一種脫細胞頜下腺基質(zhì)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)屬于及生物醫(yī)用材料的加工領(lǐng)域，具體涉及一種脫細胞頒下腺基質(zhì)材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由細胞分泌到細胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類大分子物質(zhì)。ECM通過高度組織有序的細胞外微環(huán)境，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架連接組織結(jié)構(gòu)，對細胞的生存、分化等細胞生理活動具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。因此，可模擬ECM的支架基底和支架材料是組織工程研宄和組織修復(fù)的理想載體。細胞與ECM的接觸是動態(tài)的，ECM的變化將會導(dǎo)致鄰近細胞形態(tài)和功能的改變。用于組織工程的理想支架材料需要為種植的細胞提供與體內(nèi)ECM相同或者相似的微環(huán)境(包括ECM的組成、結(jié)構(gòu)和生物力學特征等)。但是，天然的ECM是由多種蛋白質(zhì)組成(主要分為膠原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、彈性蛋白4大類)，并且具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，不易在體外重構(gòu)與體內(nèi)ECM組成相同和結(jié)構(gòu)一致的ECM材料。通過不同化學、物理或酶學去細胞方法從組織和器官獲得天然的ECM，為解決這一難題提供了新的有效解決途徑。去細胞化基質(zhì)具有組織或者細胞特異性的ECM蛋白質(zhì)和微結(jié)構(gòu)，同時具有良好的力學特性、細胞相容性以及生物降解性，有利于細胞粘附、生長、增殖及分化。
[0003]制備脫細胞基質(zhì)材料的方法有很多，主要是通過物理、化學和生物酶綜合處理的方法。中國專利申請?zhí)枮?01110134511.9的發(fā)明專利涉及制備一種脫細胞真皮基質(zhì)材料的方法，雖然可以比較徹底地去除細胞而且處理時間短，但是制備過程中采用了十二烷基硫酸鈉(SDS)的處理。由于SDS的強洗脫效果，很大程度上破壞了細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和生物活性，此外使用SDS制備的細胞外基質(zhì)具有潛在的生物毒性，不利于該基質(zhì)材料對組織的三維結(jié)構(gòu)重建。中國專利申請?zhí)枮?01210237911.7的發(fā)明專利涉及制備一種細胞外基質(zhì)支架材料的脫細胞方法。雖然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污劑在清洗過程中可能對再植細胞造成的潛在生物毒性，但主要應(yīng)用于含較多膠原纖維和彈力纖維的組織和器官，應(yīng)用到被膜較薄，主要由腺泡結(jié)構(gòu)組成的頒下腺組織中并不完全適用，并且本發(fā)明無需核酸酶處理，成本更低，方法也更為簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了克服以上技術(shù)的不足，采用健康的動物頒下腺組織為原料，應(yīng)用復(fù)合酶處理劑和無機鹽等化學物質(zhì)，提供一種具有良好生物相容性和適當?shù)纳锝到馑俾实拿摷毎C下腺基質(zhì)材料。
[0005]本發(fā)明的內(nèi)容包括一種脫細胞頒下腺基質(zhì)材料的制備方法，包括以下步驟:
[0006](I)選取健康的動物頒下腺組織，切成I厘米見方的小塊，用PBS緩沖液清洗備用；
[0007](2)將頒下腺組織塊反復(fù)凍融3次，破碎細胞；
[0008](3)把頒下腺組織塊置于75%酒精中消毒；
[0009](4)將頒下腺組織塊懸于入無菌三級水中，4°C中速攪拌處理6-12小時；
[0010](5)將頒下腺組織塊懸于5mM CaCljP 5mM MgCl 2無菌溶液中，4°C中速攪拌處理12小時；
[0011](6)將頒下腺組塊織懸于IM NaCl無菌溶液中，4°C中速攪拌處理12小時；
[0012](7)將頒下腺組織塊懸于無菌PBS緩沖溶液中，4°C中速攪拌處理12小時，獲得所述脫細胞頒下腺基質(zhì)材料。
[0013]進一步地，所述步驟(I)中選取組織為新鮮的無病毒感染的、無病史的動物頒下腺。
[0014]進一步地，所述步驟(I)中將頒下腺組織切成的小塊為Icm見方的小塊。
[0015]進一步地，所述步驟(2)中，破碎細胞的方法為將組織塊放入_80°C冰凍30分鐘后取出，在37°C水浴解凍，如此反復(fù)凍融3次。
[0016]進一步地，所述脫細胞頒下腺基質(zhì)材料可放置于含有90 μ g/ml氨芐的PBS中，4°C保存2個月以上。
[0017]本發(fā)明的內(nèi)容還包括根據(jù)上述任意一項的方法制備獲得的脫細胞頒下腺基質(zhì)材料。
[0018]本發(fā)明的脫細胞頒下腺基質(zhì)材料的制備方法中所有操作均在無菌超凈工作臺中進行。
[0019]采用本發(fā)明的方法所制備的脫細胞頒下腺基質(zhì)材料，能夠滿足以下醫(yī)學應(yīng)用和醫(yī)學研宄的要求:
[0020]1、作為頒下腺的替代品，用于手術(shù)后頒下腺損傷和缺失的修復(fù)。
[0021]2、可作為細胞培養(yǎng)和組織工程體外模型材料，如用于頒下腺再生和頒下腺發(fā)育研宄等。
[0022]本發(fā)明的方法和產(chǎn)品具有以下優(yōu)點:
[0023]1、在維持動物頒下腺三維組織構(gòu)造不變的前提下，徹底清除了動物頒下腺中的細胞成分，得到具有完整的三維組織構(gòu)造的頒下腺基質(zhì)。
[0024]2、具有良好的力學性能、可賦形性、良好的細胞分化增殖環(huán)境以及良好的粘附性會K ;
[0025]3、方法簡便、易行，經(jīng)濟、合理、安全、可靠。
[0026]4、整個工藝過程屬于清潔化制備，對環(huán)境無污染。
【附圖說明】
[0027]圖1a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的HE染色顯微鏡照片(X200)，圖1b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的HE染色顯微鏡照片(X200)。
