一種增強(qiáng)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生物抗氧化功能的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種增強(qiáng)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生物抗氧化功能的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種負(fù)責(zé)組織再生和修復(fù)的成體干細(xì)胞，最初發(fā)現(xiàn)于骨髓中，由于其再生和免疫調(diào)節(jié)的潛能，已在各大領(lǐng)域引起廣泛的關(guān)注。人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，尤其是來源于Wharton’s jelly (臍帶中包繞兩條臍動脈和一條臍靜脈黏蛋白樣結(jié)締組織)被認(rèn)為是細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)中理想的種子細(xì)胞。臍帶是一種胚胎外組織，因此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的雙重特性，其自我更新及多向分化潛能明顯優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0003]有越來越多的證據(jù)表明，活性氧(ROS)對細(xì)胞增殖、分化、死亡、基質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、氧化還原信號機(jī)制等是必不可少的，但細(xì)胞異常水平的ROS會導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)、脂類不可逆轉(zhuǎn)的損害，最終細(xì)胞走向衰老和死亡的命運。
[0004]盡管MSCs在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注，但其在體外擴(kuò)增和體內(nèi)移植過程中卻不可避免的暴露于相當(dāng)大的氧化應(yīng)激之下，造成ROS (如過氧化氫、羥基自由基、超氧化物陰離子自由基)超標(biāo)。體外長期培養(yǎng)的MSCs內(nèi)H2O2水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和增殖抑制。骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)軟骨細(xì)胞或中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生異常水平的ROS，影響MSCs的再生潛力。研宄表明，ROS的累積是由于接觸炎癥細(xì)胞因子引起，從而抑制干細(xì)胞的細(xì)胞增殖和多向分化潛能。
[0005]ROS生成和消除之間的平衡對細(xì)胞生存、增殖、分化至關(guān)重要。超氧化物歧化酶(SOD)，包括含有銅、鋅(S0D1和S0D2)和錳(S0D2)的同功酶，保護(hù)MSCs免受超氧化物陰離子催化生成的H2O2的活性氧損害。氧化應(yīng)激可以消除S0D2引起的人類滑膜起源的間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化能力下降和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)增加。此外，SOD產(chǎn)生的H2O2被過氧化氫酶(catalase)所中和，先前的大量研宄表明，提高M(jìn)SCs內(nèi)的catalase活性有利于緩解H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0006]MSC起源的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分包含I型和III型膠原蛋白，纖連蛋白、層粘連蛋白，可以充當(dāng)體外培養(yǎng)系統(tǒng)的微環(huán)境，促進(jìn)MSC擴(kuò)增、指引MSC向特定方向分化。脫細(xì)胞的ECM不僅可以模擬體內(nèi)干細(xì)胞細(xì)胞外微環(huán)境，還可調(diào)節(jié)生長因子和激素的生物學(xué)行為。這種運用脫細(xì)胞的ECM的培養(yǎng)方法可防止細(xì)胞復(fù)制衰老，增強(qiáng)終末分化細(xì)胞的再分化能力，如軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞。最近的研宄表明，脫細(xì)胞的ECM能改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期停滯。然而，ECM對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響卻鮮有人知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有的MSCs在體外擴(kuò)增和體內(nèi)移植過程中不可避免的暴露于相當(dāng)大的氧化應(yīng)激之下，造成ROS超標(biāo)的缺點，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生物抗氧化功能的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料、制備方法及其應(yīng)用，通過臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌基質(zhì)制備細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，不僅具有多種蛋白質(zhì)成分的特征，而且能用于間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，具有生物相容性好、增殖效率高、顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的優(yōu)點。
[0008]技術(shù)方案:
本發(fā)明的檢測內(nèi)容包括:(I)細(xì)胞外基質(zhì)生物材料對UC-MSCs增殖能力的影響；(2)細(xì)胞外基質(zhì)生物材料對UC-MSCs內(nèi)ROS和H2O2表達(dá)的影響；(3)細(xì)胞外基質(zhì)生物材料對UC-MSCs內(nèi)S0D-2表達(dá)的影響；(4)細(xì)胞外基質(zhì)生物材料對UC-MSCs內(nèi)Catalase活性的影響。
[0009]上述所述的內(nèi)容通過以下步驟實現(xiàn):
(A)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中(完全培養(yǎng)基組分為a-MEM和胎牛血清，它們的體積比為(4-9): 1，并且含有抗生素，抗生素的含量為10~200 U/mL)，密度多90%時，加入含有抗壞血酸(100-200uM)的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)7-10天，每3天換液一次，之后加入脫細(xì)胞液(由pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton X-100 0.5-5%體積比和氨水10_40mM)，構(gòu)建成細(xì)胞外基質(zhì)生物材料；
(B)UC-MSCs分別培養(yǎng)在普通的孔板(TCPS板)和底部鋪有細(xì)胞外基質(zhì)生物材料的孔板(ECM板)中，在不同的時間點檢測孔板中DNA含量，二乙酸熒光素(FDA)染色記錄不同時間點的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化；
(C)檢測TCPS板和ECM板上UC-MSCs內(nèi)ROS和H2O2含量；
(D)檢測TCPS板和ECM板上UC-MSCs內(nèi)S0D-2含量和Catalase活性。
[0010]所述UC-MSCs取自人源、豬源、鼠源或兔源。
[0011]所述細(xì)胞外基質(zhì)生物材料可應(yīng)用于包括細(xì)胞移植治療和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
[0012]上述所述的內(nèi)容具體分析步驟如下:
(I)FDA染色、DNA定量檢測分析細(xì)胞外基質(zhì)生物材料對UC-MSCs增殖能力的影響。
[0013](2) DCF-DA熒光定量法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
[0014](3) H2O2檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)H 202水平。
[0015](4) Western bort 檢測細(xì)胞內(nèi) S0D-2 含量。
[0016](5) Catalase活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)Catalase活性水平。
[0017]H2O2是ROS主要成分之一，在細(xì)胞增殖中起著雙重作用。低水平的H2O2 (〈10 μΜ)刺激成纖維細(xì)胞生長，而細(xì)胞暴露于高濃度的H2O2 (>400 μ Μ)則會快速凋亡。本發(fā)明的方案表明，細(xì)胞外基質(zhì)生物材料培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)H2O2水平下降，是支持細(xì)胞體外生存和快速增殖的一個重要原因。此外，超氧化物陰離子以劑量依賴的方式影響細(xì)胞增殖，低水平的超氧化物陰離子刺激細(xì)胞增殖，濃度增加則會抑制細(xì)胞生長。
[0018]增強(qiáng)抗氧化能力引起UC-MSCs中ROS水平下降，臨床治療方面有著廣泛的應(yīng)用。骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的S0D-2活性受損不僅導(dǎo)致其氧化損傷，還能加快骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程。
[0019]MSCs廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植治療和組織工程的研發(fā)，然而病理條件下超標(biāo)的ROS產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子改變了 MSCs的某些特性，影響其生存。因此在體內(nèi)移植的過程中，防止細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和提高細(xì)胞存活率顯得尤為重要。先前的研宄證明細(xì)胞培養(yǎng)在源自滑膜細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的脫細(xì)胞ECM顯著降低ROS水平，這樣闡明ECM調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的潛在分子機(jī)制將變得很有意義。
[0020]有益效果:本發(fā)明提供的一種增強(qiáng)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生物抗氧化功能的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料、制備方法及其應(yīng)用，MSCs在該細(xì)胞外基質(zhì)生物材料中培養(yǎng)比在TCPS板上培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的酶表達(dá)水平更高，尤其是S0D-2和Catalase ;S0D_2和Catalase活性增強(qiáng)導(dǎo)致ROS和H2O2水平減少，因此細(xì)胞外基質(zhì)生物材料能夠增強(qiáng)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生物抗氧化功能。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1為FDA染色記錄不同時間點TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情況圖。
[0022]圖2為DNA定量檢測分析不同時間點TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情況圖。
[0023]圖3為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內(nèi)ROS和H2O2含量變化圖。
[0024]圖4為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內(nèi)S0D-2含量變化圖。
[0025]圖5為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內(nèi)Catalase活性變化圖。
[0026]
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0028]實施例1
具體實驗步驟如下: