專利名稱:治療內(nèi)毒素血癥的方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求1998年4月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/083,210號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
有關(guān)政府資助在此描述的本發(fā)明由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生局(NIH)編號(hào)為1RO1AI39159-01A1和1RO1CA70854-01的撥款提供部分資助。聯(lián)邦政府對(duì)此發(fā)明擁有特定的權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及Lpsd基因在治療和預(yù)防內(nèi)毒素血癥中的應(yīng)用。
發(fā)明背景A)LPSLPS是一個(gè)復(fù)雜的大分子，來(lái)自某些細(xì)菌的細(xì)胞壁，其中部分細(xì)菌能引起腸熱癥、痢疾、泌尿道感染等疾病，其它細(xì)菌通常為動(dòng)物和人腸道的寄生菌但一般不致病。所有這些細(xì)菌都有相同類型的細(xì)胞壁，并根據(jù)它們的染色特性而歸類于革蘭氏陰性菌。
LPS誘導(dǎo)免疫活性細(xì)胞因子及動(dòng)物炎性應(yīng)答的其它介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。細(xì)胞因子是由各種細(xì)胞產(chǎn)生的具有很高活性的一種物質(zhì)，這些細(xì)胞如單核吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，它們刺激其它細(xì)胞并相互刺激。內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞也是內(nèi)毒素的初級(jí)靶細(xì)胞。現(xiàn)已對(duì)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞中的特定受體分子和信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行了深入的研究，清楚地了解了內(nèi)毒素的作用機(jī)理。
B)LPS應(yīng)答性的遺傳學(xué)通過(guò)對(duì)小鼠的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)對(duì)內(nèi)毒素的細(xì)胞應(yīng)答受遺傳控制。1968年對(duì)C3H/HeJ突變小鼠的發(fā)現(xiàn)首次明確了宿主對(duì)LPS的多重反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)(Sultzer等，自然，219，1253-1254(1968))。該鼠系對(duì)LPS中脂質(zhì)A組分的免疫刺激和病理生理效應(yīng)應(yīng)答性偏低，并因此認(rèn)為，與親緣關(guān)系很近的應(yīng)答性鼠系相比，它對(duì)LPS的反應(yīng)有一種基本的缺陷。
C3H/HeJ缺陷是特異的，且表現(xiàn)為多種方式。例如，C3H/HeJ的B細(xì)胞接觸LPS后，不發(fā)生增殖或分化，它們的胸腺細(xì)胞受伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的增殖不被LPS增強(qiáng)。(Sultzer等，自然新生物學(xué)(Nature New Biology)(倫敦)240，198-200(1972)；Sultzer，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)摘要(Abst.Am.Soc.Microbio1.)85頁(yè)，M69(1973)；Tanabe等，微生物免疫學(xué)(Microbiol.Immuno.)23，1097-1104(1979)；Morrison等，免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.Immunol.)28，294-312(1979)；Sultzer，《內(nèi)毒素的有益影響》11章，Plenum，NY(1983)；Sultzer等，免疫生物學(xué)(Immunobiology)187，257-271(1993)；Glode等，L.M.和D.L.Resenstreich，免疫學(xué)雜志(J.Immunol)117，2061，2068(1976)；Sultzer，B.M.感染與免疫(Infection and Immunity)13，1579-1584(1976)。巨噬細(xì)胞的吞噬作用和細(xì)胞毒作用并非由LPS刺激，而在反應(yīng)細(xì)胞中LPS所刺激的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、白細(xì)胞介素1(IL-1)和前列腺素在C3H/HeJ的巨噬細(xì)胞中并沒(méi)被誘導(dǎo)。(Morrison等，免疫學(xué)進(jìn)展28，294-312(1979))。此外，與正常的內(nèi)毒素應(yīng)答性小鼠相比，C3H/HeJ對(duì)致死性內(nèi)毒素休克有很強(qiáng)的抗性(Sultzer，自然219，1253-1254(1968))。
C3H/HeJ細(xì)胞對(duì)LPS不發(fā)生應(yīng)答并不是因?yàn)槿鄙佥o助細(xì)胞、存在抑制細(xì)胞或LPS與其它免疫活性細(xì)胞的結(jié)合不足(Sultzer，《內(nèi)毒素的有益影響》11章，Plenum，NY(1983))。更確切地，所提供的解釋集中于細(xì)胞與LPS開(kāi)始作用時(shí)，缺少一個(gè)關(guān)鍵受體或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的某處出現(xiàn)了問(wèn)題(Sultzer等，免疫生物學(xué)187，257-271(1993))。
用C3H/HeJ鼠系和各種反應(yīng)鼠系進(jìn)行的經(jīng)典喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)LPS的促有絲分裂的應(yīng)答受單個(gè)位點(diǎn)的幾個(gè)共顯性等位基因控制(Morrison等，免疫學(xué)進(jìn)展，28，294-312(1979)；Sultzer，《內(nèi)毒素的有益影響》11章，Plenum，NY(1983)；Sultzer等，免疫生物學(xué)187，257-271(1993)；Glode等，免疫學(xué)雜志117，2061-2068(1976)；Sultzer，感染與免疫13，1579-1584(1976))。Watson認(rèn)為此基因位點(diǎn)(Lpsn)位于第4號(hào)染色體，與主要泌尿蛋白的基因位點(diǎn)(Mup-1)相連，在Mup-1基因和控制B細(xì)胞活化的Lyb2∶2∶4∶6基因的下游(Watson等，免疫學(xué)雜志120，422-429(1979))。C3H/HeJ小鼠含有突變的Lpsd等位基因。
C)分離和定性Lpsn基因Sultzer等(免疫生物學(xué)187，257-271(1993))描述了用C3H/OuJ小鼠(對(duì)LPS有反應(yīng))的脾細(xì)胞制備的一個(gè)包含六個(gè)子庫(kù)的cDNA文庫(kù)。把包含2×104個(gè)不同克隆的一個(gè)子庫(kù)導(dǎo)入C3H/HeJ小鼠(對(duì)LPS沒(méi)有反應(yīng))的脾細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入LPS后與綿羊紅細(xì)胞反應(yīng)的空斑形成細(xì)胞增加了四倍。
Kang等(感染與免疫64，4612-4617(1996))描述了對(duì)C3H/OuJ cDNA文庫(kù)的進(jìn)一步功能篩選和分級(jí)分離，以及一個(gè)cDNA克隆的分離，該克隆能恢復(fù)C3H/HeJ脾B細(xì)胞由LPS介導(dǎo)的B細(xì)胞應(yīng)答。這段1166個(gè)核甘酸的cDNA序列(SEQ ID NO1)包括一個(gè)648個(gè)核甘酸的開(kāi)放閱讀框，Q編碼一個(gè)216個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。
