一種具有趨化功能的生物活性支架的制備和應(yīng)用
【專利說明】一種具有趨化功能的生物活性支架的制備和應(yīng)用 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明專利涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的支架材料，尤其是能夠吸引內(nèi)源性細(xì)胞 迀移、促進內(nèi)源性細(xì)胞存活和分化的生物活性支架。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，公知的用于修復(fù)脊髓損傷的支架是由支架和外源性細(xì)胞組成的。主要是通 過外源性細(xì)胞移植到受損傷處來達(dá)到替換丟失神經(jīng)元和治療脊髓損傷的效果，而支架僅僅 是作為一種支撐細(xì)胞附著的載體。但是，臨床應(yīng)用過程中，外源性細(xì)胞的移植面臨著來源、 倫理和免疫排斥等重重困難，這使得脊髓損傷的外源性細(xì)胞移植治療受到了極大的限制。 因此，找到一種有效的方式即可規(guī)避細(xì)胞移植的細(xì)胞來源性問題，又能滿足脊髓損傷/移 植區(qū)對內(nèi)源性細(xì)胞迀移、存活、分化和提供營養(yǎng)活性因子的需求是關(guān)鍵。
[0003] 細(xì)胞的靶向迀移及其機制，一直是科學(xué)家們關(guān)注的焦點。目前的研宄主要集中 于外源性細(xì)胞體內(nèi)移植之后的定向迀移。將能夠刺激細(xì)胞迀移的趨化因子注射到病變部 位，能夠?qū)⒁浦驳耐庠葱约?xì)胞特異性吸引迀移過來，并能呈現(xiàn)治療和替換的效果。常用的 趨化因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)和基質(zhì)細(xì)胞源性因子-I(SDF-I)等[Takeuchi H，etal.Intravenouslytransplantedhumanneuralstemcellsmigratetothe injuredspinalcordinadultmiceinanSDF-l-andHGF-dependentmanner.Neurosci Lett，2007,426(2) :69-74]。近年來，利用具有神經(jīng)保護作用的營養(yǎng)因子作為趨化因子， 也展現(xiàn)出很好的趨化效果，同時這些因子還具有營養(yǎng)細(xì)胞和改善脊髓損傷微環(huán)境的作用， 如神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (NT-3)等[ChenYF，etal.Neurotrophin-3stimulatesmigration ofmesenchymalstemcellsoverexpressingTrkC.CurrMedChem，2013,20(24)： 3022-3033]。
[0004] 維甲酸（RA)是維生素A(Vit.A)的一種代謝產(chǎn)物。動物自身不能合成Vit.A，必 須從植物中以胡蘿卜素的形式和在動物中以視黃酸等形式攝取。RA在神經(jīng)發(fā)育中扮演著 主要角色。研宄表明，RA能夠誘導(dǎo)不同種類的特殊細(xì)胞用于移植治療。本課題組前期研 宄發(fā)現(xiàn)，在體外，利用RA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)向神經(jīng)組織細(xì)胞方向分化，提高相 關(guān)受體mRNA表達(dá)水平[ZhangW，etal.Combinationofadenoviralvector-mediated neurotrophin-3genetransferandretinoicacidpromotesadultbonemarrow cellstodifferentiateintoneuronalphenotypes.NeurosciLett，2006,408 (2)： 98]。在體內(nèi)，經(jīng)過RA誘導(dǎo)的MSCs在NT-3和督脈電針的協(xié)同作用下，具有向神經(jīng)元方 向分化的能力[ZhangK，etal.Electro-acupuncturepromotesthesurvivaland differentiationoftransplantedbonemarrowmesenchymalstemcellspre-induced withneurotrophin_3andretinoicacidingelatinspongescaffoldafterrat spinalcordtransection.StemCellRevRep，2014,10 (4) :612]。因此，RA在神經(jīng)組織細(xì) 胞的誘導(dǎo)和分化中有著關(guān)鍵性的作用。
[0005]目前在國內(nèi)、外，一種自身具有生物活性并能夠趨化內(nèi)源性細(xì)胞迀移到脊髓損傷/ 移植處的支架材料仍未見報道。為此，我們設(shè)想構(gòu)建一種具有趨化內(nèi)源性細(xì)胞迀移功能的 生物活性支架。擬將這種具有趨化活性支架移植入脊髓損傷處，調(diào)動內(nèi)源性細(xì)胞迀移到損 傷/移植處實施自我修復(fù)脊髓損傷。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上治療脊髓損傷的技 術(shù)和方法上的不足，應(yīng)用我們構(gòu)建的具有趨化性能的生物活性支架為內(nèi)源性細(xì)胞修復(fù)脊髓 損傷提供嶄新的思路和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有的生物活性支架移植治療脊髓損傷的方案不足，本發(fā)明專利提供一 種具有趨化活性支架，該支架不僅能夠吸引內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞迀移到支架內(nèi)部存活和分化， 而且能夠通過緩釋神經(jīng)營養(yǎng)因子和誘導(dǎo)因子來改善脊髓損傷/移植區(qū)的微環(huán)境。
[0007] 本發(fā)明專利解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 利用蠶繭中提取的天然絲蛋白作為媒介，利用冷凍干燥技術(shù)使神經(jīng)營養(yǎng) 素-3 (NT-3)、維甲酸（RA)和絲蛋白混合液去水和除菌，乙醇促進趨化活性因子混合液的晶 形轉(zhuǎn)變，將趨化因子和誘導(dǎo)因子交聯(lián)固定在三維支架中。移植后，支架上的趨化活性因子會 緩慢釋放到脊髓損傷區(qū)的微環(huán)境中，以支架移植部位為中心形成一種趨化因子富集區(qū)，促 進相關(guān)的內(nèi)源性細(xì)胞向該區(qū)域迀移，達(dá)到吸引內(nèi)源性細(xì)胞迀移到支架內(nèi)部存活和分化修復(fù) 脊髓損傷的目的。
[0009] 本發(fā)明專利的有益效果是：
[0010] 這種具有功能性生物活性支架材料移植到脊髓損傷處后，可以較長時間釋放趨化 因子（NT-3)，持續(xù)吸引內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞迀移到支架內(nèi)，在誘導(dǎo)因子（RA)的協(xié)同作用下這些 內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞能夠更好地存活，并且向神經(jīng)組織細(xì)胞方向分化；同時釋放的NT-3具有神 經(jīng)保護作用，持續(xù)改善脊髓損傷/移植區(qū)的微環(huán)境。
【附圖說明】
[0011] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明專利進一步說明。
[0012] 圖1是具有趨化功能的生物活性支架的原理圖（1示：趨化因子、誘導(dǎo)因子和絲蛋 白復(fù)合物；2示：三維明膠海綿；3示：支架內(nèi)部的不規(guī)則多孔隙結(jié)構(gòu)；4示：PLGA外殼）。
[0013] 圖2是具有趨化功能的生物活性支架的溶脹率。
[0014] 圖3是具有趨化功能的生物活性支架的吸水率。
[0015] 圖4是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到神經(jīng) 纖維生長和星形膠質(zhì)細(xì)胞迀移進入損傷/移植區(qū)。
[0016] 圖5是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到包繞 著髓鞘結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維生長進入損傷/移植區(qū)。
[0017] 圖6是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到損傷 /移植區(qū)有表達(dá)TrkC的細(xì)胞迀移進入。
[0018] 圖7是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后，可觀察到血管樣 的結(jié)構(gòu)延伸進入損傷/移植區(qū)。
[0019] 圖8是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后，可觀察到大量細(xì) 胞迀移進入損傷/移植區(qū)。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過具體實施例對本發(fā)明所用的主要儀器、趨化活性支架和試劑作詳盡的描 述：
[0021] 1?主要儀器
[0022] 超凈工作臺（蘇州凈化電子設(shè)備廠）；普通離心機（久保田日本）；恒溫水浴箱 (北京醫(yī)療設(shè)備廠）；5%CO2培養(yǎng)箱（Queue美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus日本）；熒 光顯微鏡（Leica德國）；掃描電鏡（Philips荷蘭）；透射電鏡（Philips荷蘭）；激光共聚 焦成像系統(tǒng)（CarlZeiss德