殼聚糖金屬配合物微粒作為基于活性氧響應給藥載體的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種材料的新應用，特別涉及殼聚糖金屬配合物微粒作為基于活性氧 響應給藥載體的應用。
【背景技術】
[0002] 氧化應激會導致體內活性氧(Reactive oxygen species, R0S)含量的變化，氧化 響應性材料可根據(jù)ROS含量的變化自發(fā)地改變材料的宏觀或微觀性質，其變化的結果主要 包括材料的溶脹、溶解或特定的收縮、硬化等。這類針對于體內氧化微環(huán)境變化的材料主要 用于增強藥物載體的靶向性，現(xiàn)階段研究較多的是通過化學修飾的人工合成材料，包括有 機金屬聚合物、有機共輒聚合物、含雜原子的有機聚合物。人工合成的氧化響應材料，雖然 與ROS反應活性高，但是它們的制備條件、保存條件要求相對較高，對細胞毒性大，體內滯留 量大，對人體的免疫反應性強，這一系列問題一定程度上限制了合成氧化響應材料在醫(yī)藥 領域的使用?；诖?，現(xiàn)在人們越來越重視一些具有氧化響應特性的天然產(chǎn)物，以期避免化 學合成材料的一系列缺陷。
[0003] 殼聚糖金屬配合物(CS-Met)是殼聚糖或其衍生物和金屬離子反應生成的一種材 料。以殼聚糖或改性殼聚糖為基質，配合金屬離子所得殼聚糖基金屬配合物材料具有許多 優(yōu)異的性能，在酶固定化劑、分離膜、人工尿素吸附劑、納米微晶的生長誘導劑、化學催化 劑、植物生長調節(jié)劑以及金屬分離及含量檢測等領域有著良好的應用前景（尹學瓊，孫中 亮，林強等.殼聚糖基金屬配合物材料及其應用現(xiàn)狀[J].昆明理工大學學報）。
[0004] 楊自芳.殼聚糖及其衍生物金屬配合物的合成、表征和抗菌抗癌性能研究[D].上 海師范大學，2010,采用殼聚糖及其衍生物和稀土硝酸鹽及過渡金屬鹽為原料，運用回流冷 凝法和沉淀法，合成了一系列新型的殼聚糖及其衍生物金屬配合物CTS/RE (RE=La3+，Ce3 +，Ce4+，Pr3+，Nd3+，Sm3+，Eu 3+，Y3+，Er3+，Gd3+; CTS為殼聚糖及其衍生物），發(fā)現(xiàn)配合物對實驗用 菌都具有較好的抑制作用，屬于廣譜抗菌劑，具有良好的抗菌耐久性和長效性，并且配合物 對金黃色葡糖球菌的抗菌能力大于對大腸桿菌的抗菌能力。此外，還對部分配合物進行體 外抗癌活性測試研究，實驗靶細胞是人慢性粒細胞性白血病K562細胞。實驗中分別應用倒 置光顯鏡、熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡等對K562細胞及配合物作用后的細胞進行形態(tài)觀 察研究，運用MTT法進行細胞活性檢測，利用流式細胞儀檢測配合物作用后凋亡細胞率?？?腫瘤實驗結果表明殼寡糖鈰配合物對K562腫瘤細胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，與對 照組相比有顯著差異性，抑制率在一定范圍內隨劑量的增大而提高。
[0005] 現(xiàn)有的研究主要集中于殼聚糖金屬配合物的抗菌、抗腫瘤活性，但是目前還未見 有使用殼聚糖金屬配合物微粒作為氧化響應性藥物載體的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供殼聚糖金屬配合物微粒作為基于活性氧響應給藥載體的 應用。
[0007]本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種具有活性氧(過氧化氫)響應的殼聚糖金屬配合物微粒，殼聚糖的重均分子量為60 kDa~250 kDa，脫乙酰度為80~95%，金屬離子為二價或三價金屬離子。
[0008]微粒為微米級微粒及納米級微粒，特別包括粒徑在10 nm~1 μL?之間的微粒。
[0009] 作為上述殼聚糖金屬配合物微粒的進一步改進，金屬離子選自銅離子、鈣離子、鋅 咼子、鐵咼子。
[0010] 殼聚糖金屬配合物中金屬離子的配合量可以根據(jù)需要進行調節(jié)，優(yōu)選地，金屬離 子的配合量為其最大配合量的50~100%，最佳為50~90%。最大配合量定義將殼聚糖或殼聚 糖微粒與足量對應金屬離子的水溶性鹽混合并充分反應后所能配合的極限。特別的，殼聚 糖與金屬鹽的投料質量比為（1:1)~（5 : 1)，更佳的為（1:1)~（2.5 :1)，進一步優(yōu)選為 (1.67:1)~（2.5:1)〇