序列分析表明，這個(gè)LPS應(yīng)答性基因(Lpsn基因)編碼一個(gè)對(duì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)很重要的GTP酶Ran/TC4(Raetz，C.R.H.，內(nèi)毒素化學(xué)，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem.)59，129-170(1990)；Watson等，免疫學(xué)雜志114，1462-1468(1975)；Kabir等，感染與免疫15，156-164(1977))。在氨基酸水平，Lpsn與人和狗中發(fā)現(xiàn)的Ran/TC4 GTP酶相同，與雞的Ju93和和酵母的Spil蛋白分別有98.6％和82.8％的同源性(Drivas等，Mol Cell Biol分子和細(xì)胞生物學(xué)，10，1793-1798(1990)；Dupree等，Gene基因120，325-326(1992)；Trueb等，F(xiàn)EBS 306，181-184(1992)；Matsumoto等，Cell細(xì)胞66，347-360(1991))。這個(gè)結(jié)論組合了上面的Kang、Drivas、Dupree、Trueb、Marsumoto的結(jié)論。在DNA水平，Lpsn基因的同源性在人的TC4/Ran、狗的TC4/Ran、雞的Ju93和酵母的Spil中依次是89.7％、90.7％、85.4％和68.7％。因此，Lpsn分子在進(jìn)化上高度保守，尤其該分子的5個(gè)結(jié)構(gòu)域，G1-G5，已發(fā)現(xiàn)它們與鳥(niǎo)嘌呤核甘酸的結(jié)合和水解有關(guān)。
總之，Lpsn基因編碼一個(gè)功能性基因產(chǎn)物，這種產(chǎn)物出現(xiàn)在LPS應(yīng)答性小鼠(如C3H/HeOuJ小鼠)中產(chǎn)生多克隆性活化抗體的B細(xì)胞中，將LpsncDNA導(dǎo)入C3H/HeJ B細(xì)胞足以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)于LPS刺激的應(yīng)答性，從而使產(chǎn)生抗體的空斑形成細(xì)胞(PFC)的水平提高至反應(yīng)者的水平。據(jù)信該基因不僅存在于B細(xì)胞中，而且也存在于其它對(duì)LPS有應(yīng)答性的細(xì)胞中以及產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他因子(這些因子量大時(shí)會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生毒害作用)的細(xì)胞中。
D)內(nèi)毒素血癥LPS有多種病理生理學(xué)效應(yīng)，其中之一就是由于血液中存在大量?jī)?nèi)毒素而引起內(nèi)毒素血癥或敗血性休克，致死率約40％。大部分?jǐn)⊙Y休克病例是血液中出現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)果。但敗血性休克也可能由其他生物如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌引起。然而，對(duì)敗血性休克病因的廣泛研究證實(shí)，引發(fā)敗血性休克的一個(gè)關(guān)鍵因素是LPS從革蘭氏陰性細(xì)菌釋放，隨后內(nèi)毒素對(duì)體內(nèi)各種細(xì)胞產(chǎn)生影響，使它們變得高度活化。結(jié)果，宿主體內(nèi)有過(guò)多的細(xì)胞物質(zhì)，這導(dǎo)致循環(huán)衰竭、休克、和死亡。
膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房的常見(jiàn)死因，目前仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)，主要的前炎性細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-6均有涉及。用抗TNF抗體或由TNF胞外結(jié)構(gòu)域與IgG的Fc部分組成的融合蛋白抑制TNF的臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想(Dellinger等，胸(Chest)111，744-753(1997)；Grau等，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)3，1193-1195(1997))。
盡管能用強(qiáng)效抗生素和藥物治療心肺衰竭，但仍極需改良的藥物和/或預(yù)防性治療方案對(duì)內(nèi)毒素血癥進(jìn)行控制，尤其在膿毒癥早期進(jìn)行控制。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了在有此需要的患者中治療內(nèi)毒素血癥的方法，其包括給予有效量的Lpsd基因。Lpsd基因區(qū)別于Lpsn基因之處在于它含有一個(gè)突變，使含有該突變的細(xì)胞中脂多糖內(nèi)毒素的應(yīng)答能力降低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Lpsd基因與同種的相應(yīng)Lpsn基因的區(qū)別在于，在LpsncDNA的3’非翻譯區(qū)有一個(gè)突變。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，此突變?cè)谒鯨ps DNA的870位有一個(gè)核苷酸置換，其中所述位置編號(hào)始于該DNA的翻譯起始密碼子。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，Lpsd基因是人的基因。在另一實(shí)施方案中，Lpsd基因是鼠基因。由于人和鼠的Lps基因編碼相同的蛋白，故鼠基因可能也能用于治療。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，Lpsd基因以病毒載體中的形式給藥。在一最優(yōu)選實(shí)施方案中，該病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該病毒載體為腺病毒載體。
本發(fā)明還提供了在有此需要的患者中預(yù)防內(nèi)毒素血癥的方法，其包括給予有效量的Lpsd基因。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該Lpsd基因以病毒載體中的形式給藥。在一最優(yōu)選實(shí)施方案中，該病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在另一最優(yōu)選實(shí)施方案中該病毒載體為腺病毒載體。
本發(fā)明還包括Lpsd基因在制備用于治療或預(yù)防患者體內(nèi)內(nèi)毒素血癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)均以圖或?qū)ζ鋬?yōu)選實(shí)施方案的以下詳述進(jìn)行說(shuō)明。
附圖簡(jiǎn)述
圖1A-1D顯示一個(gè)LpsdcDNA的不同克隆的DNA序列。頂部一行是LpsncDNA的序列，分離自野生型LPS應(yīng)答性C3H/HeOuJ小鼠。Lpsd-4，-10，-15和-17是4個(gè)分別選自含C3H/HeJ cDNA的質(zhì)粒DNA序列。編號(hào)始于翻譯起始位點(diǎn)ATG的A(第1位)，其用粗體和下劃線表示。所有4個(gè)克隆的DNA在870位均含有相同的突變，即T殘基被C殘基置換。
圖2顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)入C3H/HeJ小鼠的初級(jí)脾B細(xì)胞的流程圖。
圖3A示N2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。圖3B示N2-Lpsn逆轉(zhuǎn)錄載體。圖3C示N2-Lpsd逆轉(zhuǎn)錄載體。
圖4A-4D顯示啟動(dòng)LPS的刺激和逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染后的MTT增殖試驗(yàn)。
圖5顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的脾B細(xì)胞的RT-PCR試驗(yàn)。MM為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在3次或更多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果。
圖6顯示在衍生自正常近交系小鼠(Ana I)、LPS低應(yīng)答性C3H/HeJ小鼠(GG2EE)的巨噬細(xì)胞系中，和在感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒N2-Lps(d)(#1，#7，#9和P30)的Ana I細(xì)胞中，LPS對(duì)TNF-α表達(dá)的刺激作用。
圖7A和7B分別顯示了Lpsn和LpsdmRNA中3’-非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。870位是單堿基置換位點(diǎn)，由T(Lpsn)置換為C(Lpsd)。
圖8圖示了Ad5-Lps腺病毒載體的構(gòu)建。黑框是病毒DNA復(fù)制所必需的病毒ITR(反向末端重復(fù)序列)?！唉贰敝赴b序列，CMV為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。在構(gòu)建體中，Ad5的E1區(qū)被LpsncDNA(1.1kb)，LpsdcDNA(1.1kb)或綠熒光蛋白(GFP)基因(0.8kb)置換。
圖9是Lpsd，Lpsn或綠熒光蛋白(GFP)cDNA通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)移至LPS敏感小鼠后的內(nèi)毒素抗性圖。每只小鼠接受1mg LD100的內(nèi)毒素，1小時(shí)后，靜脈注射各種腺病毒的含1010個(gè)感染性病毒顆粒的培養(yǎng)上清。然后隨著時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察。死的(閉環(huán))和活的(開(kāi)環(huán))動(dòng)物如所示記錄。
圖10顯示在不同時(shí)間點(diǎn)，感染了Ad5-Lpsd或Ad5-Lpsn的小鼠的外周血單核細(xì)胞中腺病毒基因的表達(dá)。用實(shí)施例6所述特異性引物對(duì)外周血單核細(xì)胞的總RNA提取物進(jìn)行嵌套式RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小為793bp。
發(fā)明詳述A)定義和總方法學(xué)以下定義意在幫助理解本發(fā)明的范圍和實(shí)踐。
“LPS”指脂多糖內(nèi)毒素。
“Lpsn”和“Lpsd”被用來(lái)描述正常(指LPS的應(yīng)答性)和低應(yīng)答性脂多糖內(nèi)毒素應(yīng)答基因的各自等位形式(不管來(lái)源的物種)。Lpsd包括編碼LPS蛋白，但其基因包含一個(gè)突變，使含有這類突變的細(xì)胞對(duì)LPS反應(yīng)過(guò)低的任何基因。Lpsn基因也稱Ran/TC4或TC4/Ran。術(shù)語(yǔ)“Lps基因”包括Lpsn和Lpsd，以及其它形式的天然的和實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的LPS內(nèi)毒素應(yīng)答基因。
“Lpsn蛋白”和“Lpsd蛋白”分別被用來(lái)描述Lpsn和Lpsd基因編碼的多肽。術(shù)語(yǔ)“Lps蛋白”包括Lpsn蛋白和Lpsd蛋白，以及其它形式的天然的和實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的LPS內(nèi)毒素應(yīng)答基因產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，Lpsd基因區(qū)別于相同生物的相應(yīng)Lpsn基因之處在于，其mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)有一個(gè)突變。該突變使突變區(qū)中mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該突變?yōu)閱蝹€(gè)點(diǎn)突變，如C3H/HeJ小鼠Lps cDNA的870位(位點(diǎn)編號(hào)始于翻譯起始密碼子ATG)上的T-C突變。
總之，后文中關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和雜交的命名和實(shí)驗(yàn)室方法均為領(lǐng)域內(nèi)已知并常用。本發(fā)明使用了重組核酸、多核苷酸合成、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因插入的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶反應(yīng)、寡核苷酸合成和純化步驟大都按廠家說(shuō)明進(jìn)行。所用技術(shù)和方法大都根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法以及技術(shù)人員熟知的各種通用文獻(xiàn)進(jìn)行，這些文獻(xiàn)包括Maniatis(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1982)和Ausubel(分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols inMolecular Biology)，Wiley and sons，1987)，它們均引入本文作為參考。
B)載體以及基因運(yùn)送方法人和鼠的Lpsn蛋白具有相同的氨基酸序列，在DNA水平上人和鼠的Lpsn(TC4/Ran)基因顯示89.7％的同源性?？梢虼擞枚c(diǎn)誘變技術(shù)，或?qū)⑷薒psn基因與含有小鼠Lpsd突變的限制性片段組合而產(chǎn)生突變的人Lpsd基因(cDNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此突變是C3H/HeJ小鼠特征性的Lpsn基因cDNA中870位的T→C突變。人的Lpsd基因可作為基因治療劑下調(diào)對(duì)LPS的應(yīng)答，并因此用于治療或預(yù)防患者體內(nèi)內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。或者，由于人和鼠的Lps蛋白相同，鼠Lpsd基因可作為人類基因治療的有效序列。
Lpsn基因中造成LPS應(yīng)答性降低的突變可如下誘導(dǎo)用已知誘變技術(shù)，輔以對(duì)產(chǎn)生的有所需LPS應(yīng)答性的突變體進(jìn)行篩選。使LpsncDNA突變，克隆至相應(yīng)載體如N2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wong等，分子細(xì)胞生物學(xué)9，798-808(1989)；Wong等，Genes Dev.1，358-365(1987))，此載體含有5’和3’MMLV LTR、剪接供體和剪接受體位點(diǎn)、以及一個(gè)新霉素抗性標(biāo)記基因。用所得pN2-Lpsx質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染包裝了病毒的細(xì)胞，從這類細(xì)胞獲得病毒上清。用已知技術(shù)沉淀病毒顆粒。用N2-Lpsx載體感染巨噬細(xì)胞，如衍生自正常近交系小鼠的Ana I巨噬細(xì)胞系。分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后TNFα的產(chǎn)生。
轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LPS介導(dǎo)的信號(hào)傳遞的下調(diào)通過(guò)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的最大值相位對(duì)照細(xì)胞中TNFα產(chǎn)生的減少而測(cè)定。選擇通過(guò)導(dǎo)入巨噬細(xì)胞而誘導(dǎo)LPS應(yīng)答性下調(diào)的突變cDNA。將Lpsx基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒運(yùn)送至靶效應(yīng)細(xì)胞的代表性技術(shù)述于以下實(shí)施例中。
優(yōu)選地，能引起LPS應(yīng)答性降低的Lpsn基因的突變可顯著降低，但不會(huì)徹底消除宿主細(xì)胞的LPS應(yīng)答性。
Lpsd基因優(yōu)選以病毒載體的形式導(dǎo)入患者體內(nèi)?？捎糜诒景l(fā)明的病毒載體包括腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
腺病毒是真核細(xì)胞DNA病毒，可經(jīng)修飾而將核酸有效地轉(zhuǎn)入各種類型的細(xì)胞中。腺病毒有各種血清型，包括2型和5型人腺病毒以及動(dòng)物腺病毒。優(yōu)選本發(fā)明的復(fù)制缺陷性腺病毒載體包含ITR、一種殼內(nèi)序列、以及目的核酸。更優(yōu)選，至少腺病毒載體的E1區(qū)無(wú)功能。其它區(qū)可能也已被修飾，包括E3區(qū)(見(jiàn)WO 95/02697)、E2區(qū)(見(jiàn)WO 94/28938)，E4區(qū)(見(jiàn)WO 94/28152，WO 94/12649，和WO 95/02697)，或晚期基因L1-L5中的任一種。
本發(fā)明的復(fù)制缺陷性重組腺病毒載體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備。具體是可用腺病毒與攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒的同源重組而制備。將腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至相應(yīng)細(xì)胞系可進(jìn)行有效同源重組。所用細(xì)胞系應(yīng)能用所述組分轉(zhuǎn)化，并包含能彌補(bǔ)該復(fù)制缺陷性腺病毒的缺陷區(qū)的序列。可用的細(xì)胞系實(shí)例包括人胚細(xì)胞系293(Graham等，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)36，59(1977))，其基因組中整合有Ad5腺病毒基因組的左端序列(占該病毒基因組的12％)，和能夠彌補(bǔ)E1區(qū)和E4的功能的細(xì)胞系，如WO 94/26914和WO 95/02697所述?；厥罩亟M腺病毒，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)技術(shù)純化。
一般優(yōu)選將腺病毒載體用于治療內(nèi)毒素血癥，其中有效治療應(yīng)通常發(fā)生在24小時(shí)內(nèi)。可產(chǎn)生高滴度的腺病毒載體(如1010-1012感染單位/毫升)，并能以非組織特異性方式瞬時(shí)表達(dá)LPS的不應(yīng)答性表型。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是整合病毒，通常感染正在分化的細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括兩個(gè)LTR、一個(gè)殼內(nèi)序列和三個(gè)編碼區(qū)(gag，pol和env)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag，pol和env基因通常都全部或部分缺失，代之以外源的目的核酸序列。這些載體可從不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建，如M-MuLV、MSV(小鼠Moloney肉瘤病毒)、HaSV(Harvey肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(Rous肉瘤病毒)和Friend病毒。
通常，為了構(gòu)建包含本發(fā)明序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，需構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，其包含LTR、殼內(nèi)序列以及編碼序列。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染一個(gè)能反式補(bǔ)充質(zhì)粒中逆轉(zhuǎn)錄病毒的功能缺陷的包裝細(xì)胞系。通常，該包裝細(xì)胞系因此能表達(dá)gag，pol和env基因。這類包裝細(xì)胞系已在現(xiàn)有技術(shù)中描述。具體可提及細(xì)胞系PA317(US 4,861,719)、PsiCRIP細(xì)胞系(WO 90/02806)、和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO 89/07150)。重組逆轉(zhuǎn)錄載體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。
可用衍生自諸如HIV-1、HIV-2和SIV等慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向非分裂細(xì)胞中運(yùn)送物質(zhì)。這些病毒可帶有其它病毒，如M-MuLV或VSV(水泡性口炎病毒)的表面糖蛋白，從而具有假表型。Bartz和Vodicka描述了帶有VSV糖蛋白假表型的高滴度HIV-1的制備(方法(Methods)12(4)；337-42(1997年，8月))，Zufferey等描述了多次減毒的慢病毒載體(自然生物技術(shù)15871-75(1997年，9月))。這類慢病毒載體可感染非分裂細(xì)胞，有較寬宿主范圍，并可通過(guò)超速離心濃縮至高滴度。
嵌合腺病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)也可用于進(jìn)行有效基因傳遞和長(zhǎng)期基因表達(dá)。Feng等人描述了一種嵌合病毒系統(tǒng)，其中用腺病毒載體體內(nèi)生成瞬時(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生者細(xì)胞，以使子代逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染鄰近細(xì)胞(自然生物技術(shù)15866-70(1997年，9月))。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)選用于預(yù)防內(nèi)毒素血癥高危患者體內(nèi)的內(nèi)毒素血癥。如，燒傷患者幾乎100％發(fā)生內(nèi)毒素血癥。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能整合至造血干細(xì)胞，因而它們能生成LPS抗性T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的儲(chǔ)備庫(kù)。
重組病毒載體均以有效量給予患者以治療或預(yù)防內(nèi)毒素血癥。有效量取決于病人的特征、待處理之病況的類型和嚴(yán)重性、預(yù)期療程、給藥方法及其它因素。有效量可由醫(yī)生或其他有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)專家決定。本發(fā)明的重組病毒載體一般以每劑104-1014pfu的形式配制并給藥。
實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)踐經(jīng)以下實(shí)施例舉例說(shuō)明。這些實(shí)施例只為舉例說(shuō)明本發(fā)明的范圍，并非限制。
實(shí)施例1C3H/HeJ小鼠Lpsd基因的分離與鑒定Kang等的研究(感染與免疫，64，4612-4617(1996))顯示Lpsn基因能恢復(fù)C3H/HeJ小鼠脾B細(xì)胞中脂多糖介導(dǎo)的B細(xì)胞應(yīng)答。
為證實(shí)C3H/HeJ小鼠基因組中Lps基因是缺陷的，且這種缺陷導(dǎo)致了對(duì)LPS刺激的低應(yīng)答性，從pCD-HeJ的cDNA文庫(kù)中分離Lps基因。
用C3H/HeJ脾B細(xì)胞的RNA構(gòu)建Okayama-Berg cDNA表達(dá)文庫(kù)(Okayama，H.和Berg，P.等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)，2，161-170(1982))。將pCD-HeJ cDNA文庫(kù)涂布于8個(gè)平板(每150mm平板上5.8×104個(gè)克隆)，用LPS反應(yīng)者小鼠C3H/HeOuJ的LpsncDNA中0.9kb的BamHI-PstI片段探測(cè)該文庫(kù)(感染與免疫，64，4612-4617(1996))。鑒定了25個(gè)陽(yáng)性克隆。