[0028]圖2a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的掃描電子顯微鏡照片，圖2b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的掃描電子顯微鏡照片。
[0029]圖3為新鮮小鼠頒下腺組織DNA含量和脫細胞處理后小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料中的DNA含量柱狀圖。
[0030]圖4a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的Collagen I免疫組化結(jié)果，圖4b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的Collagen I免疫組化結(jié)果。
[0031]圖5a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的Collagen IV免疫組化結(jié)果，圖5b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的Collagen IV免疫組化結(jié)果。
[0032]圖6a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的Fibronectin免疫組化結(jié)果，圖6b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的Fibronectin免疫組化結(jié)果。
[0033]圖7a為含有細胞的新鮮小鼠頒下腺組織的Laminin免疫組化結(jié)果，圖7b為經(jīng)脫細胞處理后的小鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的Laminin免疫組化結(jié)果。
[0034]圖8a為含有細胞的新鮮大鼠頒下腺組織的HE染色顯微鏡照片，圖Sb為經(jīng)脫細胞處理后的大鼠頒下腺細胞外基質(zhì)材料的HE染色顯微鏡照片。
[0035]圖9為經(jīng)脫細胞處理后的大鼠頒下腺脫細胞外基質(zhì)的掃描電子顯微鏡照片。
[0036]圖10為新鮮大鼠頒下腺組織DNA含量和脫細胞處理后大鼠頒下腺脫細胞外基質(zhì)材料中的DNA含量柱狀圖。
[0037]圖1 Ia和圖1 Ib為小鼠頒下腺ECM材料在注射小鼠頒下腺原代細胞培養(yǎng)30天后的HE染色顯微鏡照片。其中圖1lb為(X200)。
[0038]圖12a和圖12b為利用Matrigel作為基質(zhì)模型誘導(dǎo)頒下腺干細胞分化，14天后的HE染色顯微鏡照片。其中圖12a為(X100)，圖12b為(X200)。
【具體實施方式】
[0039]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述。
[0040]實施例1小鼠頒下腺ECM的制作
[0041](I)取材:選取健康的小鼠的頒下腺組織，切成I厘米見方的小塊，用PBS清洗兩遍。至于EP管中-80°C冰箱備用。
[0042](2)破碎細胞:將組織塊從_80°C冰箱取出在37°C水浴鍋解凍后再放回-80°C冰箱冰凍30分鐘，如此反復(fù)凍融3次。
[0043](3)消毒和準備:把組織塊至于75%的酒精中，用縫合線將頒下腺組織塊吊起，懸掛于250ml的廣口瓶中，并在瓶底放置一枚Icm的磁力攪拌棒。
[0044](4)預(yù)清洗和破碎:加入250ml的無菌三級水，至于磁力攪拌器上(檔位2)4°C處理6小時。
[0045](5)清洗并增強核酸酶酶活:將頒下腺組織換到裝有250ml5mM CaCljP 5mM MgCl 2無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理12小時。
[0046](6)清洗細胞殘片:將頒下腺組織換到裝有250ml IM NaCl無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理12小時。
[0047](7)清洗:將頒下腺組織換到裝有250ml無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中，4°C處理12小時。
[0048]結(jié)果評價
[0049]1、ECM結(jié)構(gòu)觀察:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察ECM結(jié)構(gòu)，其HE染色顯微鏡照片見圖lb，同時制作新鮮小鼠頒下腺組織的HE染色，其顯微鏡照片見圖la?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的小鼠ECM結(jié)構(gòu)，證實無細胞結(jié)構(gòu)殘留，并且細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完整。
[0050]2、ECM超微結(jié)構(gòu)觀察:將ECM組織用臨界點干燥儀干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察，拍攝電子顯微鏡照片見圖2b，同時拍攝新鮮小鼠頒下腺組織電子微鏡照片見圖2a。對比兩圖可見用本發(fā)明方法制備的小鼠頒下腺ECM結(jié)構(gòu)，可以完整地脫去細胞結(jié)構(gòu)，并且比較完好地保留了細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的纖維結(jié)構(gòu)。
[0051]3、ECM 中 DNA含量檢測:將ECM組織磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop (Thermo)測定DNA含量，并與新鮮小鼠頒下腺組織DNA含量進行對比，結(jié)果見圖3?？梢娪帽景l(fā)明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量減少了 98.75%,表明成功去除了絕大部分核酸殘留。
[0052]4,ECM中Collagen I蛋白的免疫組化檢測:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，去過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，孵育Collagen I抗體(稀釋比例1:500) (abeam) 4°C過夜，孵育二抗室溫I小時，DAB顯色，封片觀察，拍攝顯微鏡照片如圖4b所示；同時拍攝新鮮小鼠頒下腺組織的Collagen I免疫組化顯微鏡照片4a作為對照。可見本發(fā)明制備的ECM材料較正常頒下腺