[0011] 上述殼聚糖金屬配合物微粒的制備方法，包括如下步驟： 1)將殼聚糖微粒與一種金屬離子的水溶性鹽溶液混合，制備得到殼聚糖金屬配合物微 粒，其中，殼聚糖的重均分子量為60 k~250 kDa，脫乙酰度為80~95%(Α型載體）； 或 a) 將殼聚糖與一種金屬離子的水溶性鹽溶液混合，制備得到殼聚糖金屬配合物； b) 將殼聚糖金屬配合物與多聚磷酸鈉混合，通過離子交聯(lián)法制備得到殼聚糖金屬配合 物微粒(B型載體）； 其中，殼聚糖的重均分子量為60 k~250 kDa，脫乙酰度為80~95%。
[0012] 作為上述制備方法的進一步改進，制備殼聚糖金屬配合物或殼聚糖金屬配合物微 粒時，殼聚糖或殼聚糖微粒與金屬鹽的投料質量比為（1:1)~(5:1)，優(yōu)選為（1:1)~（2.5: 1 )，進一步優(yōu)選為（1.67:1)~（2.5:1)，反應溫度為20~30°C，磁力攪拌器轉速為100~200 rpm，反應時間為1~4 h。質量比指干重時的質量比。
[0013]作為上述制備方法的進一步改進，步驟1)制備殼聚糖微?；虿襟Eb)制備殼聚糖金 屬配合物微粒時，殼聚糖與多聚磷酸鈉的質量比為6.25:1，反應溫度為20~30°C，磁力攪拌 器轉速為500~600 rpm，反應時間為20 min~60 min，pH為5.3~5.5。
[0014] 特別地，殼聚糖金屬配合物微粒的制備方法，包括如下步驟： 1) 將殼聚糖溶于1%醋酸溶液中充分攪拌Ih，用1.0 moI/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至 5.3~5.5后攪拌0.5 h，將8.0 mL多聚磷酸鈉溶液(1.0 mg/mL)在500~600 rpm轉速下緩慢 滴加到20 mL殼聚糖醋酸溶液(2.5 mg/mL)中，混合反應0.5 h后，3000 rpm離心10 min取上 清液，冷凍干燥后即得殼聚糖微粒； 2) 將殼聚糖微粒溶液和金屬鹽溶液混合反應3h后，3000rpm離心10min取上清液，冷凍 干燥后即得殼聚糖金屬配合物微粒(A型載體）。
[0015] 或包括如下步驟： a) 殼聚糖水溶液與金屬鹽溶液反應3h，然后室溫靜置，抽濾取沉淀，用3倍體積蒸餾水 和3倍體積無水乙醇依次洗滌3次，產(chǎn)物真空干燥即得殼聚糖金屬配合物； b) 將殼聚糖金屬配合物溶解在1%醋酸溶液中充分攪拌lh，然后用1.0m〇l/L的氫氧化鈉 溶液調節(jié)pH值至5.3~5.5后攪拌0.5 h，再將8.0 mL多聚磷酸鈉溶液（1.0 mg/mL)在500~ 600 rpm轉速下緩慢滴加到20 mL殼聚糖金屬配合物溶液（2.5 mg/mL)中，混合反應0.5 h 后，3000 rpm離心10 min取上清液，冷凍干燥即得殼聚糖金屬配合物微粒(B型載體）。
[0016] 殼聚糖金屬配合物微粒作為基于活性氧響應給藥載體的應用，其中殼聚糖金屬配 合物微粒如上所述，或上述的制備方法制備得到。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： 根據(jù)體外紫外濁度測定、尼羅紅體外釋放試驗試驗結果，發(fā)現(xiàn)不同方法制備得到的殼 聚糖金屬配合物微粒均具有很好的氧化響應性，在金屬離子的存在條件下兩種微粒的氧化 響應速率和體外釋放效率都有顯著的提高;并且A型載體的氧化響應能力較B型載體強;各 金屬離子配位的氧化敏感性也有所不同，以銅離子配合后的敏感性最強。根據(jù)細胞毒性實 驗和組織相容性實驗結果，A型載體和B型載體對組織器官均無明顯的炎癥反應，顯示出良 好的組織相容性。
[0018] 殼聚糖金屬配合物微粒有望開發(fā)為基于活性氧的智能響應性新型藥物載體。
【附圖說明】
[0019] 圖1~9是不同殼聚糖金屬配合物微粒在過氧化氫下紫外濁度的檢測結果； 圖10~12是不同殼聚糖金屬配合物微粒包載尼羅紅后在過氧化氫條件下的熒光強度 檢測結果； 圖13~21是不同分子量殼聚糖金屬配合物微粒包載尼羅紅后在過氧化氫條件下的熒 光強度檢測結果； 圖22和23是不同殼聚糖金屬配合物微粒的細胞毒性實驗結果； 圖24和25是殼聚糖鈣離子配合物微粒A型載體和B型載體的組織相容性實驗結果。
【具體實施方式】
[0020] 殼聚糖微粒的制備 參考Fan, ff. , et al. ,