在所分析的25個(gè)獨(dú)立克隆中，8個(gè)為全長(zhǎng)cDNA，如與C3H/HeOuJ(野生型)LpsncDNA的大小比較所確定的。再對(duì)其中4個(gè)獨(dú)立的全長(zhǎng)cDNA克隆(Lpsd-4，-10，-15和-17)進(jìn)行測(cè)序。將這4個(gè)獨(dú)立克隆子的序列與野生型LpsncDNA進(jìn)行比較。
這4個(gè)克隆子均顯示在LpsncDNA的第870位發(fā)生了相同點(diǎn)突變(殘基編號(hào)始于ATG)，即T殘基被C殘基取代，如圖1A-1D所示。有趣的是，這一單點(diǎn)突變發(fā)生在3’非翻譯區(qū)。通過(guò)Northern(RNA)印跡分析，C3H/HeJ和C3H/HeOuJ細(xì)胞在Lps mRNA水平上沒(méi)有顯著差異。
這些數(shù)據(jù)表明，發(fā)生在突變的HeJ Lpsd基因上的點(diǎn)突變是引起C3H/HeJ細(xì)胞對(duì)LPS低應(yīng)答性的原因。
利用GCG序列分析軟件包(Wisconsin)的SQUIGGLES程序比較Lpsn和LpsdmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖7A(Lpsn)和圖7B(Lpsd)顯示在點(diǎn)突變鄰近區(qū)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有重大差異，而在遠(yuǎn)離點(diǎn)突變的區(qū)域則沒(méi)有顯著的結(jié)構(gòu)差異。發(fā)生在LpsdmRNA的3’UTR區(qū)域的單堿基取代提示，存在一個(gè)獨(dú)特的mRNA結(jié)構(gòu)域，其可被調(diào)控蛋白結(jié)合并實(shí)施轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，影響翻譯效率，或影響mRNA的穩(wěn)定性、運(yùn)送或胞內(nèi)定位。為了進(jìn)一步鑒定野生的和突變的Lps基因的產(chǎn)物，及其在LPS應(yīng)答中的作用，構(gòu)建了Lpsn和Lpsd的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
實(shí)施例2Lpsn和Lpsd逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建將實(shí)施例1的Lpsn和LpsdcDNA克隆至N2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的XhoI位點(diǎn)(Wong等，分子細(xì)胞生物學(xué)，9，798-808(1989)；Wong等，Genes Dev.1，358-365(1987))。該N2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括5’和3’MMLV LTR，剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)，及一個(gè)新霉素抗性標(biāo)記基因。
將LpsncNDA從pCD-LPS的XhoI限制性片段分離(感染與免疫，64，4612-4617(1996))并連接至N2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的XhoI限制性片段的位點(diǎn)上，產(chǎn)生pN2-Lpsn。使用同樣的方法產(chǎn)生pN2-Lpsd載體，不同的是所用為突變的LPSdcDNA。
為了產(chǎn)生攜帶Lpsn和Lpsd序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒儲(chǔ)備物，分別用pN2-Lpsn和pN2-Lpsd質(zhì)粒DNA以磷酸鈣DNA共沉淀法轉(zhuǎn)染GP/E病毒包裝細(xì)胞(Markowitz，等，病毒學(xué)雜志，62，1120-1124，(1988))。在含1mg/ml G418的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染子。單個(gè)G418抗性克隆得到分離、增菌和鑒定。
為了產(chǎn)生濃縮的病毒上清，從產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中收集病毒，并用600μ1病毒上清在0.4M NaCl和8.5％的PEG 8000(Sigma)中于4℃連續(xù)攪拌1-1.5小時(shí)以使病毒沉淀。7500rpm離心10分鐘以收集沉淀。沉淀用原體積1％的NTE緩沖液(100mM NaCl，10mM Tris-Cl pH7.4，1mM EDTA，過(guò)濾除菌)溶解。然后將該溶液于4℃上樣于Sepharose CL-4B層析柱。收集并匯總多個(gè)級(jí)分。每個(gè)匯總級(jí)分經(jīng)過(guò)濾除菌并用NIH/3T3細(xì)胞測(cè)定G418抗性以反映病毒效價(jià)(Wong等，分子細(xì)胞生物學(xué)，9，798-808(1989))。
N2親代載體、N2-Lpsn及N2-Lpsd載體的構(gòu)建均分別示于圖3A-3C。
實(shí)施例3Lpsn和Lpsd基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入C3H/HeJ小鼠的脾B細(xì)胞中A)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的轉(zhuǎn)移取自C3H/HeJ小鼠的脾B細(xì)胞，去掉血紅細(xì)胞，在100μg/ml LPS存在下，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，然后在S17間質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(已知能刺激前B細(xì)胞生長(zhǎng))中培養(yǎng)(Collins等，免疫學(xué)雜志，138，1082-1087(1987)；Dorshkind等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meathods)，123，93-101(1989)；Narendran等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，22，1001-1006(1992))。為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率最高，反復(fù)用濃縮的病毒上清新鮮原液更新培養(yǎng)液，如圖2的流程圖所述。N2親代載體、N2-Lpsn或N2-Lpsd載體的濃縮原液的病毒滴度均標(biāo)準(zhǔn)化為2×106G418個(gè)菌落/ml。
B)MTT增殖試驗(yàn)啟動(dòng)LPS的刺激及逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染后，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，進(jìn)行MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]增殖試驗(yàn)(Han等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)92，11014-11018(1995))。
一個(gè)100mm的細(xì)胞培養(yǎng)平板，含10ml S17CM(在含10％胎牛血清和5uM 2-巰基乙醇的RPMI中培養(yǎng)S17細(xì)胞24小時(shí)，在0、12、24、48小時(shí)的alignment)，將107個(gè)已去掉血紅細(xì)胞的C3H/HeJ脾細(xì)胞置于該平板中培養(yǎng)6小時(shí)。然后收集未貼壁的細(xì)胞，并用10ml感染混合物在一個(gè)100mm平板上再感染16小時(shí)。該感染混合物含有3ml濃縮的病毒上清(滴度為2×106個(gè)病毒顆粒/ml)，1ml S17CM，10μg/ml polybrene，10-100μg/ml熱酚提取的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LPS。16小時(shí)后，收集細(xì)胞，再用新鮮的感染混合物感染16小時(shí)。然后，用2ml S17CM中的10μg/ml或100μg/ml LPS刺激收集的細(xì)胞，并在24孔板上培養(yǎng)0，12，24，48小時(shí)。然后，將受到逆轉(zhuǎn)錄病毒感染及LPS刺激的細(xì)胞取100μl置于96孔板上。加入10μl 5mg/ml MTT并與細(xì)胞混合，然后將該平板置于培養(yǎng)箱。培養(yǎng)4小時(shí)后，加入100μl含0.04NHCl的異丙醇，充分混合，在微滴板讀數(shù)儀上讀取570nm處的O.D.。
在32小時(shí)(即圖2所示的培養(yǎng)0小時(shí))，所有培養(yǎng)物之間未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖的顯著差異(圖4A)。在44小時(shí)(即圖2所示的培養(yǎng)12小時(shí))，N2-Lpsn感染細(xì)胞顯示明顯的細(xì)胞增殖，而N2-Lpsd細(xì)胞或N2感染細(xì)胞則沒(méi)有(圖4B)。培養(yǎng)物的感染啟動(dòng)68小時(shí)后(即圖2所示的培養(yǎng)48小時(shí))，N2-Lpsn感染培養(yǎng)物與N2感染培養(yǎng)物或N2-Lpsd感染培養(yǎng)物之間，在LPS應(yīng)答中存在4倍的最大差別。該應(yīng)答自92小時(shí)開(kāi)始降低。
在培養(yǎng)中，N2-Lpsn感染的C3H/HeJ脾B細(xì)胞在44小時(shí)所觀察到的LPS應(yīng)答，與C3H/HeOuJ反應(yīng)者脾B細(xì)胞接受LPS刺激24小時(shí)后的LPS應(yīng)答水平相同(未顯示數(shù)據(jù))。這種延遲可歸因于(1)48小時(shí)后，僅有約50％的細(xì)胞被N2-Lpsn載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，(2)病毒的整合以及轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)需要一個(gè)滯后時(shí)間。N2-Lpsn感染的培養(yǎng)物比N2或N2-Lpsd感染的培養(yǎng)物的細(xì)胞增殖更明顯，因?yàn)榍罢哒谠鲋车男×馨图?xì)胞和母細(xì)胞化的細(xì)胞數(shù)都遠(yuǎn)高于后者(數(shù)據(jù)未列出)。而且，還發(fā)生了多克隆B細(xì)胞的分化，因?yàn)镹2-Lpsn轉(zhuǎn)導(dǎo)的C3H/HeJ脾B細(xì)胞能被LPS刺激而產(chǎn)生裂解綿羊紅細(xì)胞的抗體，這與過(guò)去曾報(bào)道過(guò)的相似(Kang等，感染與免疫，64，4612-4617，(1996))，但N2或N2-Lpsd載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的C3H/HeJ脾B細(xì)胞則不能。
C)RT-PCR分析為了進(jìn)一步說(shuō)明，對(duì)LPS的應(yīng)答或不應(yīng)答是由于相應(yīng)野生型或突變型Ran cDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的成功轉(zhuǎn)移，對(duì)所有培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR分析。其中用到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中出現(xiàn)的SV40啟動(dòng)子的特異性5’寡聚引物，和特異于Lpsn或LpsdcDNA的3’引物。
用4M GTC和酚/氯仿從逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的脾B細(xì)胞中提取總RNA。用AWV-RT產(chǎn)生cDNA。PCR反應(yīng)有兩個(gè)引物5’引物(TCTAAAAGCTGCTGCAGG，SEQ ID NO3)來(lái)自pCD的XhoI片段，3’引物(GTACACGATCTGCTTAGC，SEQ ID NO4)來(lái)自Lps cDNA，用于產(chǎn)生一個(gè)907bp的片段。結(jié)果如圖5所示。
N2-Lpsn和N2-Lpsd所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞均可見(jiàn)預(yù)期的907bp條帶，而N2病毒所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則沒(méi)有，這證明轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因成功表達(dá)。該引物特異于LpsRNA，因?yàn)楫?dāng)用基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，未見(jiàn)圖5所示的907bp條帶。這是因?yàn)?’引物特異于Lps cDNA上游的載體序列。故C3H/HeJ小鼠脾B細(xì)胞中LpsncDNA而非LpsdcDNA的導(dǎo)入和表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)LPS刺激的顯著應(yīng)答能力的恢復(fù)。C3H/HeJ系和其它反應(yīng)者品系小鼠的經(jīng)典繁殖實(shí)驗(yàn)表明，LPS的促有絲分裂應(yīng)答受由共顯性等位基因所組成的單個(gè)位點(diǎn)控制。在此顯示的結(jié)果清楚表明，Ran是Lps應(yīng)答基因，它在對(duì)LPS應(yīng)答降低的C3H/HeJ小鼠中是缺陷的。
實(shí)施例4Lpsd基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移至正常近交系小鼠的巨噬細(xì)胞中Ana I是來(lái)自正常近交系小鼠的巨噬細(xì)胞系，GG2EE是來(lái)自C3H/HeJ低應(yīng)答者小鼠的巨噬細(xì)胞系。用實(shí)施例2的N2-Lps(d)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染Ana I細(xì)胞，并分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞受LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的TNFα的產(chǎn)生。
逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，使1×106個(gè)細(xì)胞的懸浮液與5毫升逆轉(zhuǎn)錄病毒上清在有10μg/ml polybrene存在時(shí)混合。于37℃，5％CO2中振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。然后使細(xì)胞于1500rpm離心10分鐘，用D10G(DMEM加10％熱滅活的FBS，2mM L-谷氨酰胺，10μg/ml慶大霉素和1mg/ml G418)洗并重懸于5ml D10G中。將1.6ml甲基纖維素、0.4ml逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞、1mg/ml G418混合以制備甲基纖維素混合物，將該混合物(每平板約1.1ml)鋪到35mm平板上。挑取菌落，增菌，兩周后收集。
進(jìn)行LPS刺激時(shí)，將細(xì)胞(Ana I，GG2EE，及逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ana I細(xì)胞)接種在24孔的板上(5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，于37℃5％CO2中培養(yǎng)。分別在0，24，48或72小時(shí)時(shí)用100ng/ml的LPS刺激細(xì)胞。收集培養(yǎng)上清，用ELISA法測(cè)定TNFα的量。
做TNFα分析，微滴板上每孔加50μl的TNFα捕獲抗體(2μg/ml)，4℃過(guò)夜。然后平板用PBST洗4遍，每孔加入封閉液(200μl)，室溫30分鐘。平板再用PBST洗4次，每孔加入樣品100μl。4℃過(guò)夜，而后以PBST洗4遍。為了檢測(cè)TNFα，每孔加入生物素化的TNFα抗體(1μg/ml，100μl/孔)，將板室溫放置1小時(shí)，然后以PBST洗。加入鏈抗生物素蛋白-HRP偶聯(lián)酶(1∶1000稀釋，100μl/孔)，將板室溫放置30分鐘，用PBST洗8次。加入ABTS底物(100μl/孔)，于室溫中顯色。通過(guò)讀取OD 405nm值測(cè)定顏色。結(jié)果如圖6所示。
