共軛亞油酸促進骨折愈合的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及共輒亞油酸促進骨折愈合的新用途，屬于醫(yī)藥新用途技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球經(jīng)濟的不斷發(fā)展、人類交際及流動范圍的迅速擴大、延伸與頻繁，拌之交 通手段的快速發(fā)展，則創(chuàng)傷造成的骨折發(fā)生率逐年增高，因此有關(guān)骨折的修復一直是骨科 學界研究的熱點問題。骨折愈合受全身和外界因素等多因素的影響，目前相關(guān)研究多關(guān)注 骨折內(nèi)固定材料和手術(shù)方式，以及藥物應用等方面對骨折愈合的影響，很少注意到營養(yǎng)物 質(zhì)代謝同樣也是一個重要影響因素。
[0003] 最近研究報道共輒亞油酸可以直接促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，促經(jīng) 骨形成。成骨細胞和破骨細胞的動態(tài)平衡在骨折愈合過程中具有重要的作用，那么共輒亞 油酸是否對骨折愈合有促進的作用。
[0004] 共輒亞油酸（(conjugated linoleic acid?簡寫CLA))是一組含有共輒雙鍵的亞 油酸的同分異構(gòu)體混合物，以雙鍵在9和11 (c9, tll-CLA)或10和12(tl0, C12-CLA)位置 上的同分異構(gòu)體含量最多，屬于多不飽和脂肪酸。已發(fā)現(xiàn)CLA的天然形式主要存在于反芻 動物的肉類和奶制品。近年來的廣泛研究證明，共輒亞油酸有多種生物學活性，例如減少動 脈粥樣硬化的嚴重程度，改善免疫不良刺激的影響，改善瘦素抵抗來發(fā)揮其降脂，CLA可以 抑制腫瘤細胞繁殖、抑制腫瘤細胞向細胞外基質(zhì)成分和纖維粘連蛋白粘附的作用。且具既 無毒又無任何副作用的生物安全性。目前國內(nèi)、外沒有關(guān)于CLA對骨折愈合方面的相關(guān)研 究，故設(shè)計本實驗研究CLA對骨折愈合的影響，以期提高我們對營養(yǎng)物質(zhì)代謝在骨折愈合 中重要作用的認識，為我們今后對骨折愈合的治療提供又一有效的方法和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了共輒亞油酸的系列生物學實驗，為開拓共輒亞油酸促進骨折愈合的 新用途提供了依據(jù)。具體生物學實驗研究結(jié)論包括以下方面：
[0006] 通過建立骨折模型，從血樣、影像學檢查、力學測試、組織學檢查等方面研究共輒 亞油酸對模型動物的影響。血清堿性磷酸酶（ALP)活性在骨折后2周時兩組對比有顯著性 差異（P〈0. 01)，X線攝片評價顯示共輒亞油酸干預組4周骨折線模糊，骨折端骨痂體積大、 骨痂數(shù)量多，三名骨折醫(yī)生對骨折后6周進行評分較空白對照組具有明顯統(tǒng)計學差異。根 據(jù)實驗結(jié)果推測：①共輒亞油酸可以促進骨折愈合。②增強機體內(nèi)成骨活動，提高ALP的活 性。提示其具有開發(fā)性的骨折藥物的前景。
【附圖說明】
[0007] 圖I :CLA組與空白兩組在不同時間點對大鼠血清ALP濃度的測定對比結(jié)果，在2 周時CLA干預組ALP濃度均明顯高于生理鹽水對照組（p = 0. 0126);
[0008] 圖2為CLA組與空白干預兩組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具有代表性的X 光片對比；
[0009] 圖3為影像學對骨折愈合組織的分級評分結(jié)果示；
[0010] 圖4為CLA組與空白組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具代表性的Micro-CT 掃描圖像對比（骨折愈合第4、6周）；
[0011] 圖5為CLA組與空白組在不同時間點的大鼠脛骨骨折斷端ROI的BMD測定比較；
[0012] 圖6為CLA組與空白組在不同時間點的大鼠脛骨骨折斷端橫截面積（CSA)測定比 較；
[0013] 圖7為CLA組與空白組在不同時間點的骨強度指數(shù)（BSI)的計算結(jié)果比較；
[0014] 圖8為CLA組與空白組在骨折愈合第6周最大彎曲應力測試比較；
[0015] 圖9 CLA組與空白組為在骨折愈合第6周大鼠骨折骨痂HE染色比較。
【具體實施方式】
[0016] 以下所列實施例，僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式 限制本發(fā)明。
[0017]〈實施例1>共輒亞油酸對小鼠骨折模型的影響
[0018] 1動物及主要材料
[0019] 1.1實驗動物
[0020] 雌性Sprague-Dawley大鼠30只，清潔級，體質(zhì)量（200 ±15) g
[0021] 1.2試劑和儀器
[0022] 共輒亞油酸（順-9,反-11CLA，37. 6%;反-10,順-12CLA，39. 3% ;C18:1，10. 11 %; cl8:0,2. 04%，青島澳海生物有限公司）
[0023]2實驗方法
[0024] 2. 1動物分組
[0025] 將30只雌性SD大鼠骨折造模后隨機分成2組，每組15只，A空白對照組 (Control):給予生理鹽水灌胃，B給予共輒亞油酸（CLA)灌胃干預（10g/Kg Miet)，曾有報 道應用該劑量研究共輒亞油酸對去勢大鼠鈣代謝和骨代謝的影響，實驗過程中對動物的處 置方法符合2006年科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。
[0026] 2. 2骨折大鼠骨折模型的建立與給藥方法
[0027] 用10%水合氯醛以3mL/kg進行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥，四肢固定于手術(shù)臺 上，各組大鼠行左側(cè)脛骨中段縱形皮膚切口，長約2cm，沿脛前肌肌間隙鈍性分離達脛骨干， 固定脛骨，在脛骨干中段用線鋸鋸斷成橫行骨折，此過程注意保護神經(jīng)和肌肉組織，再以直 徑為0. 8_的克氏針逆行穿入骨折近端且從脛骨結(jié)節(jié)穿出，復位骨折后再將其順行穿入骨 折遠段髓腔，生理鹽水沖洗，逐層關(guān)閉傷口。不包扎，不固定。術(shù)后在大鼠尾部標記，待麻醉 醒后放入籠中喂養(yǎng)，自由取食、飲水。
[0028]按照SD大鼠生活習性，活動多集中在黃昏到清晨這段時間，白天常在閉目休息， 所以選擇每日的灌胃時間在晚上6-8點之間。并自動物骨折模型造模成功后第一天開始進 行灌胃干預。每天18 :00灌胃一次，灌胃劑量為：A組給予生理鹽水灌胃，B組給予共輒亞 油酸灌胃干預（l〇g/Kg ? diet)，其他食物統(tǒng)一給標準鼠糧。各組大鼠均自由進食飲水，12h 光照周期。
[0029] 3標本的采集與檢測
[0030] 3. 1血樣采集與檢測
[0031] 血清堿性磷酸酶（ALP)測定：骨折造模后第2周、第4周和第6周，處死5只實驗 大鼠取I. 5ml血，離心后取上清液測定。
[0032] 3. 2影像學檢查
[0033] 3. 2. I X-Ray 攝片
[0034] X射線檢查大鼠脛骨骨痂的連續(xù)性及骨折愈合情況：在脛骨骨折造模后第2周、第 4周和第6周將各組大鼠用10%水合氯醛以3mL/kg進行腹腔注射麻醉后計算機X射線攝 相儀（DR)攝片，拍攝條件為50kV，2. 5ms，觀察大鼠脛骨骨痂的連續(xù)性及骨折愈合情況。
[0035] 評價方法采用骨痂形成的影像學評分：每張片均由3名高年資的骨科醫(yī)生分別 評分，對骨折斷端愈合組織具體評分標準：〇-無骨痂形成；1-少量或者中等量骨痂形成； 2_有豐富的骨痂形成；3-有連接骨膜骨痂形成，似"橋型連接";4-成熟的連接骨痂；5-連 接骨痂吸收完成，骨折完全連接。如表1所示：
[0036]
[0037] 3. 2. 2Micro_CT 掃描
[0038] 對大鼠脛骨骨折愈合第4周和第6周，進行MicroCT掃描，設(shè)定電壓65KV，電流 385mA，層間距17. 51 ym，以脛骨骨折線為中心，沿脛骨縱軸上下圍繞骨痂周圍各取200個 掃描層面，共400個層面，建立三維興趣區(qū)（ROI)以250ms的積分時間帶有0. 7°旋轉(zhuǎn)對興 趣區(qū)進行掃描。對骨痂形態(tài)學參數(shù)分別測量和計算分析，測量以骨折斷端為中心ROI的平 均橫截面積（CSA，cm 2)和ROI骨密度（BMD)。觀察及計算兩組以骨折端為中心ROI骨段的 力學強度指數(shù)（BSI)。骨強度指數(shù)可以客觀的反應出骨折愈合情況，并能夠提供具體的量 值，具有很強的準確性和特異性。
