專(zhuān)利名稱(chēng)：殼寡糖在制備預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥/菌血癥藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體地說(shuō)是殼寡糖在預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥/菌血癥中的 應(yīng)用；進(jìn)一步說(shuō)是殼寡糖在制備內(nèi)毒素血癥和菌血癥的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
全身性感染是指微生物入侵機(jī)體感染后所致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重感 染、感染性休克及多器官功能障礙綜合征是全身性感染的后續(xù)癥。目前，內(nèi)毒素血癥患者 仍有30% 45%因不能及時(shí)控制病情而死亡，并且內(nèi)毒素血癥的發(fā)病率每年有繼續(xù)增長(zhǎng) 的趨勢(shì)。據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心報(bào)告，嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥發(fā)病數(shù)在最近10年中增加了 139%;美國(guó)每年至少有75萬(wàn)例新發(fā)病例；內(nèi)毒素血癥在疾病死亡原因中占第11位，有人甚 至認(rèn)為僅次于心血管疾病。毋庸置疑的是，感染或內(nèi)毒素血癥一直是戰(zhàn)傷和平時(shí)影響人類(lèi) 存活的主要疾病。雖然，國(guó)內(nèi)外對(duì)全身性感染的基礎(chǔ)研究和臨床研究十分重視，但迄今其發(fā) 病率和死亡率仍居高不下。究其原因，革蘭氏陰性細(xì)菌感染、內(nèi)毒素血癥是病人感染死亡的 主要原因，細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖是該類(lèi)疾病的主要致病原。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，細(xì)菌死亡胞壁裂解后釋 放。LPS分子的基本結(jié)構(gòu)由三部分共價(jià)連接而成，即特異性抗原多糖、核心多糖及脂質(zhì)A。 脂質(zhì)A是LPS的毒力中心，對(duì)機(jī)體具有廣泛的生物學(xué)作用，被公認(rèn)是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合 征(SIRS)、膿毒癥、嚴(yán)重休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)、多臟器功能衰竭(MOF)的主 要致病因子。人體腸道內(nèi)含有大量細(xì)菌，正常情況下，這些細(xì)菌及其毒素對(duì)機(jī)體無(wú)害，而且對(duì)維 持腸道微生態(tài)平衡，腸道屏障免疫功能，促進(jìn)腸道消化、吸收功能具有重要的生理意義。有 報(bào)道稱(chēng)正常腸黏膜可允許少量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入門(mén)脈，但很快被肝內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和肝 細(xì)胞清除，不會(huì)進(jìn)入體循環(huán)，并且對(duì)促進(jìn)肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)處于激活狀態(tài)有一定意義，但在 一些病理情況下，如創(chuàng)傷、燒傷、放射損傷、失血性休克、化療、心血管大手術(shù)等，腸道屏障功 能或肝正常清除機(jī)制受到破壞，腸道革蘭氏陰性細(xì)菌和LPS進(jìn)入體循環(huán)，引起內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜。從目前的基礎(chǔ)研究可知，內(nèi)毒素血癥發(fā)病絕不僅 僅是病原微生物侵入人體引起的炎癥防御性反應(yīng)，還涉及到一系列全身整體反應(yīng)。開(kāi)始時(shí) 人們把希望寄托于各種各樣的抗生素，非但沒(méi)有抗內(nèi)毒素作用，反而會(huì)殺滅大量革蘭氏陰 性菌引起菌體崩解，釋放更多內(nèi)毒素，引發(fā)更嚴(yán)重的臨床癥狀。應(yīng)用內(nèi)毒素抗體治療初顯成 效，但由于抗體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，藥源少、成本高，價(jià)格昂貴，要大面積推廣，尚不現(xiàn)實(shí)。目前 采用的其他藥物還有乳果糖、多粘菌素B、巴龍霉素、膽鹽等。對(duì)乳果糖和膽鹽的抗內(nèi)毒素作 用還有爭(zhēng)議。多粘菌素B雖然能通過(guò)化學(xué)作用結(jié)合內(nèi)毒素的類(lèi)脂A部分而中和或滅活其毒 性，但其毒副作用大，尤其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟有損害，使臨床應(yīng)用受到限制。因此，尋找新型 安全的治療內(nèi)毒素血癥的藥物將會(huì)挽救更多患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供殼寡糖在預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥/菌血癥藥物中的應(yīng)用。 