofCREB mutations that prevent association with the coactivator CBP, Proc. Natl.Acad.Sci.U. S. A. 93:13896-13901 ；M. Vidal 等人，(1996)，Genetic characterizationof a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reversetwo-hybrid system, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 10321-10326 ；和 M. Vidal 等人,(1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociationof protein-protein and DNA-protein interactions (Proc.Natl.Acad. Sci.U. S. A. 93:10315-10320)。通過經(jīng)天然氨基酸氨?；腛-tRNA將天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中將引起陰性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。視情況，陰性選擇標(biāo)記包含選擇性密碼子。本發(fā)明的陽性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可包含至少兩個選擇性密碼子，所述標(biāo)記各自或都可包含至少兩個不同的選擇性密碼子或至少兩個相同的選擇性密碼子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白為與核酸序列(例如，反應(yīng)元件)(直接或間接)結(jié)合并且調(diào)節(jié)可操作地連接到反應(yīng)元件的序列的轉(zhuǎn)錄的分子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可為轉(zhuǎn)錄活化蛋白(例如，GAL4、核激素受體、APU CREB, LEF/tcf家族成員、SMAD, VP16、SPl等)、轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可視環(huán)境而具有兩種活性的蛋白質(zhì)(例如，LEF/tcf、同源盒蛋白等)。反應(yīng)元件通常為由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白識別的核酸序列或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白協(xié)同作用的額外試劑。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的另ー實例為轉(zhuǎn)錄活化蛋白GAL4。例如參看A. Laughon等人,(1984), Identification of two proteins encoded by the Saccharomycescerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:268-275 ；A. Laughonj &R. F.Gestelandj (1984)，Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4gene,Molecular & Cellular Biology4:260-267 ;L Keegan 等人，(1986)，Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryoticregulatory protein, Science 231:699-704 ；和 Μ· Ptashne，(1988), How eukaryotictranscriptional activators work, Nature 335:683-689。這ー具有 881 個氨基酸的蛋白質(zhì)的N末端147個氨基酸形成特異性結(jié)合DNA序列的DNA結(jié)合域(DBD)。例如參看M. Carey 等人，(1989)，An amino-terminal fragment of GAL4binds DNA as a dimer, J.Mol. Biol. 209:423-432 ;和 E. Giniger 等人，(1985)，Specific DNAbinding of GAL4, apositive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774。DBD 是通過插入的蛋白質(zhì)序列連接到當(dāng)與DNA結(jié)合時可活化轉(zhuǎn)錄的C末端113個氨基酸活化域(AD)。例如參看J. Maj & M. Ptashnej (1987)，Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptionalactivating segments,Cell 48:847-853;和 J. Ma，& M. Ptashne, (1987),Thecarboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80,Cell50:137-142。通過將琥珀密碼子朝向(例如)含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的單一聚核苷酸的N末端DBD放置，可將0-tRNA/0-RS對的琥珀抑制連接到GAL4進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄活化?？墒褂肎AL4活化的報告基因進(jìn)行利用所述基因進(jìn)行的陽性選擇和陰性選擇。用于陰性選擇的培養(yǎng)基可包含轉(zhuǎn)化成通過陰性選擇標(biāo)記可檢測的物質(zhì)的選擇劑或篩選劑。在本發(fā)明ー個方面中，可檢測物質(zhì)為有毒物質(zhì)。編碼陰性選擇標(biāo)記的聚核苷酸可為(例如)ura3基因。舉例來說，可將URA3報告基因放在含有GAL4 DNA結(jié)合位點的啟動子的控制下。當(dāng)例如通過翻譯具有選擇性密碼子的編碼GAL4的聚核苷酸來制造陰性選擇標(biāo)記時，GAL4將活化URA3的轉(zhuǎn)錄。陰性選擇是在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基上實現(xiàn)，所述5-F0A轉(zhuǎn)化成通過ura3基因的基因產(chǎn)物可檢測的物質(zhì)(例如，殺死細(xì)胞的有毒物質(zhì)) 例如參看 J. D. Boeke 等人，(1984)，Apositive selection for mutantslacking orotidine—5 -phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluorooroticacid resistance,Molecular & General Genetics 197:345-346) ；M.Vidal 等人，、1996)，Genetic characterization of a mammalian protein-proteininteraction domain by using a yeast reverse two-hybrid system. , Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 93:10321—10326 ;和 M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid andone-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-proteininteractions.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320。如同陽性選擇標(biāo)記一祥，陰性選擇標(biāo)記也可為多種分子中的任ー種。陽性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可為發(fā)熒光或在存在適當(dāng)反應(yīng)物的情況下催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。舉例來說，陰性選擇標(biāo)記包括(但不限于)例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素こ酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、IacZ基因的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等。陽性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可通過熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過發(fā)光來檢測。陽性選擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記可包含基于親 和力的篩選標(biāo)記。同一聚核苷酸可編碼陽性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記。舉例來說，陽性選擇步驟、陰性選擇步驟或陽性選擇和陰性選擇步驟可包括使用報告基因，其中所述報告基因是通過熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)檢測。舉例來說，陽性選擇可首先用陽性選擇標(biāo)記(例如，氯霉素こ酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因)進(jìn)行，其中所述CAT基因在所述CAT基因中包含選擇性密碼子(例如，琥珀終止密碼子)；隨后進(jìn)行陰性選擇篩選，其是基于無法抑制陰性選擇標(biāo)記(例如，T7RNA聚合酶基因)內(nèi)各位置處的(例如，兩個或兩個以上)選擇性密碼子。陽性選擇標(biāo)記和陰性選擇標(biāo)記可見于同一載體(例如質(zhì)粒)上。陰性標(biāo)記的表達(dá)將驅(qū)動報告基因(例如，綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP))的表達(dá)。選擇和篩選的嚴(yán)格度可變化，例如使報告基因發(fā)熒光所需的光強度可變化。陽性選擇可利用通過FACS篩選隨后陰性選擇篩選的報告基因作為陽性選擇標(biāo)記進(jìn)行，所述陰性選擇篩選是基于無法抑制陰性標(biāo)記(例如，barnase基因)內(nèi)各位置處的(例如，兩個或兩個以上)選擇性密碼子。視情況，報告基因是在細(xì)胞表面(例如，噬菌體呈現(xiàn)等)上呈現(xiàn)。細(xì)胞表面呈現(xiàn)(例如，基于OmpA的細(xì)胞表面呈現(xiàn)系統(tǒng))取決于大腸桿菌細(xì)胞表面上特定抗原決定基(例如，融合到外膜孔蛋白OmpA的脊髄灰質(zhì)炎病毒C3肽)的表達(dá)。所述抗原決定基僅在翻譯期間抑制蛋白質(zhì)信使中的選擇性密碼子時呈現(xiàn)于細(xì)胞表面上。隨后所呈現(xiàn)的肽含有由文庫中的一個突變體氨?；鵷RNA合成酶所識別的氨基酸，并且含有相應(yīng)合成酶基因的細(xì)胞可利用針對含有特定非天然氨基酸的肽所產(chǎn)生的抗體分離?；贠mpA的細(xì)胞表面呈現(xiàn)系統(tǒng)經(jīng)Georgiou等人研發(fā)并且優(yōu)化以作為曬菌體呈現(xiàn)的替代選擇。參看Francisco, J.A.，Campbell, R.，丄verson，B. L. & beorgoiu, G. Production ana fluorescence-activatedcell sorting oi Escherichia coli expressing a functional antibody fragment onthe external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10444-8(1993)。本發(fā)明的其它實施例包括在活體外執(zhí)行ー個或ー個以上選擇步驟。隨后可將所選組件(例如，合成酶和/或tRNA)引入細(xì)胞中以用于活體內(nèi)并入非天然氨基酸。制造O-RS并且改變合成酶的底物特異性的其它細(xì)節(jié)可見于名稱為“Methods andCompositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA SynthetasePairs” 的美國專利申請案 10/126，931 和名稱為 “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE”的USSN 10/825,867中，所述文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。制造O-RS的其它細(xì)節(jié)可見于 Hamano-Takaku 等人，(2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASyntnetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine,Journal of Biological Chemistry，275(51):40324-40328 ;Kiga 等人(2002)，An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specificincorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotictranslation and its application in a wheat germ cell-free system,PNAS99(15) :9715-9723 ;和 Francklyn 等人，(2002)，Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatileplayers in the changing theater of translation;RNA，8:1363-1372 中，各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。來源和宿主有機體本發(fā)明的翻譯組件通常是從非真核有機體得到。舉例來說，正交Ο-tRNA可從非真核有機體得到，例如古細(xì)菌，諸如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-I )、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，而正交O-RS可從非真核有機體得到，例如嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個實施例中，也可使用真核來源，包括(但不限干)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物(例如，哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)等。0-tRNA/0-RS對的個別組件可從相同有機體或不同有機體得到。在一個實施例中，0-tRNA/0-RS對是來自相同有機體。或者，0-tRNA/0-RS對中的Ο-tRNA和O-RS是來自不同有機體。舉例來說，Ο-tRNA可從(例如)嗜鹽古菌NRC-I得到，并且O-RS可從(例如)嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌得到。可在活體內(nèi)或活體外選擇或篩選0-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對和/或?qū)⑵溆糜诩?xì)胞(例如，非真核細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞)中以產(chǎn)生具有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。非真核細(xì)胞可來自各種來源，諸如古細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育領(lǐng)域，包括(但不限干)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或可屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育領(lǐng)域(包括但不限于，大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等)等。真核細(xì)胞可來自各種來源，包括(但不限干)植物(例如，復(fù)雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括但不限干，釀酒酵母)、動物(包括但不限于，哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)等。具有本發(fā)明的翻譯組件的細(xì)胞組合物也為本發(fā)明的特征。有關(guān)篩選一種物種中的Ο-tRNA和/或O-RS供另一物種使用，也參看名稱為“Expanding the Eukaryotic Genetic Code” 的 USSN 10/825,867。 為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)具有所選氨基酸的所關(guān)注的多肽，可將編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，且如果針對編碼蛋白質(zhì)的核酸，那么還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點。適當(dāng)?shù)募?xì)菌啟動子已為所屬領(lǐng)域眾所周知并且描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。表達(dá)所關(guān)注的多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可用于(包括但不限干)大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus sp.)、突光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和沙門氏菌(Salmonella)中(Palva 等人，Gene 22:229-235(1983) ;Mosbach 等人，Nature 302:543-545 (1983))。所述表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒在市面有售。哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知且也在市面有售?？蓪⒈景l(fā)明的tRNA和/或RS和/或所關(guān)注的多肽用于多種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)(例如包括，酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌沖和/或在所述系統(tǒng)中表達(dá)。有關(guān)例示性表達(dá)系統(tǒng)的描述將于下文中提供。璧里如本文所使用，術(shù)語“酵母”包括能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的多種酵母中的任ー種。所述酵母包括(但不限于)產(chǎn)子囊(ascosporogenous)酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales ))λ產(chǎn)擔(dān)抱子(basidiosporogenous)酵母和屬于半知菌類(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為兩個家族，即蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae )。酵母科是由四個亞家族構(gòu)成，即裂埴酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂通酵母屬(genus Schizosaccharomyces))Λ拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母菌亞科(Saccharomycoideae)(例如，畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母菌屬(Saccharomyce))。產(chǎn)擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲抱酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)和擬線黑粉酵母屬(Filobasidiella)。屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母分為兩個家族，即擲 (Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假絲酵母屬(Candid))。 用于本發(fā)明的特別值得關(guān)注的為畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、(Hansenula)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬(Candida)內(nèi)的種，包括(但不限于)巴氏畢赤酵母(P. pastoris)、季氏畢赤酵母(P. guiIlerimondii)、釀酒酵母(S. cerevisiae)、卡爾斯伯酵母(S. carlsbergensis)、糖化酵母(S. diastaticus)、道格拉斯酵母(S. douglasii)、克氏酵母(S. kluyveri)、諾氏酵母(S. norbensis)、卵形酵母(S. oviformis)、乳酸克魯維斯酵母(K. Iactis)、脆壁克魯維斯酵母(K. fragilis)、白假絲酵母(C. albicans)、麥芽假絲酵母(C. maltosa)和多形漢遜酵母(H.p0lymOTpha)。酵母一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(xué)(Berkeley，CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系酵母基因儲備中心(Yeast Genetic Stockしenter，Department of Biophysics and Medica丄 Physics，University of Californiaノ和美國典型微生物菌種保藏中心(American Type Culture Collection，“ATCC”)(Manassas, VA)。術(shù)語“酵母宿主”或“酵母宿主細(xì)胞”包括可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的酵母。所述術(shù)語包括已接收重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，単一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。已研發(fā)表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(包括染色體外復(fù)制子或整合載體)以用于轉(zhuǎn)化到許多酵母宿主中。舉例來說，已研發(fā)針對下述的表達(dá)載體釀酒酵母(SikOTski等人，Genetics (1989) 122:19 ；Ito 等人，J.Bacteriol. (1983) 153:163 ;Hinnen 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929);白假絲酵母(Kurtz 等人，Mol. CELL.Biol. (1986)6:142);麥芽假絲酵母(Kunze 等人，J. BASIC MICROBIOL (1985)25:141)；多形漢遜酵母(Gleeson 等人，J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459 ； Roggenkamp 等人，Mol. Genetics and genomics (1986) 202:302);脆壁克魯維斯酵母(Das 等人，J.Bacteriol. (1984) 158:1165);乳酸克魯維斯酵母(De Louvencourt 等人,J. Bacteriol.(1983) 154:737 ；Van den Berg 等人,Biotechnology (ny) (1990) 8:135);李氏畢赤酵母(Kunze 等人，J. Basic Microbiol. (1985)25:141);巴氏畢赤酵母(美國專利第 5，324，639號；第4，929,555 號；和第4，837，148 號;Cregg 等人，Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376);粟酒裂殖酵母(Beach等人，NATURE (1982) 300:706);和耶羅威亞解脂酵母((Y. lipolytics)、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans) (Balance 等人，BIOCHEM. BIOPHYS. RES. Commun. (1983) 112:284-89 ；Tilburn 等人，Gene (1983)26:205-221 ;和 Yelton 等人，Proc.Natl. Acad.SCI.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(A. niger) (Kelly 和 Hynes, EMBO J. (1985)4:475-479)；木霉(T.reesia) (EP 0 244 234);和絲狀真菌，諸如土壤真菌(Neurospora)、青霉屬(PeniciIlium)、彎頸霉(Tolypocladium) (W091/00357)。酵母載體的控制序列已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且包括(但不限干)來自下述基因的啟動子區(qū)諸如醇脫氫酶(ADH)(EP O 284 044);烯醇化酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3_磷酸甘油 酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK) (EP O 329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的啟動子序列(Miyanohara 等人,PROC. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它適當(dāng)?shù)膯幼有蛄锌砂?-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J. BI0L.Chem. (1980) 255:12073)和其它糖酵解酶(諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)(Holland 等人，BIOCHEMISTRY(1978) 17:4900 ；Hess 等人，J. Adv. Enzyme Reg.(1969)7:149)的啟動子。具有受生長條件所控制的其它轉(zhuǎn)錄優(yōu)點的可誘導(dǎo)酵母啟動子可包括醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。用于酵母表達(dá)的適當(dāng)載體和啟動子進(jìn)ー步描述于EP O 073 657中。酵母增強子還可與酵母啟動子合用。此外，合成啟動子也可用作酵母啟動子。舉例來說，可將酵母啟動子的上游活化序列(UAS)與另ー酵母啟動子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動子。所述雜合啟動子的實例包括連接到GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)的ADH調(diào)控序列。參看美國專利第4，880，734號和第4，876，197號，其是以引用的方式并入本文中。雜合啟動子的其它實例包括由ADH2、GAL4、GALlO或PH05基因的調(diào)控序列與糖酵解酶基因(諸如GAP或PyK)的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)組成的啟動子。參看EP O 164 556。此外，酵母啟動子可包括具有結(jié)合酵母RNA聚合酶并且起始轉(zhuǎn)錄的能力的非酵母來源的天然存在的啟動子?？山M成部分酵母表達(dá)載體的其它控制元件包括(例如)來自GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(Holland等人，J.BI0L. Chem. (1981)256:1385)。此外，2μ質(zhì)粒來源的復(fù)制起點適用于酵母。用于酵母中的適當(dāng)選擇基因為存在于酵母質(zhì)粒中的trpl基因。參看Tschumper 等人,Gene (1980) 10:157 ；Kingsman 等人,Gene (1979) 7:141。trpl 基因提供針對缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變菌株的選擇標(biāo)記。類似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20, 622或38，626)通過具有Leu2基因的已知質(zhì)粒補充。將外源DNA引入酵母宿主中的方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且通常包括(但不限干)原生質(zhì)球的轉(zhuǎn)化或經(jīng)堿陽離子處理的完整酵母宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。舉例來說，酵母的轉(zhuǎn)化可根據(jù) Hsiao 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:3829 和 Van Solingen 等人，J. Bact. (1977) 130:946中所述的方法進(jìn)行。然而，也可如Sambrook等人，MolecularCloningiA Lab. Manual (2001)中一般所述，使用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，諸如細(xì)胞核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合。隨后可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)酵母宿主細(xì)胞。在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的其它方法已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一般參看美國專利公開案第20020055169號；美國專利第6，361，969號；第6，312，923 號；第 6，183，985 號；第 6，083，723 號；第 6，017，731 號；第 5，674，706 號；第5，629，203號；第5，602，034號；和第5，089，398號；美國再審專利第RE37, 343號和第 RE35, 749 號；PCT 公開專利申請案 WO 99/07862 ；W0 98/37208 ；和 WO 98/26080 ；歐洲專利申請案 EP O 946736 ；EP O 732 403 ；EP O 480 480 ；W0 90/10277 ；EP 0 340986 ；EP 0 329 203 ；EP 0 324274 ;和 EP 0 164 556。也參看 Gellissen 等人，AntonieVan Leeuwenhoek(1992)62(1-2) :79-93 ；Romanos 等人，Yeast(1992) 8(6) :423-488 ;Goedde I ,METHODS IN ENZYM0L0GY (1990) 185:3-7，各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。
在擴增階段，酵母宿主菌株可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)補料分批發(fā)酵方法在發(fā)酵罐中生長。所述發(fā)酵方法可用于說明特定酵母宿主的碳利用路徑或表達(dá)控制模式的差異。舉例來說，酵母菌屬(Saccharomyces)酵母宿主的發(fā)酵可能需要單ー葡萄糖原料、復(fù)合氮源(例如，酪蛋白水解物)和多種維生素補充。相比之下，甲醇酵母巴氏畢赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量礦物原料，但僅簡單銨(氮)鹽以供最佳生長和表達(dá)。例如參看美國專利第 5, 324, 639 號；Elliott 等人，J. Protein Chem. (1990)9:95 ;和 Fieschko 等人，Biotech. Bioeng. (1987) 29:1113，各文獻(xiàn)都是以引用的方式并入本文中。然而，所述發(fā)酵方法可具有與所使用的酵母宿主菌株無關(guān)的某些常見特征。舉例來說，可在擴增階段將限制生長的養(yǎng)分(通常為碳)加到發(fā)酵罐中以允許最大生長。此外，發(fā)酵方法一般使用經(jīng)設(shè)計以含有足量的碳、氮、基礎(chǔ)鹽(basal salt)、磷和其它微量養(yǎng)分(維生素、痕量礦物和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。適用于畢赤酵母屬的發(fā)酵培養(yǎng)基的實例描述于美國專利第5，324, 639號和第5，231，178號中，其是以引用的方式并入本文中。 感染桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞術(shù)語“昆蟲宿主”或“昆蟲宿主細(xì)胞”是指可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的昆蟲。所述術(shù)語包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始昆蟲宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，単一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞的子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。表達(dá)所關(guān)注的多肽的適當(dāng)昆蟲細(xì)胞的選擇已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。數(shù)種昆蟲物種已在所屬領(lǐng)域中進(jìn)行充分描述并且在市面有售，包括埃及斑蚊(Aedes aegypti)、家香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophila meIanogaster)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇供表達(dá)的昆蟲宿主的過程中，適當(dāng)?shù)乃拗骺砂ń?jīng)證實尤其具有良好的分泌能力、低的蛋白水解活性和整體穩(wěn)定性的宿主。昆蟲一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(xué)(Berkeley，CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系昆蟲基因儲備中心(Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysicsand Medical Physics, University of California)和美國典型微生物菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas, VA)。一般說來，感染桿狀病毒的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的組件包括轉(zhuǎn)移載體，通常為細(xì)菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組的片段和插入欲表達(dá)的異源基因的便利限制性位點；具有與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列(這允許將異源基因同源重組到桿狀病毒基因組中)的野生型桿狀病毒；和適當(dāng)?shù)睦ハx宿主細(xì)胞和生長培養(yǎng)基。用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、揀選斑塊、使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長等的材料、方法和技術(shù)已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且可使用描述這些技術(shù)的手冊。將異源基因插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中，其中載體與病毒基因組重組。表達(dá)經(jīng)包裝的重組病毒并且對重組斑塊進(jìn)行鑒別和純化。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法是從(例如)Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)以試劑盒形式購得。這些技術(shù)一般為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且充分地描述于以弓I 用方式并入本文的 Summers and Smith, Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin No. 1555 (1987)中。也參看 Richardson, 39 Methods in MolecularBiology: Baculovirus Expression Protocols (1995) ;ausubel 等人，current protocolsin molecular biology 16.9-16. 11(1994) ;king 和 Possee, The Baculovirus System:ALaboratory Guide(1992)；矛ロ O’Reilly 等人,Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual(1992)。事實上，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知使用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的各種異源蛋白質(zhì)的制造。例如，參看美國專利第6，368，825號、第6，342，216號、第6，338，846號、第 6，261，805 號、第 6，245，528 號、第 6，225，060 號、第 6，183，987 號、第 6，168，932 號、第 6，126，944 號、第 6，096，304 號、第 6，013，433 號、第 5，965，393 號、第 5，939，285 號、第 5，891，676 號、第 5，871，986 號、第 5，861，279 號、第 5，858，368 號、第 5，843，733 號、第5，762，939 號、第 5，753，220 號、第 5，605，827 號、第 5，583，023 號、第 5，571，709 號、第5，516，657 號、第 5，290，686 號、WO 02/06305、WO 01/90390、WO 01/27301、W001/05956、WO 00/55345、WO 00/20032、WO 99/51721、WO 99/45130、WO 99/31257、WO 99/10515、WO 99/09193、WO 97/26332、WO 96/29400、WO 96/25496、WO 96/06161、WO 95/20672、WO 93/03173、WO 92/16619、WO 92/02628、WO 92/01801、WO 90/14428、WO 90/10078、WO90/02566、WO 90/02186,WO 90/01556、WO 89/01038,WO 89/01037、WO 88/07082，所述專利都是以引用的方式并入本文中?？捎糜跅U狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體已為所屬領(lǐng)域中所知并且包括(例如)自桿狀病毒苜猜尺蠖(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)獲得的昆蟲表達(dá)和轉(zhuǎn)移載體，其為非輔助依賴性病毒表達(dá)載體(helper-independent viral expressionvector)。源自這一系統(tǒng)的病毒表達(dá)載體通常使用強的病毒多角體蛋白基因啟動子來驅(qū)動異源基因的表達(dá)。一般參看O’Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors: ALaboratory Manual(1992)。在將外來基因插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件(包含啟動子、前導(dǎo)序 列(視需要)、所關(guān)注的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列)組裝成中間移位構(gòu)筑體(intermediatetransplacement construct)(轉(zhuǎn)移載體)。中間移位構(gòu)筑體通常保持在復(fù)制子中，諸如能夠在宿主(諸如細(xì)菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(例如，質(zhì)粒)。復(fù)制子將具有復(fù)制系統(tǒng)，因此使其能夠保持在適當(dāng)宿主中以供克隆和擴増。更具體地說，質(zhì)?？珊卸嘟求w蛋白聚腺苷酸化信號(Miller, Ann. Rev. Microbiol. (1988)42:177)和原核生物氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和復(fù)制起點以在大腸桿菌中選擇和繁埴。將外來基因引入AcNPV的ー種常用轉(zhuǎn)移載體為pAc373。也已設(shè)計出許多所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體，包括(例如)PVL985，其將多角體蛋白起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT并且在ATT下游32個堿基對處引入BamHI克隆位點。參看Luckow和Summers, VIROLOGY170:31(1989)。其它市售載體包括(例如)PBlueBac4. 5/V5_His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBiueBac4. 5 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)。插入異源基因后，將轉(zhuǎn)移載體和野生型桿狀病毒基因組共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞宿主中。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點中的方法已為所屬領(lǐng)域所知。參看Summers和Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) ；Smith 等人，MOL. CELL. Biol. (1983) 3:2156 ；Luckow和 Summers, VIROLOGY(1989) 170:31。舉例來說，可通過同源雙交換重組插入到基因(諸如多角體蛋白基因)中；也可插入到工程設(shè)計于所需 桿狀病毒基因中的限制性酶位點中。參看Miller等人，BIOESSAYS (1989) 11 (4) : 91。轉(zhuǎn)染可通過電穿孔實現(xiàn)。參看Trotter和Wood, 39 Methods INMolecular Biology (1995) ；Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501。 或者，可使用脂質(zhì)體利用重組表達(dá)載體和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。例如參看Liebman等人,Biotechniques(1999)26(I) :36 ；Graves 等人,Biochemistry(1998) 37:6050 ；Nomura等人，J. Biol. Chem. (1998)273(22):13570 ；Schmidt 等人，Protein Expression andPurification(1998)12:323 ;SifTert 等人，Nature Genetics(1998)18:45 ；Tilkins 等A, Cell Biology :A Laboratory Handbookl45-154 (1998) ;Cai 等人，Protein Expressionand Purification(1997) 10:263 ;Dolphin 等人，Nature Genetics (1997) 17:491 ；Kost 等人，Gene (1997) 190:139 Jakobsson 等人，J. Biol. Chem. (1996)271:22203 ；Rowles 等人,J. Biol. Chem. (1996) 271 (37) : 22376 ；Reverey 等人,J. Biol. Chem.(1996)271(39) :23607-10 !Stanley 等人,J. Biol. Chem. (1995)270:4121 ；Sisk 等人，J.VIROL. (1994) 68 (2) : 766 ；和 Peng 等人，BIOTECHNIQUES (1993) 14 (2) : 274。市售脂質(zhì)體包括(例如)Cellfectin 和 Lipofectin (Invitrogen, Corp.，Carlsbad, CA)。此外，還可使用憐酸I丐轉(zhuǎn)染法。參看 Trotter 和 Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995)；Kitts, NAR(1990) 18 (19):5667 ;和 Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501。桿狀病毒表達(dá)載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子是能夠結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3’)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子將具有通常放在接近編碼序列5’端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始位點。桿狀病毒啟動子也可具有稱為增強子的第二域，如果存在，那么其通常在結(jié)構(gòu)基因的遠(yuǎn)端。此外，表達(dá)可為經(jīng)調(diào)控表達(dá)或組成性表達(dá)。在感染循環(huán)的后期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供特別有用的啟動子序列。實例包括從編碼病毒多角體蛋白的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression,在 THE MOLECULAR Biology OF Baculoviruses (1986)中；EP 0 127 839 和 0155 476)和編碼plO蛋白的基因(Vlak等人，J. Gen. Virol. (1988)69:765)得到的序列。將新近形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝于感染性重組桿狀病毒中并且隨后可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對所生長的斑塊進(jìn)行純化。參看Miller等人，BIOESSAYS(1989) 11 (4):91 ;Summers 和 Smith, Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin No. 1555(1987)。已研發(fā)出重組桿狀病毒表達(dá)載體以感染到若干昆蟲細(xì)胞中。舉例來說，已研發(fā)出重組桿狀病毒用于(尤其)埃及斑蚊(ATCC第CCL-125號)、家蠶(ATCC第CRL-8910號)、黑腹果蠅(ATCC第1963號)、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾。參看Wright, Nature (1986) 321:718 ；Carbonell 等人，J. VIROL. (1985) 56:153 ;Smith 等人，Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156。一般參看Fraser等人，In Vitro Cell. Dev. Biol. (1989) 25:225。更具體來說，用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的細(xì)胞系通常包括(但不限于)Sf9 (草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號)、Sf21 (草地貪夜蛾)(Invitrogen Corp.,目錄號 11497-013 (Carlsbad, CA))、Tri_368 (粉紋夜蛾)和 High-Five BTI-TN-5B1-4 (粉紋夜蛾)。細(xì)胞和培養(yǎng)基可為市售以用于在桿狀病毒/表達(dá)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽，并且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一般為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。 大腸桿菌、假單胞菌屬和其它原核生物所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知細(xì)菌表達(dá)技木。多種載體可用于細(xì)菌宿主中。所述載體可以為單一拷貝或者低或高多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達(dá)。鑒于存在有關(guān)載體、許多載體市面有售以及甚至描述載體和其限制性圖譜與特征的手冊的大量文獻(xiàn)，此處就不需要多加論述。眾所周知，載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記，這些標(biāo)記可提供細(xì)胞毒性劑抗性、原養(yǎng)性或免疫性。通常，存在將提供不同特征的多種標(biāo)記。細(xì)菌啟動子是能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并且起始編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3’)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子將具有通常放在接近編碼序列5’端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始位點。細(xì)菌啟動子也可具有稱為操縱子的第二域，其可與開始RNA合成的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點重疊。當(dāng)基因阻遏蛋白可結(jié)合操縱子并且由此抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄時，操縱子允許負(fù)調(diào)控(可誘導(dǎo))轉(zhuǎn)錄。組成性表達(dá)可在不存在負(fù)調(diào)控元件(諸如操縱子)的情況下發(fā)生。此外，可通過基因活化蛋白結(jié)合序列(如果存在，則通常鄰近(5’)RNA聚合酶結(jié)合序列)實現(xiàn)正調(diào)控。基因活化蛋白的實例為分解代謝物活化蛋白(CAP)，其幫助起始大腸桿菌中Iac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人，Annu. Rev. Genet. (1984) 18:173]。因此，調(diào)控表達(dá)可為正或負(fù)調(diào)控表達(dá)，由此增強或減弱轉(zhuǎn)錄。編碼代謝路徑酶的序列提供特別有用的啟動子序列。實例包括自糖代謝酶獲得的啟動子序列，諸如，半乳糖、乳糖(lac) [Chang等人，NATURE(1977) 198:1056]和麥芽糖。其它實例包括自生物合成酶獲得的啟動子序列，諸如色氨酸(trp) [Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES. (1980)8:4057 ;Yelverton 等人,Nucl. Acids Res. (1981)9:731 ;美國專利第4，738，921號；EP公開案第036 776號和第121 775號，其是以引用的方式并入本文中]ο β -半乳糖苷酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weissmann (1981) “The cloning of interferonand other mistakes.，，In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)λ PL[Shimatake 等人，Nature (1981) 292:128]和T5 [美國專利第4，689，406號，其是以引用的方式并入本文]啟動子系統(tǒng)也提供有用的啟動子序列。可使用強啟動子(諸如Τ7啟動子)以高水平誘導(dǎo)所關(guān)注的多肽。所述載體的實例已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且包括來自Novagen的ρΕΤ29系列和W099/05297 (其是以引用的方式并入本文)中所述的pPOP載體。所述表達(dá)系統(tǒng)在不損害宿主細(xì)胞的活力或生長參數(shù)的情況下于宿主中產(chǎn)生高水平的多肽。PET19 (Novagen)為所屬領(lǐng)域已知的另ー載體。此外，自然界中不存在的合成啟動子也可充當(dāng)細(xì)菌啟動子。舉例來說，可將ー種細(xì)菌或噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄活化序列與另ー種細(xì)菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動子[美國專利第4，551，433號，其是以引用的方式并入本文中]。舉例來說，tac啟動子為由trp啟動子與Iac操縱子序列構(gòu)成的雜合trp-lac啟動子,其受到 Iac 阻遏子調(diào)控[Amann 等人,Gene (1983) 25:167 ；de Boer 等人,Proc. Natl. Acad. Sci.(1983)80:21]。此外，細(xì)菌啟動子可包括具有結(jié)合細(xì)菌 RNA聚合酶并且起始轉(zhuǎn)錄的能力的非細(xì)菌來源的天然存在啟動子。也可將非細(xì)菌來源的天然存在的啟動子與可相容的RNA聚合物偶聯(lián)以使ー些基因在原核生物中高水平表達(dá)。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)為偶聯(lián)啟動子系統(tǒng)的實例[Studier 等人，J. Mol. BIOL. (1986) 189:113 ;Tabor 等人，Proc Natl.Acad. Sci. (1985)82:1074]。此外，雜合啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區(qū)構(gòu)成(EP公開案第267 851號)。除起作用的啟動子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點對于原核生物中外來基因的表達(dá)也有用。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點被稱為Shine-Dalgarno (SD)序列并且包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個核苷酸處3-9個核苷酸長的序列[Shine等人，Nature (1975) 254:34]。認(rèn)為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16S rRNA的3’端之間的喊基配對來促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[Steitz等人“Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA，，，In Biological Regulation and Development: GeneExpression (R. F. Goldberger編，1979)]。為表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點的真核基因和原核達(dá)因[Sambrookせ人‘‘Expression of cloned genes in Escherichia coli，，，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 1989]。術(shù)語“細(xì)菌宿主”或“細(xì)菌宿主細(xì)胞”是指可用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的細(xì)菌。所述術(shù)語包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于存在偶發(fā)突變或有意突變，単一親代細(xì)胞的子代的形態(tài)或基因組或總DNA補體可不必與原始親本完全相同。與親本足夠相似以通過相關(guān)特性(諸如，編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的存在)表征的親本細(xì)胞的子代包括在本定義所預(yù)期的子代中。表達(dá)多肽的適當(dāng)宿主細(xì)菌的選擇已為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在選擇供表達(dá)的細(xì)菌宿主的過程中，適當(dāng)?shù)乃拗骺砂ń?jīng)證實尤其具有良好的包涵體形成能力、低的蛋白水解活性和整體穩(wěn)定性的宿主。細(xì)菌宿主一般可從各種來源得到，包括(但不限干)加州大學(xué)(Berkeley，CA)生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)物理學(xué)系細(xì)菌基因儲備中心和美國典型微生物菌種保藏中心(“ATCC”)(Manassas, VA)。エ業(yè)/藥物發(fā)酵一般使用自K菌株獲得的細(xì)菌(例如W3110)或自B菌株獲得的細(xì)菌(例如，BL21)。由于這些菌株的生長參數(shù)眾所周知并且相當(dāng)穩(wěn)定，故其特別有用。此外，這些菌株為非病原性菌株，出于安全和環(huán)境原因，其在商業(yè)上也極為重要。適當(dāng)大腸桿菌宿主的其它實例包括(但不限干)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本發(fā)明方法的另ー個實施例中，大腸桿菌宿主為負(fù)蛋白酶菌株(protease minus strain),包括(但不限干)OMP-和L0N-。宿主細(xì)胞株可為假單胞菌屬，包括(但不限干)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知熒光假單胞菌生物型1(稱為菌株MBlOl)對于重組制造有用并且可用于治療性蛋白質(zhì)的制造過程中。假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)的實例包括購自TheDow Chemical Company的系統(tǒng)作為宿主菌株(Midland, Ml,可在國際互聯(lián)網(wǎng)dow. com上獲得)。美國專利第4，755，465號和第4，859，600號(以引用的方式并入本文中)中描述假單胞菌菌株作為宿主細(xì)胞用于hGH制造的用途。在產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞株(B卩，已將表達(dá)構(gòu)筑體引入宿主細(xì)胞中并且將具有適當(dāng)表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞分離)后，在適于制造所關(guān)注的多肽的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞株。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，重組宿主細(xì)胞株的培養(yǎng)方法將視所利用的表達(dá)構(gòu)筑體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的身份而定。通常使用所屬領(lǐng)域眾所周知的方法來培養(yǎng)重組宿主菌株。