#1，#7，和#9都是獨(dú)立的克隆，而P30是從30個(gè)獨(dú)立克隆的混合物所衍生的細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)表明，Lpsd基因在Ana I反應(yīng)者細(xì)胞中的表達(dá)可下調(diào)這些細(xì)胞中LPS介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。Lpsd基因可因此作DNA藥物來(lái)治療或預(yù)防患者體內(nèi)內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。
實(shí)施例5
腺病毒載體的構(gòu)建及用于腺病毒性Lps體內(nèi)轉(zhuǎn)移的病毒的制備將Lpsd，Lpsn及GFP基因按如下方法克隆到Ad5腺病毒載體上并取代其E1區(qū)。載體的構(gòu)建按圖8所示的流程。
用BamHI從pCD-Lpsn和pCD-Lpsd的3249位和35位切下Lpsn和Lpsd的cDNA(后者在cDNA的870位含有T-C突變，其由StemCell Therapeutics提供)。分別將它們插入到Ad5基因組的E1區(qū)，并受CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。pEGFP質(zhì)粒的GFP(綠色熒光蛋白)基因用BamHI和NotI切出，插入至相同位點(diǎn)，并同樣受CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。重組腺病毒因缺失E1而為復(fù)制缺陷型。但它們可在含有E1基因的293細(xì)胞中復(fù)制。為了制備重組病毒，用重組Ad5DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。10天后，通過(guò)從培養(yǎng)瓶中刮取而收集細(xì)胞。經(jīng)過(guò)三輪的乙醇/干冰浴冷凍及37度快速化凍的過(guò)程，取1ml病毒裂解液感染20個(gè)150mm平板上的293細(xì)胞。三天后，如上述收集病毒，用CsCl將其離心為帶狀以純化并對(duì)PBS透析三次。為測(cè)定病毒滴度，在6孔平板上接種293細(xì)胞。24小時(shí)后，用系列稀釋的病毒原液感染。兩小時(shí)后，去掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞覆蓋在含2％PBS和1％瓊脂糖的培養(yǎng)基上，10天后，計(jì)數(shù)平板上的空斑數(shù)。腺病毒載體滴度為1012pfu/ml。
實(shí)施例6Lps用腺病毒載體進(jìn)行的體內(nèi)轉(zhuǎn)移在本研究中，遠(yuǎn)交系CD1小鼠買自Charles River公司，經(jīng)誘導(dǎo)使其得敗血性休克，然后用帶有Lpsd，Lpsn或GFP cDNA的載體處理。使用遠(yuǎn)交系CD1小鼠是為了觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的異質(zhì)性程度。
A)接種用小鼠測(cè)定內(nèi)毒素的LD50和LD100分別為0.6mg和1mg。然后每只小鼠腹膜內(nèi)接種1mg內(nèi)毒素(相當(dāng)于LD100)。1小時(shí)后，每只小鼠靜脈注射1010pfu/ml的Ad5-Lpsd，Ad5-Lpsn或Ad5-GFP病毒0.5ml。
B)存活每隔6-12小時(shí)觀察小鼠。結(jié)果如圖9所示。所有用1mg LPS處理的小鼠在36小時(shí)內(nèi)死亡，用Ad5-Lpsn或Ad5-GFP處理的小鼠亦如此。用Ad5-Lpsd處理的小鼠有一半在同樣的時(shí)間段內(nèi)死亡，但另一半存活(圖9)?；蜣D(zhuǎn)移治療后存活的異質(zhì)性與遠(yuǎn)交系小鼠的使用相關(guān)。該組內(nèi)的一只存活鼠開(kāi)始時(shí)表現(xiàn)得萎靡不振，但康復(fù)后則變得很健康。只注射Ad5病毒的小鼠都沒(méi)有死亡，說(shuō)明其沒(méi)有毒性。因此，突變的LpsncDNA的轉(zhuǎn)移可挽救對(duì)內(nèi)毒素敏感的小鼠于敗血休克。
C)轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的PCR檢測(cè)為了確定腺病毒基因轉(zhuǎn)移的存在，在不同時(shí)間收集用Ad5-Lpsd或Ad5-Lpsn進(jìn)行了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的小鼠的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，以提取RNA，如下所述。
CD1小鼠尾靜脈接種約1010pfu的感染性重組腺病毒顆粒。在2，4，6，10和24小時(shí)后將全血收集在血細(xì)胞比容管中。離心，收集淡黃色白細(xì)胞層，在GTC緩沖液中裂解(Wong等，病毒學(xué)雜志，68，5523-5531，1994)以提取總RNA。每份RNA樣品的終體積為10μl；這些樣品都用oligo-dT引物如所述(同上)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT反應(yīng)的總體積為20μl。從20μl中取出2μl用于如曾報(bào)道過(guò)的(同上)一樣進(jìn)行嵌套式PCR擴(kuò)增。每一反應(yīng)中，在50μl的反應(yīng)體積中使用1.5個(gè)單位的Taq聚合酶(Sigma)。第一輪PCR擴(kuò)增時(shí)，樣品先經(jīng)95℃5分鐘變性，然后經(jīng)變性(94℃1分鐘)、退火(60℃1分鐘)和引物延伸(72℃1分鐘)共20個(gè)循環(huán)。最后一輪再一次72℃10分鐘的引物延伸。第一輪PCR擴(kuò)增中，5’引物序列(T7正義鏈)為5’-TAA TAC GACTCA CTA TAG GGA GA-3’(SEQ ID NO5)，其特異于T7啟動(dòng)子序列，3’引物序列(D2反義鏈)為5’-GAA ATT CAG AAA GGA AAC AAC TCT GTTCCA-3’(SEQ ID NO6)，其為特異于Lps cDNA(始于810位核苷酸)的反義序列。預(yù)計(jì)所擴(kuò)增的DNA片段為1020bp。第二輪嵌套式PCR擴(kuò)增中，從第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)總體積50μl中取出2μl進(jìn)行第二輪PCR。5’引物為pcDNA3(Invitrogen)正義鏈序列5’ACT ATA GGG AGA CCC AAG CT-3’(SEQ ID NO7)，其特異于pcDNA3，該載體序列在構(gòu)建時(shí)與腺病毒載體中的Lps cDNA連接。3’引物(R1反義鏈)序列為5’-AGC AGT CGT CTGAGC AAC CT-3’(SEQ ID NO8)，其特異于Lps cDNA(始于第606位核苷酸)。預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為790bp。樣品先經(jīng)95℃5分鐘變性，然后進(jìn)行94℃1分鐘，60℃1分鐘及72℃1分鐘的35個(gè)循環(huán)，最后再進(jìn)行一步72℃10分鐘的引物延伸反應(yīng)。
D)PCR結(jié)果體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移后，僅2小時(shí)的細(xì)胞RNA即包含一個(gè)793bp的條帶，說(shuō)明有逆轉(zhuǎn)錄病毒的mRNA存在(圖10)。缺乏逆轉(zhuǎn)錄或cDNA模板時(shí)未見(jiàn)這種條帶(圖10)。這些數(shù)據(jù)表明靜脈接種載體后僅2小時(shí)就能發(fā)生腺病毒基因的表達(dá)。
所有引用的參考文獻(xiàn)，包括公開(kāi)了合成，制備和分析方法的文獻(xiàn)，均在此引入作為參考。
本發(fā)明也可以按其他特殊的方案實(shí)施，只要沒(méi)有其精神或基本特征，因此，在說(shuō)明本發(fā)明的范圍時(shí)，除了參照前面的說(shuō)明書(shū)以外，更應(yīng)參照所附權(quán)利要求
。
序列表<110>Wong，Petex M.C.
