本發(fā)明涉及用于抗肝癌的藥，其包含氫分子作為活性成分。

背景技術(shù)：

肝細胞癌(簡稱肝癌)是全球發(fā)病率排名第二的癌癥，每年有大約6000,000人死于肝癌，尤其在中國等亞洲國家，肝癌的流行情況更為嚴重。在我國每年死于肝癌的人數(shù)高達11萬之多。肝癌的發(fā)生與多種危險因素有關(guān)，包括HBV，HCV病毒感染，酒精攝入，黃曲霉毒素污染等，具有很高的致死率。作為一種惡性程度極高的腫瘤，肝癌常伴有浸潤和轉(zhuǎn)移。

目前肝癌的治療手段包括外科治療、肝動脈/門靜脈化療栓塞術(shù)和放射治療等。外科治療包括部分肝切除和肝移植，是獲得較長期生存的最重要的治療手段，但是由于肝癌發(fā)生和發(fā)展的復雜性和手術(shù)后肝臟再生滋生的炎癥微環(huán)境，單純的手術(shù)切除復發(fā)率很高。由于肝癌發(fā)病的特點,臨床上發(fā)現(xiàn)的病例大多不能進行肝臟外科治療，肝動脈/門靜脈化療栓塞是應用最多的治療技術(shù)，但是化療藥物敏感性差、毒性大，治療后易導致肝癌耐藥和復發(fā)。系統(tǒng)化療具有有限的抗瘤活性，并缺乏總生存獲益以及化療的毒副反應。此外，肝癌的治療手段還有放療、靶向治療、基因治療、免疫治療和中醫(yī)、中藥治療等。雖然基因治療的前景光明，但由于其靶向性差和安全性問題限制了臨床應用?？傊?，肝癌的臨床治療仍是一個需要研究和探索的難題，目前當務之急是找到療效更佳、特異性更好的藥物。

氫分子是自然界中最小的分子，長期以來，生物學家誤認為它是生理學上的惰性氣體。2007年日本學者Ohsawa等(Ohsawa et al.,2007)在Nature Medicine的報道發(fā)現(xiàn)，呼吸2％的氫氣即可有效治療腦缺血再灌注損傷，并提出了氫可以通過選擇性清除羥自由基和亞硝酸陰離子來發(fā)揮其抗氧化作用。該研究迅速引起廣泛關(guān)注，并掀起了氫分子醫(yī)學研究的熱潮。研究表明，氫不僅具有抗氧化作用，還具有抗炎癥和抗凋亡作用，對于缺血再灌注損傷、電離輻射損傷、炎癥性疾病、代謝性疾病等方面均有很好的防治作用。同時，作為一種新型抗氧化劑，氫還具有無毒、無殘留、制備簡單、 給藥方便等諸多優(yōu)點，具有很好的臨床應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將至少包含氫分子的液體/氣體用在抗肝癌的藥物的制備中，從而提高藥物的抗肝癌效果。其特點在于所制備的抗肝癌的藥中包含氫分子作為活性成分。

本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，將含有氫分子的液態(tài)或氣態(tài)的組合物用在抗肝癌藥的制備中，可以抑制肝癌細胞的生長、浸潤和遷移，并且可以增強其效果。在下文中詳細描述了本發(fā)明。

(1)一種至少包含氫分子的液體在制備抗肝癌的藥物中的應用。

(2)(1)所述的用途，其特征在于，其中至少包含氫分子的液體是水溶液，該水溶液的溶劑是純水、去離子水、蒸餾水、生理鹽水或有機酸的酸性水溶液等。

(3)(1)或(2)所述的用途，其特征在于，至少包含氫分子的液體包含0.1ppm以上即0.05mM以上的氫分子。

(4)(1)-(3)任意一項所述的用途，其特征在于，至少包含氫分子的液體還包含氧分子。

(5)(1)-(4)任意一項所述的用途，其特征在于，可以抗肝癌的藥物為口服藥、注射藥或洗浴用藥。

(6)一種至少包含氫分子的氣體在制備抗肝癌的藥物中的用途。

(7)(6)所述的用途，其特征在于，其至少含有氫分子的氣體是氫氣和氧氣的混合物。

(8)(6)或(7)所述的用途，其特征在于，至少包含氫分子的氣體是氫氣、氧氣和惰性氣體的混合物。

(9)(6)-(8)任意一項所述的用途，其特征在于，至少包含氫分子的氣體是氫氣和空氣的氣體混合物。

(10)(6)-(9)中任何一項所述的用途，其特征在于，其包含體積濃度為25％-35％的氫氣。

附圖說明

圖1顯示給予氫處理對大鼠肝臟腫瘤體積的影響。

圖2顯示氫處理對大鼠肝癌細胞生長速率的影響。

圖3顯示氫處理對大鼠肝癌細胞浸潤能力的影響。

圖4顯示氫處理對大鼠肝癌細胞遷移能力的影響。

具體實施方式

雖然下文將參考以下實施例更詳細地描述本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不僅限于此，可在不脫離本發(fā)明主題和范圍的情況下以同等方式對本發(fā)明進行各種改變和修飾。