重組宿主細(xì)胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和無機鹽源并且視情況含有維生素、氨基酸、生長因子和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)培養(yǎng)補充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有用于防止不需要的微生物生長的抗生素或抗真菌齊U，和/或用于選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的化合物，包括(但不限干)抗生素?？梢苑峙蜻B續(xù)方式培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，且以分批或連續(xù)方式進(jìn)行細(xì)胞采集(在所關(guān)注的多肽在細(xì)胞內(nèi)積累的情況中)或進(jìn)行培養(yǎng)物上清液的采集。對于在原核宿主細(xì)胞 中制造來說，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細(xì)胞采集。詵擇件密碼子本發(fā)明的選擇性密碼子擴展蛋白質(zhì)生物合成機器的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇性密碼子包括(例如)獨特的三堿基密碼子；無義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限干)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA);非天然密碼子；四堿基(或更多堿基)密碼子；稀有密碼子等?？蓪⒍鄠€(例如ー個或ー個以上、兩個或兩個以上、三個或三個以上等)選擇性密碼子引入所需基因或多肽中。在一個實施例中，所述方法涉及使用為終止密碼子的選擇性密碼子以在活體內(nèi)并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)。舉例來說，制造識別終止密碼子并且通過O-RS用所選氨基酸氨?；摩?tRNA。天然存在的宿主氨?；鵷RNA合成酶不識別所述Ο-tRNA?？墒褂贸Ｒ?guī)定點誘變將終止密碼子引入所關(guān)注的多肽中的所關(guān)注的位點處。例如參看 Sayers, J. R.等人(1988), 5 ' -3，Exonucleases in phosphorotnioate—basedoligonucleotide-directed mutaRenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802。當(dāng)例如在活體內(nèi)將0-RS、Ο-tRNA和編碼所關(guān)注的多肽的核酸組合吋，響應(yīng)終止密碼子而并入所選氨基酸從而得到在特定位置處含有所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。在本發(fā)明的ー個實施例中，用作選擇性密碼子的終止密碼子為琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA。舉例來說，有關(guān)識別琥珀密碼子的Ο-tRNA的實例參看SEQ ID NO. :6，并且有關(guān)識別蛋白石密碼子的Ο-tRNA的實例參看SEQ ID NO. :7。將UAG和UGA用作選擇性密碼子的遺傳密碼可在保留赭石無義密碼子UAA (其為最豐富的終止信號)的同時編碼22個氨基酸。在活體內(nèi)并入所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)可在不顯著干擾宿主細(xì)胞的情況下進(jìn)行。舉例來說，在非真核細(xì)胞(諸如大腸桿菌)中，由于UAG密碼子的抑制效率視0-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與釋放因子I (RFl)(其與UAG密碼子結(jié)合并且起始正在生長的肽從核糖體釋放)之間的競爭而定，故所述抑制效率可(例如)通過增加Ο-tRNA (例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平或使用RFl缺陷型菌株來加以調(diào)節(jié)。在真核細(xì)胞中，由于UAG密碼子的抑制效率視Ο-tRNA (例如，琥珀抑制性tRNA)與真核釋放因子(例如，eRF)(其結(jié)合終止密碼子并且起始正在生長的肽從核糖體釋放)之間的競爭而定，故所述抑制效率可(例如)通過增加Ο-tRNA (例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平來加以調(diào)節(jié)。非天然氨基酸也可用稀有密碼子來編碼。舉例來說，當(dāng)活體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中精氨酸的濃度降低吋，經(jīng)證實，稀有的精氨酸密碼子AGG對于通過經(jīng)丙氨酸?；暮铣蓆RNA插入Ala有效。例如參看Ma等人，Biochemistry, 32:7939(1993)。在這一情況中，合成tRNA與在大腸桿菌中作為少量物質(zhì)存在的天然存在的tRNAArg競爭。ー些有機體不使用所有三聯(lián)體密碼子。已將藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)中的未指定密碼子AGA用于在活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參看Kowal和Oliver, Nucl. Acid.Res. .25:4685(1997)?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的組件以在活體內(nèi)使用這些稀有密碼子。選擇性密碼子也包含擴充的密碼子，例如四個或四個以上堿基的密碼子，諸如四 堿基密碼子、五堿基密碼子、六堿基密碼子或更多個堿基的密碼子。四堿基密碼子的實例包括(但不限于)AGGA, CUAG, UAGA, CCCU等。五堿基密碼子的實例包括(但不限于)AGGAC,CCCCU、CCCUC、CUAGA, CUACU、UAGGC等。特征可包括基于移碼抑制使用擴充的密碼子。四個或四個以上堿基的密碼子可將(例如)一個或多個所選氨基酸(包括但不限于，非天然氨基酸)插入同一蛋白質(zhì)中。舉例來說，在存在具有反密碼子環(huán)、例如具有CU(X)nXXXAA序列(其中n=l)的突變Ο-tRNA (例如，特定移碼抑制性tRNA)的情況下，將四個或四個以上堿基的密碼子讀作單ー氨基酸。舉例來說，有關(guān)識別四堿基密碼子的Ο-tRNA參看PCT/US04/22061的SEQ ID NO. :6、12。在其它實施例中，反密碼子環(huán)可解碼(例如)至少四堿基密碼子、至少五堿基密碼子或至少六堿基密碼子或更多堿基的密碼子。由于存在256個可能的四堿基密碼子，故可在同一細(xì)胞中使用四個或四個以上堿基的密碼子編碼多個非天然氨基酸。參看 Anderson 等人，(2002) Exploring the Limits of Codon and AnticodonSize, Chemistry and BioIory,9:237-244 MaRliery, (2001) Expanding the GeneticCode:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identiiicationof ^Shifty Four-base Codons with a Library Approach in Eschericma coil，J. Mol.Biol.307:755-769o舉例來說，已使用四堿基密碼子使用活體外生物合成方法將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看 Ma 等人，(1993) Biochemistry, 32:7939 :和 Hohsaka 等人,(1999) .1. Am.Chem. Soc. 121:34。使用CGGG和AGGU利用兩個以化學(xué)方式?；囊拼a抑制性tRNA在活體外將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參看Hohsaka等人，(1999) .1. Am. Chem. Soc, 121:12194。在活體內(nèi)研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)體UAGA可以通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%到26%的效率解碼且在O或-1框內(nèi)極少解碼。參看Moore等人，(2000)1. Mol. Biol, 298:195。在一個實施例中，可將基于稀有密碼子或無義密碼子的擴充的密碼子用于本發(fā)明中，其可減少錯義通讀和其它不合需要的位點處的移碼抑制。對于指定系統(tǒng)來說，選擇性密碼子也可包括ー個天然三堿基密碼子，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用(或極少使用)天然堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。選擇性密碼子視情況包括非天然堿基對。這些非天然堿基對使現(xiàn)有的遺傳代碼進(jìn)ー步擴展。ー種額外的堿基對使三聯(lián)體密碼子的數(shù)量從64増加到125。第三堿基對的特性包括穩(wěn)定且具選擇性的堿基配對、通過聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中和合成新的非天然堿基對之后有效的持續(xù)引物延伸?？捎糜诜椒ê徒M合物的非天然堿基對的描述包括(例如)Hirao %=人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein. Nature Biotechnology, 20:177-182。還參看Wu, Y.等人，(2002)T. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630。其它相關(guān)公開案列于下文中。對于活體內(nèi)使用來說，非天然核苷可滲透膜并且磷酸化形成相應(yīng)的三磷酸鹽。此外，増加的遺傳信息穩(wěn)定并且不被細(xì)胞酶所破壞。Benner和其它人先前的工作利用不同于規(guī)范Watson-Crick配對的氫鍵模式，最值得關(guān)注的實例為iso_C: iso_G配對。例如參看 Switzer 等人，(1989) T. Am. Chem. Soc, 111:8322 ；和 Piccirilli 等人，(1990)Nature, 343:33 Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. , 4:602。一般說來，這些喊基以某種程度與天然堿基錯配并且無法酶促復(fù)制。Kool和同事證實，堿基之間的疏水堆積相互作用可替代氫鍵以驅(qū)動堿基對的形成。參看Kool, (2000)Curr. Opin. Chem. Biol. 4:602 :和Guckian 和 Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 36, 2825。在研發(fā)滿足所有上述需求的 非天然堿基對的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成一系列非天然疏水堿基并且對其進(jìn)行研究。已發(fā)現(xiàn)，PICS:PICS自身配對比天然堿基對穩(wěn)定，并且能夠通過大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如參看McMinn等人，(1999)T. Am. Chem. Soc. 121:11585—6 ;和Ogawa等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:3274。3MN:3MN 自身配對可通過KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成。例如參看Ogawa等人，(2000)J. Am. Chem. Soc, 122:8803。然而,兩種堿基都充當(dāng)用于進(jìn)ー步復(fù)制的鏈終止子。近來已開發(fā)出可用于復(fù)制PICS自身配對的突變體DNA聚合酶。此外，可復(fù)制7AI自身配對。例如參看Tae等人，(2001) .1. Am. Chem. Soc, 123:7439。也已開發(fā)出新穎的金屬堿基對Dipic: Py,其在結(jié)合 Cu(II)后形成穩(wěn)定的配對。參看 Meggers 等人，(2000) .1. Am. Chem. Soc, 122:10714。由于擴充的密碼子和非天然密碼子內(nèi)在地與天然密碼子正交，故本發(fā)明的方法可利用這ー特性產(chǎn)生正交tRNA供其使用。也可使用翻譯旁路系統(tǒng)將所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)并入所需多肽中。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將較大序列插入基因中但并不被翻譯成蛋白質(zhì)。所述序列含有充當(dāng)誘導(dǎo)核糖體越過所述序列并且在插入下游重新開始翻譯的線索的結(jié)構(gòu)。經(jīng)選擇目.非天然的氨基酸如本文所使用，所選氨基酸是指任何所需的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。天然存在的氨基酸包括二十種遺傳編碼的α-氨基酸中的任ー種丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在一個實施例中，將所選氨基酸以高保真度(例如)以對指定的選擇性密碼子大于約70%的效率、對指定的選擇性密碼子大于75%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約80%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約85%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約90%的效率、對指定的選擇性密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ǖ倪x擇性密碼子大于約99%或更高的效率并入正在生長的多肽鏈中。如本文所使用，非天然氨基酸是指任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸或除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下二十種遺傳編碼的α-氨基酸外的氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。α -氨基酸的通用結(jié)構(gòu)如式I中所示
權(quán)利要求
1.一種組合物，其具有tRNA，前述tRNA或其部分是由SEQ ID NO: 1、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述tRNA經(jīng)氨酰基化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述tRNA經(jīng)非天然編碼的氨基酸氨酰基化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述非天然編碼的氨基酸為對乙酰基苯丙氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以化學(xué)方式經(jīng)氨?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述tRNA以酶方式經(jīng)氨?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述tRNA經(jīng)tRNA合成酶(RS)或經(jīng)核糖體以酶方式氨?；?。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物,其另外包含tRNA合成酶(RS)，其中所述tRNA經(jīng)氨基酸氨?；?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述氨基酸為非天然編碼的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述非天然編碼的氨基酸為對乙?；奖彼?。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述tRNA自古細(xì)菌tRNA得到。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物,其中所述tRNA自詹氏甲燒球菌(M.janneschii)得到。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其另外包含翻譯系統(tǒng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)為無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)為細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)為重建的系統(tǒng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)為細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。
18.一種細(xì)胞，其包含翻譯系統(tǒng)，其中所述翻譯系統(tǒng)包含權(quán)利要求I的tRNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非真核細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞，其中所述非真核細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其另外包含編碼所關(guān)注的多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含由所述tRNA識別的選擇性密碼子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述所關(guān)注的多肽為人生長激素。
25.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求I的tRNA :其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。
26.—種載體，其具有tRNA，所述tRNA或其部分是由SEQ ID NO: 1、3中所述的聚核苷酸序列或其互補聚核苷酸序列編碼。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體，其中所述載體包含質(zhì)?；虿《尽?br> 28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的載體，其中所述載體包含柯斯質(zhì)粒(cosmid)或噬菌體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體，其中所述載體為表達(dá)載體。
30.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求26的載體。
31.一種在細(xì)胞中制造在特定位置處具有所選氨基酸的多肽的方法，所述方法包含 使所述細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長，其中所述細(xì)胞包含核酸，所述核酸包含至少一個選擇性密碼子并且編碼多肽；和提供所述所選氨基酸； 其中所述細(xì)胞另外具有 正交tRNA (O-tRNA)，其在所述細(xì)胞中起作用并且識別具有選自由SEQ ID NO:l、3、其互補聚核苷酸序列編碼的序列組成的群組的核酸序列的選擇性密碼子；和 正交氨酰基tRNA合成酶(0-RS)，其中所述O-RS利用所述所選氨基酸使所述0-tRNA氨?；?。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述所選氨基酸為對乙酰基苯丙氨酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多肽為人生長激素。
全文摘要
本發(fā)明提供制造蛋白質(zhì)生物合成機器的組件的組合物和方法，所述組合物和方法包括正交tRNA、正交氨?；鵷RNA合成酶和正交tRNA/合成酶對。本發(fā)明還提供鑒別這些正交對的方法以及使用這些正交對制造蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12N15/63GK102703446SQ201210175059
公開日2012年10月3日 申請日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月18日
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