殼寡糖能夠抑制內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的分泌，通過(guò)作 用于巨噬細(xì)胞，抑制LPS引發(fā)的炎性細(xì)胞因子IL-Ιβ的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以顯 著提高內(nèi)毒素血癥小鼠的存活率；抑制小鼠炎癥因子TNF-α的分泌。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為所述殼寡糖能夠通過(guò)抑制LPS介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的分泌，降低內(nèi)毒素血癥小鼠 的死亡率；即殼寡糖可進(jìn)一步用于制備治療和預(yù)防內(nèi)毒素血癥/菌血癥的藥物中。所述殼寡糖為脫乙酰度彡95%，分子量< IOOODa的殼寡糖；所述殼寡糖于患處體 液中的有效作用濃度為100-400 μ g/mL。所述殼寡糖與藥物學(xué)上可接受的藥物輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑，粉劑， 針劑、水劑或注射劑；所述藥物輔料為聚乙烯吡咯烷酮、微硅膠粉等。在使用時(shí)可以采取皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以任意選用生理 鹽水、葡萄糖、穩(wěn)定劑、防腐劑、懸浮劑或乳化劑等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為1.根據(jù)實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)證明殼寡糖能夠明顯降低LPS腹腔注射所誘導(dǎo)的小鼠死亡 率，在殼寡糖處理組濃度為100mg/kg體重時(shí)小鼠死亡率僅為48%，而LPS腹腔注射組死亡 率為86 %。因此，殼寡糖具有預(yù)防與治療內(nèi)毒素血癥作用，有望開(kāi)發(fā)成抗炎及治療內(nèi)毒素血 癥的藥物及與抗炎有關(guān)的保健食品及食品添加劑等。2.根據(jù)實(shí)施例2 實(shí)驗(yàn)證明殼寡糖能夠明顯抑制LPS腹腔注射所誘導(dǎo)的血清腫瘤 壞死因子TNF- α的分泌，抑制率在殼寡糖濃度100mg/kg體重時(shí)達(dá)到52. 45%。根據(jù)本發(fā)明 實(shí)驗(yàn)結(jié)論，可進(jìn)一步探討殼寡糖抑制炎癥因子分泌的確切成分。從而研制開(kāi)發(fā)更高效的抗 炎及預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥的藥物。3.根據(jù)實(shí)施例3 實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞水平上，殼寡糖抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子 IL-I β的分泌。在殼寡糖作用濃度為400 μ g/ml時(shí)抑制率達(dá)58.3%。根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié) 論，可對(duì)殼寡糖抑制LPS引發(fā)炎癥反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的研究，確定其作用機(jī)理，可開(kāi)發(fā) 成治療與炎癥及內(nèi)毒素血癥相關(guān)疾病的藥物等。


圖1內(nèi)毒素腹腔注射組與殼寡糖預(yù)處理組小鼠生存曲線。圖2內(nèi)毒素腹腔注射組與殼寡糖預(yù)處理組血清中TNF-α的分泌。圖3不同濃度殼寡糖抑制LPS介導(dǎo)炎癥因子IL-I β的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用殼寡糖為脫乙酰度> 95%，通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn) 殼寡糖能夠明顯降低LPS腹腔注射所誘導(dǎo)的小鼠死亡率。因此，殼寡糖具有預(yù)防與治療內(nèi) 毒素血癥作用。參照文獻(xiàn)(Yoon，H.J.，Moon, Μ. Ε.，Park, H. S.，Im, S. Y.，& Kim，Y. H. (2007). Chitosan oligosaccharide(COS)inhibits LPS-induced inflammatoryeffects in RAW
4264. 7 macrophage cells. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,358, 954-959.)，小鼠巨噬細(xì)胞株7的培養(yǎng)條件為在完全培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)液中添 加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素；37°C，通入CO2體積含量為5%的空氣培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)(Dou,J.，Xu, Q.，Tan, C.，Wang, W.，Du, Y.，Bai, X.，& Ma, X. (2009).
Effects of chitosan oligosaccharides on neutrophils fromglycogen-induced peritonitis mice model. Carbohydrate Polymers, 75 (1), 119-124): ]
18 ；相對(duì)濕度40 70%，SPF飼養(yǎng)籠。實(shí)施例1^MjcM (Aoshiba, K. ，Onizawa, S. ，Tsuji, T. ，& Nagai，Α· (2009). Therapeutic effects of erythropoietin in murine models of endotoxin shock. CRITICAL CARE MEDICINE, 37 (3)，889-898)，將24只小鼠(8周，18 22g，雌雄各半)為一組，共3組，藥 物均為腹腔注射。分單純殼寡糖組(脫乙酰度>95%，分子量< lOOODa) (C0S)，內(nèi)毒素組 (LPS)，殼寡糖(脫乙酰度彡95%，分子量< IOOODa)治療組，100mg/kg體重(LPS+C0S)。連 續(xù)觀察7天，前3天每6小時(shí)觀測(cè)一次，后4天每12小時(shí)觀測(cè)一次。圖1中，實(shí)心圓點(diǎn)表示內(nèi)毒素LPS組，空心圓點(diǎn)表示殼寡糖治療組LPS+C0S，倒三角 表示單純殼寡糖組。從圖中可以看出，殼寡糖100mg/kg體重可以顯著降低腹腔注射LPS所 誘導(dǎo)的小鼠死亡率。而單純殼寡糖處理組未見(jiàn)小鼠死亡及不良反應(yīng)，表明此劑量范圍沒(méi)有 任何毒性。實(shí)施例2將> 12只小鼠為一組，共3組，藥物均為腹腔注射。單純殼寡糖(脫乙酰度 ^ 95%，分子量< IOOODa)組，LPS組(LPQ，殼寡糖(脫乙酰度> 95%，分子量< IOOODa) 治療組(100mg/kg體重)，分別在LPS注射后1.5小時(shí)，3小時(shí)，6小鼠取血。分離小鼠血清， 做TNF- α ELISA分析。簡(jiǎn)單來(lái)講，100 μ 1稀釋后的血清樣品加入ELISA板孔的底部，37°C 孵育2小時(shí)，350 μ 1洗滌液手工洗板5次，加入酶標(biāo)抗體100 μ 1，37°C孵育2小時(shí)，350 μ 1 洗滌液手工洗板5次，加入100 μ 1底物工作液37°C孵育30分鐘，再加入100 μ 1終止液，酶 標(biāo)儀450nm處讀板。圖2中，實(shí)心圓點(diǎn)表示內(nèi)毒素LPS組，空心圓點(diǎn)表示殼寡糖治療組LPS+C0S，倒三角 表示單純殼寡糖組。從圖中可以看出，殼寡糖治療組均能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞 因子TNF-α的分泌。實(shí)施例3將小鼠腹腔細(xì)胞株RAW264. 7按0. I-IOXlO6個(gè)/mL(本例采用1-2X IO6個(gè)/mL) 的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-24h (本例采用1 1)，然后將殼寡糖(脫乙酰度>95%，分 子量< IOOODa)加入到培養(yǎng)液中，終濃度分別為100μ g/mL，200y g/mL，400y g/mL，同時(shí)加 入LPS (100ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)6h，棄去培液，PBS (pH7. 4)洗3次，加入ELISA標(biāo)本稀釋液，液 氮反復(fù)凍融將細(xì)胞裂解，取裂解液做ELISA檢測(cè)胞內(nèi)pro-IL-Ιβ的表達(dá)，步驟同上。圖3從左到右分別表示，空白組，LPS組，LPS+C0S且COS濃度逐漸增加。從圖中可 以看出，400μ g/mL的殼寡糖能明顯抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞分泌炎癥因子IL-I β。綜上所述，本發(fā)明在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑制內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)引發(fā)的炎性細(xì)胞因子的分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以顯著提高內(nèi)毒素血癥小鼠 的存活率；抑制小鼠分泌炎癥因子TNF- α ；抑制小鼠巨噬細(xì)胞株7分泌炎癥因子 IL-I β。
權(quán)利要求
1.殼寡糖在制備預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥/菌血癥藥物中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖能夠通過(guò)抑制機(jī)體炎癥反應(yīng) 來(lái)提高內(nèi)毒素血癥/菌血癥患者的生存率，即殼寡糖可進(jìn)一步用于制備治療內(nèi)毒素血癥/ 菌血癥的藥物中。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療內(nèi)毒素血癥和菌血癥的藥 物為治療由內(nèi)毒素引發(fā)的感染性休克和腸源性細(xì)菌引發(fā)的菌血癥的藥物。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖為脫乙酰度>95 %，分子 量< IOOODa的殼寡糖。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖于患處體液中的有效作 用濃度為 100-400 μ g/mL。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖與藥物學(xué)上可接受的藥 物輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑，粉劑，針劑、水劑或注射劑。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物輔料為聚乙烯吡咯烷酮或微硅 膠粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體地說(shuō)是殼寡糖在制備預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥/菌血癥藥物中的應(yīng)用；所述殼寡糖可抑制炎癥因子的分泌來(lái)預(yù)防和治療內(nèi)毒素休克，即殼寡糖可進(jìn)一步用于預(yù)防和治療內(nèi)毒素血癥的藥物中。本發(fā)明在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑制內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)引發(fā)的炎性細(xì)胞因子的分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以顯著提高內(nèi)毒素血癥小鼠的存活率；抑制小鼠分泌炎癥因子TNF-α；抑制小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7分泌炎癥因子IL-1β。
文檔編號(hào)A61P39/02GK102085212SQ20091022045
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者喬瑩, 杜昱光, 熊川男, 白雪芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所