[0039] 骨強度指數(shù)（BSI)=橫截面積X骨密度，SP (BSI = CSAXBMD)
[0040] 3. 3力學測試
[0041] 在大鼠骨折愈合第6周通過"三點力學"測試評估骨折愈合強度，通過骨折愈合強 度能夠有效的評估和說明骨折愈合程度。將大鼠無痛處死后注意保護骨折斷端愈合的骨 痂組織，將其周圍的軟組織完全剝離。將脛骨放置在生物力學測試儀上，以17mm為跨度，以 5mm/min的速度下降加載負荷載力，直至脛骨斷裂[13]，根據(jù)載荷-變形曲線得出骨折端最 彎曲載荷力作為計量生物力學指標。
[0042] 3. 4組織學檢查
[0043] 3. 4. 1組織學標本的制備：
[0044] 無痛處死大鼠，將大鼠左后側(cè)脛骨分離，并注意保護骨折斷端愈合的骨痂組織，將 其周圍的軟組織完全剝離。標本于10%的福爾馬林中浸泡固定120h，自來水沖洗24h，按 組織學檢查的要求以及術(shù)前造模，以相應骨折部位為標志，在向脛骨遠端和近端延長0. 5CM 處（以確保能完整獲取骨折愈合區(qū)域）用于脫鈣組織學染色。
[0045] 4?統(tǒng)計學分析：
[0046] 采用SPSS17. 0對數(shù)據(jù)進行分析，采用均數(shù)土標準差表示，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)性及 方差齊性米用兩個獨立樣本的t檢驗，否則米用Wilcoxon秩和檢驗，檢驗水準a = 〇. 05， P〈0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0047] 5實驗結(jié)果
[0048] 5. 1血生化指標檢測結(jié)果：堿性磷酸酶（ALP)測定
[0049] 骨折2、4、6周后CLA干預組和空白對照組ALP濃度均有不同程度的升高，CLA干 預組在2周時ALP濃度均明顯高于生理鹽水對照組（p = 0. 0126);骨折后4周、6周CLA干 預組血清ALP濃度均高于生理鹽水A組，無統(tǒng)計學意義，如圖1所示。
[0050] 圖1:空白與CLA兩組在不同時間點的大鼠血清ALP濃度測定對比結(jié)果，在第2周、 4周、6周ALP的結(jié)果均比Control組高，其中在2周時CLA組ALP濃度均明顯高于Control 組（p = 0? 0126)*P < 0? 05。
[0051] 5. 2影像學檢查結(jié)果：X線檢查結(jié)果
[0052] X-Ray攝片：通過對CLA組和Control組X-Ray攝片的觀察和分析，在骨折愈合 第2周，未發(fā)現(xiàn)兩組有明顯區(qū)別，骨折斷端變化不明顯，骨折線清晰可見，未見骨痂組織形 成。在骨折愈合第4周，發(fā)現(xiàn)兩組均有骨痂形成，骨折線模糊，CLA組均有大量骨痂形成， 而Control組部分有骨痂形成，部分骨折線模糊，但未見明顯骨痂。在骨折愈合第6周，是 發(fā)現(xiàn)CLA組骨折斷端愈合，骨折線消失，多數(shù)外骨痂近于消失接近健康骨骼結(jié)構(gòu)和外形， Control組均產(chǎn)生大量骨痂，骨折線消失，但無一例接近骨折完全愈合標準，見圖2, CLA組 與Control組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具代表性的X-Ray攝片對比；
[0053] 從圖2結(jié)果可以看出：可以看出骨折愈合第2周兩組變化不明顯，第4周骨折斷 端均可見骨痂形成，第6周發(fā)現(xiàn)CLA組愈合接近完全愈合，Control組仍有外骨痂，并沒有 達到完全愈合標準。
[0054] X-Ray 攝片評分：通過 3 名骨科醫(yī)生依照 "Radiographic Grading Scale of Fracture Callus Formation"的標準評分分析，在骨折愈合第2周CLA組：I. 08±0. 16 分；Control 組：0? 83