氫濃度的測定

用氫電極(Unisense A/S,Aarhus,Denmark)測定溶液中的氫濃度，通過氣體層析測定氫氣濃度(Teramecs Co.,Kyoto)。

富氫生理鹽水(或富氫細胞培養(yǎng)液)的制備

制備飽和氫水時，將鎂棒(24353，株式會社FDR·フレンディア)120℃高壓蒸汽滅菌后，放入100ml培養(yǎng)基中，密閉48小時，獲得濃度為0.8mM的含飽和氫的生理鹽水(或細胞培養(yǎng)液)，溶液中的氫濃度可以用“氫濃度的測定”的方法測定。

將氫氣給予裸鼠

為了讓每只裸鼠都連續(xù)吸入氫氣，通過泵的遞送產(chǎn)生氫氣體積濃度為30％的氫氣和空氣的混合氣體，將所得氣體送入導管連接緊密的塑料盒內(nèi)。將含氫氣的氣體混合體以每分鐘2-5升的速率供應其中。用上文中“氫濃度的測定”方法測定氫氣濃度。將大鼠的籠子置于所述容器內(nèi)，以便將氫氣穩(wěn)定地給予大鼠。為保證適宜的溫度和濕度，塑料盒用毛巾包裹，并與含有干燥劑和CO₂吸附劑的盒子相連。給氫組裸鼠每天三次，每次呼吸半小時。

實施例1：給予氫氣對裸鼠肝癌具有很好的抑制作用

將成瘤后的雌性BALB/c裸鼠(16-18g)分為2組，每組8只大鼠，其中第一組為對 照組，第二組為氫處理組，即通過呼吸的方法給予含氫空氣。

首先，建立裸鼠肝癌模型，方法如下：

人肝癌細胞HuH7-T的準備：新復蘇HuH7-T細胞，接種前再傳代1次，24小時后更換1次培養(yǎng)基，在細胞對數(shù)生長期時，以0.25％胰酶消化，收集消化液離心后去除上清液，Hanks液洗滌2次后制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度為1.5×10⁷/ml，置于37℃水浴中待接種。苔盤藍排斥實驗檢測細胞活力>95％。

HuH7-T皮下接種：每只裸鼠注射0.2ml細胞懸液于右肩胛部皮下，注射后以小鑷夾針孔片刻。裸鼠皮下腫瘤體積大于1mm³視為建模成功，將成功接種的裸鼠隨機分組。

裸鼠接種后的給藥處理：氫處理組將大鼠放入氣密塑料盒內(nèi)，按上述方法呼吸氫氣，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。每周測量兩次體重和腫瘤長、短經(jīng)，計算腫瘤體積(應用公式(a²×b)/2計算，其中a為腫瘤短徑，b為腫瘤長徑)。給藥六周后將裸鼠處死，從皮下將腫瘤小心取出并測量腫瘤體積。

結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，氫處理組的腫瘤體積明顯縮小，說明這種治療方法對肝癌有很好的抑制作用。

實施例2：富氫細胞培養(yǎng)液可以抑制大鼠肝癌細胞HepG2、HuH7-E、HuH7-T的生長、浸潤和遷移

HepG2、HuH7-E、HuH7-T細胞分為兩組，第一組為對照組，即用普通培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)；第二組為氫處理組，即用富氫細胞培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后進行體外實驗檢測細胞功能的改變。

CCK8法檢測細胞生長：將上述三組細胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，以1×10⁴cells/100μl/well的細胞密度接種HepG2、HuH7-E、HuH7-T細胞于96孔板中，每種細胞接種60孔。接種后24h分組換液，以換液后第6、24、48、72小時為4個觀察時間點，共鋪4塊板，于37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)。細胞分組換液后立即取出其中一塊板，每孔加入CCK8 10μl，于37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)1小時。用酶標儀測定波長450nm處各孔的吸光值(OD值)。以后在6h、24h、48h、72h時各取出一塊板按照上述步驟進行。最后以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，氫處理組HuH7-E、HuH7-T、HepG2細胞的生長速率明顯降低。

Transwell法檢測細胞浸潤：將Matrigel溶于無血清細胞培養(yǎng)液中，終濃度為0.5mg/ml，將50μl稀釋后的Matrigel膠加到24孔板的insert中，37℃干燥1-2h后備用。將上述細胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照5×10⁴cells/600μl/well的密度將細胞接種于24孔板的insert中，每組接種3孔，24孔板下層中加入350μl放入細胞培養(yǎng)基。經(jīng)細胞培養(yǎng)48小時，并用結(jié)晶紫染色后計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，氫處理組的穿膜細胞數(shù)明顯減少，說明氫處理對HuH7-E、HuH7-T、HepG2細胞的浸潤能力具有明顯的抑制作用。

劃痕實驗檢測細胞遷移：將HepG2細胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照2×10⁵cells/500μl/well的密度將細胞接種于24孔板中，每組接種3孔。于37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24小時。待細胞融合后，用無菌的10μl槍頭在well底中央劃垂直的“一”字線,寬度約200μm。用細胞培養(yǎng)液沖洗若干次,以洗去劃痕處的細胞，再換上新鮮培養(yǎng)液于37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，分別記錄0、8、24小時的劃痕創(chuàng)面愈合情況。細胞遷移能力以遷移率表示，細胞遷移率(％)＝(原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度×100％。結(jié)果如圖4和表1所示，與對照組相比，氫處理組的細胞遷移率明顯降低，說明氫處理對HepG2細胞的遷移能力具有明顯的抑制作用。

表1氫處理對HepG2細胞遷移能力的影響