<120>治療內(nèi)毒素血癥的方法<130>252PC<140>尚未有申請(qǐng)?zhí)?amp;lt;141>1998-04-26<150>60/083,210<151>1998-04-27<160>8<170>PatentIn Ver，2.0<210>1<211>1166<212>DNA<213>小鼠<400>1cccccctccg cgcgccggcg tccgctgcgt ctccggcatt tgaatcgcgt ccgccatctt 60tccagctcca gtcggacagg cgcgcagact cttctggaag gatccgccgc gacggccgcc 120cagggagagc cgcaggtcca gttcaagctc gtcctggtgg gcgacggcgg caccgggaag 180acaaccttcg tgaagcgcca cttgacgggc gagtttgaga agaagtatgt agccaccccg 240ggcgtggagg tgcacccgct cgtcttccat accaacagag gacccatcaa gttcaacgtg 300tgggacacgg ccggccagga gaagttcggg ggcctgcgcg atggctacta catccaagcc 360cagtgtgcca ttataatgtt tgatgtaacc tcaagagtta cttacaagaa tgtacctaac 420tggcatagag atctggtacg agtgtgtgaa aacatcccca ttgtattgtg tggcaacaaa 480gtggatatta aagacaggaa agtgaaggca aaatctattg tcttccaccg gaagaagaat 540cttcagtact atgacatttc tgccaaaagt aactacaact ttgaaaagcc tttcctctgg 600cttgccagaa agctcattgg agatcctaac ttggagttcg ttgccatgcc tgctcttgcc 660ccacctgagg tggtcatgga cccagctttg gcagcacagt acgagcatga tttagaggtt 720gcccagacga ccgctctccc agatgaggat gatgacctgt gagaaagtga agctggatgc 780cctgcgtcag aagtctagtt ttatacgcaa ctgtcctgtg atgtcaagcg gtgcagcgcg 840tgtgccacct tatttagcta agcagatcgt gtacttcatt gggatgctga aggagatgaa 900tgggcttcga gtgaatgtgg cagttaaaca caccttcatt ttttggactt gcatatttag 960ctgtttggaa cagagttgtt tcttttccga atttcaaaga taagactgct gcagtcccat 1020cgcaatatcc agtggggaaa tcttgtttgt tactgtcatt cccattcttt tcgttagaat 1080cagaataaag ttgtatttca aataatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1166<210>2<211>216<212>PRT
<213>小鼠<400>2Met Ala Ala Gln Gly Glu Pro Gln Val Gln Phe Lys Leu Val Leu Val1 5 10 15Gly Asp Gly Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Val Lys Arg His Leu Thr20 25 30Gly Glu Phe Glu Lys Lys Tyr Val Ala Thr Leu Gly Val Glu Val His35 40 45Pro Leu Val Phe His Thr Asn Arg Gly Pro Ile Lys Phe Asn Val Trp50 55 60Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys Phe Gly Gly Leu Arg Asp Gly Tyr Tyr65 70 75 80Ile Gln Ala Gln Cys Ala Ile Ile Met Phe Asp Val Thr Ser Arg Val85 90 95Thr Tyr Lys Asn Val Pro Asn Trp His Arg Asp Leu Val Arg Val Cys100 105 110Glu Asn Ile Pro Ile Val Leu Cys Gly Asn Lys Val Asp Ile Lys Asp115 120 125Arg Lys Val Lys Ala Lys Ser Ile Val Phe His Arg Lys Lys Asn Leu130 135 140Gln Tyr Tyr Asp Ile Ser Ala Lys Ser Asn Tyr Asn Phe Glu Lys Pro145 150 155 160Phe Leu Trp Leu Ala Arg Lys Leu Ile Gly Asp Pro Asn Leu Glu Phe165 170 175Val Ala Met Pro Ala Leu Ala Pro Pro Glu Val Val Met Asp Pro Ala180 185 190Leu Ala Ala Gln Tyr Glu His Asp Leu Glu Val Ala Gln Thr Thr Ala195 200 205Leu Pro Asp Glu Asp Asp Asp Leu210 215<210>3<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述5′引物<400>3tctaaaagct gctgcagg 18<210>4<211>18<212>DNA<223>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述3′引物<100>4gtacacgatc tgcttagc 18<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述5′引物<400>5taatacgact cactataggg aga 23<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述3′引物<400>6gaaattcaga aaggaaacaa ctctgttcca 30<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述5′引物<400>7actataggga gacccaagct 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述3′引物<400>8agcagtcgtc tgagcaacct 20
權(quán)利要求
1.低應(yīng)答性脂多糖內(nèi)毒素應(yīng)答基因Lpsd在制備治療有需要的患者中內(nèi)毒素血癥的藥物中的用途，其中所述Lpsd基因區(qū)別于同種的相應(yīng)Lpsn基因之處在于該Lps cDNA的第870位核苷酸發(fā)生了突變，其中所述位點(diǎn)編號(hào)始于翻譯起始密碼子。
2.權(quán)利要求
1的用途，其中所述突變?yōu)樗鯨ps cDNA的第870位核苷酸的T-C核苷酸取代。
3.權(quán)利要求
1的用途，其中所述Lpsd基因以病毒載體的形式存在。
4.權(quán)利要求
3的用途，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
5.權(quán)利要求
3的用途，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
6.低應(yīng)答性脂多糖內(nèi)毒素應(yīng)答基因Lpsd在制備預(yù)防有需要的患者中內(nèi)毒素血癥的藥物中的用途，其中所述Lpsd基因區(qū)別于同種的相應(yīng)Lpsn基因之處在于該Lps cDNA的第870位核苷酸發(fā)生了突變，其中所述位點(diǎn)編號(hào)始于翻譯起始密碼子。
7.權(quán)利要求
6的用途，其中所述突變?yōu)樗鯨ps cDNA的第870位核苷酸的T-C核苷酸取代。
8.權(quán)利要求
6的用途，其中所述Lpsd基因以病毒載體的形式存在。
9.權(quán)利要求
8的用途，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
10.權(quán)利要求
8的用途，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
11.權(quán)利要求
6的用途，其中患者為燒傷患者。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種治療劑，其包含能下調(diào)Lps介導(dǎo)的信號(hào)傳遞并因此可以給藥用于治療和預(yù)防內(nèi)毒素血癥的發(fā)生的Lps
文檔編號(hào)A61K38/00GKCN1213768SQ99807949
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期1999年4月26日
發(fā)明者彼得·M·C·王 申請(qǐng)人:聯(lián)邦高等教育系統(tǒng)坦普爾大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan