一種基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧ct成像納米探針及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針，其特征在于，以Au@BSA作為探針載體，通過(guò)酰胺化反應(yīng)，將其與功能基團(tuán)NHA連接。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用BSA包裹制備得到Au@BSA作為納米探針載體，具有生物相容性好，高穩(wěn)定性且較高的X線吸收系數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，有利于靶向納米探針應(yīng)用于活體CT成像。本申請(qǐng)以硝基咪唑作為腫瘤乏氧的靶向基團(tuán)構(gòu)建功能性納米探針，將提高探針的敏感性，為腫瘤乏氧的評(píng)估及監(jiān)測(cè)提供可靠的手段。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及CT成像納米探針技術(shù)，尤其是涉及一種能夠靶向腫瘤乏氧狀態(tài)的CT成像納米探針及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乏氧是各種實(shí)體瘤普遍存在的現(xiàn)象。由于腫瘤失控性的生長(zhǎng)和增殖消耗大量營(yíng)養(yǎng)和氧氣，導(dǎo)致氧氣的需求量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于供應(yīng)量，使腫瘤內(nèi)呈乏氧狀態(tài)。乏氧與腫瘤的惡行程度、侵襲性及預(yù)后等多種因素有關(guān)。另外，腫瘤細(xì)胞在乏氧環(huán)境下對(duì)放射治療的敏感性會(huì)有較大程度的下降。因此對(duì)腫瘤乏氧進(jìn)行非侵入性的顯像、評(píng)估及監(jiān)測(cè)，對(duì)腫瘤的早期診斷、制定治療方案、評(píng)估治療療效及提高預(yù)后具有十分重要的意義。因此，臨床上迫切需要一種非侵襲性且具有較高空間和時(shí)間分辨率的成像方法對(duì)腫瘤乏氧進(jìn)行顯像。
[0003]在腫瘤乏氧成像研究中，硝基咪唑類(lèi)化合物是乏氧成像分子探針應(yīng)用最廣泛的靶向基團(tuán)。目前，PET和光學(xué)成像是應(yīng)用硝基咪唑基團(tuán)作為分子探針研究乏氧成像較多的成像技術(shù)。但是考慮到PET成像的高輻射，難以在腫瘤病人治療過(guò)程中反復(fù)監(jiān)測(cè)。而光學(xué)成像雖具有較高的檢測(cè)敏感度，但受限于空間分辨力，難以反映病灶的解剖學(xué)信息并且對(duì)組織的穿透能力較弱等缺點(diǎn)限制了其在臨床的應(yīng)用。因此，仍需構(gòu)建新型的分子探針實(shí)現(xiàn)腫瘤的乏氧成像。近年來(lái)，具有較高X射線衰減系數(shù)且生物相容性較好的金屬元素被越來(lái)越多的用作CT成像對(duì)比劑。如Au、Dy、B1、Yb等金屬元素，由于具有較高的原子序數(shù)所以對(duì)X射線具有較大的衰減系數(shù)和K邊緣能量。與傳統(tǒng)的碘對(duì)比劑相比，這些金屬元素具有更大的優(yōu)勢(shì)。其中，金納米粒子具有較高的X線吸收系數(shù)、良好的穩(wěn)定性以及生物相容性等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子影像探針和診斷治療學(xué)納米探針的構(gòu)建中。本發(fā)明利用具有良好生物相容性的BSA制備得到AuOBSA作為CT納米探針載體，并利用硝基咪唑基團(tuán)作為腫瘤乏氧的靶向基團(tuán)，構(gòu)建具有腫瘤革E向乏氧CT成像功能的納米探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針的制備方法，以高靈敏性實(shí)現(xiàn)活體腫瘤的乏氧靶向CT成像。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]一種基于金納米粒子的革El向腫瘤乏氧CT成像納米探針，其特征在于，以AuOBSA作為探針載體，通過(guò)酰胺化反應(yīng)，將其與功能基團(tuán)NHA連接。
[0007]上述基于金納米粒子的革El向腫瘤乏氧CT成像納米探針的制備方法采用以下步驟:
[0008](I)室溫條件下，將HAuCl4溶液和BSA溶液混合均勻，在持續(xù)磁力攪拌下，逐滴加入NaBH4水溶液，反應(yīng)完全后將得到的產(chǎn)物透析并冷凍干燥制備得到AuOBSA納米粒子；
[0009](2)乏氧功能基團(tuán)NHA的合成:首先利用6-溴己酸乙酯把2-硝基咪唑烷化，再在濃鹽酸條件下把乙烷基裂解掉，得到表面帶有羧基的NHA;
[0010](3)通過(guò)EDC/NHS活化劑將NHA上的羧基活化，與AuOBSA表面上的氨基相連，制備得到AuOBSA-NHA。
[0011 ] 步驟(I)中HAuCl4和NaBH4的質(zhì)量比是1:5?10。
[0012]步驟(2)的具體步驟為:
[0013]首先在單口燒瓶?jī)?nèi)加入乙腈，磁力攪拌下加入KC03、2_硝基咪唑和6-溴己酸乙酯，將上述混合物加熱至60 0C反應(yīng)6天;反應(yīng)結(jié)束后加入KCO3使反應(yīng)物的pH值調(diào)至7?8，之后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀懸蒸，將上述有機(jī)層液體清洗并用無(wú)水硫酸鈉干燥后得到淺黃色油狀液體，即得中間產(chǎn)物乙基-(2-咪唑基)己酸;將得到的中間產(chǎn)物乙基-(2-咪唑基)己酸溶解在濃鹽酸中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，最后將上述反應(yīng)液體懸蒸得最終產(chǎn)物NHA。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用BSA包裹制備得到AuOBSA作為納米探針載體，具有生物相容性好，高穩(wěn)定性且較高的X線吸收系數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，有利于靶向納米探針應(yīng)用于活體CT成像。本申請(qǐng)以硝基咪唑作為腫瘤乏氧的靶向基團(tuán)構(gòu)建功能性納米探針，將提高探針的敏感性，為腫瘤乏氧的評(píng)估及監(jiān)測(cè)提供可靠的手段。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為制備得到的AuOBSA-NHA的TEM照片。
[0016]圖2為AuOBSA、NHA和AuOBSA-NHA紫外可見(jiàn)光譜圖。
[0017]圖3定量分析不同濃度下的AuOBSA-NHA在常氧和乏氧條件下的細(xì)胞吸收量(AuOBSA作為對(duì)照)。
[0018]圖4為腫瘤小鼠注射AuOBSA-NHA前和注射后36h的活體CT圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖給出本發(fā)明較佳實(shí)施例，以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0020]以下實(shí)施例中所采用的試劑包括:水合氯金酸(HAuCl4.他0)、硼氫化鈉(他8!14)、2-硝基咪唑、6-溴己酸乙酯購(gòu)買(mǎi)于上海安耐吉化學(xué)公司。99%凍干牛血清蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich 公司。
[0021]實(shí)施例1: AuOBSA納米粒子的制備
[0022]將凍干的牛血清白蛋白(BSA)(788mg，0.012mmol)配制成濃度為26mg/mL的BSA溶液，在持續(xù)磁力攪拌下迅速加入濃度為30mM的氯金酸溶液(HAuCl4.4H20)。向上述混合液內(nèi)逐滴緩慢加入NaBH4水溶液(2mL，50mg/ml)，并緩慢持續(xù)攪拌2h。之后將得到的產(chǎn)物透析并冷凍干燥后放4 °C冰箱保存待用。
[0023]實(shí)施例2:Au@BSA-NHA納米探針的制備
[0024](I)首先在50mL單口燒瓶?jī)?nèi)加入30ml乙腈，磁力攪拌下加入4.9g KCO3(35.4mmol)，2.0g(17.7mmoI)2_硝基咪卩坐和4.15g(18.6mmol)6_溴己酸乙酯，將上述混合物加熱至60°C反應(yīng)6天。反應(yīng)結(jié)束后加入KCO3使反應(yīng)物的pH值調(diào)至7?8，之后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀懸蒸，將上述有機(jī)層液體清洗并用無(wú)水硫酸鈉干燥后得到淺黃色油狀液體，即得中間產(chǎn)物乙基-(2-咪卩坐基)己酸。稱取4.5g中間產(chǎn)物在1mL濃鹽酸中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。最后將上述反應(yīng)液體懸蒸得最終產(chǎn)物NHA。
[0025](2)稱取16211^(0.711111101)冊(cè)5和68211^(3.611111101沾0(:溶解在51111去離子水中，加入162mg(0.7mmol)NHA。將上述反應(yīng)物室溫?fù)u床4h以活化NHA上的羧基。待反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物逐滴緩慢加入上述AuOBSA溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物透析并冷凍干燥。
[0026]所制得的AuOBSA-NHA納米探針的TEM如圖1所示。
[0027]圖2的紫外可見(jiàn)光譜圖證明NHA成功地連接到AuOBSA納米粒子上。
[0028]實(shí)施例3: AuOBSA-NHA體外CT成像
[0029]將AuOBSA-NHA配制成不同濃度梯度的水溶液，分別置于200yL EP管中。使用GE公司寶石CT(Discovery CT750HD)進(jìn)行掃描，掃描參數(shù):選擇F0V = 25.0cm，層厚= 0.625mm，球管管電壓100kV，管電流80mA。掃描結(jié)束后在后處理工作站(AW4.4;GE Healthcare，USA)測(cè)量每一濃度溶液的CT值，每個(gè)樣品分別測(cè)量三次，取平均值作為該樣品的CT值。
[0030]實(shí)施例4:檢驗(yàn)AuOBSA-NHA體外乏氧靶向的能力
[0031]對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BxPC-3細(xì)胞計(jì)數(shù)后，在兩塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中接種3X 15個(gè)細(xì)胞在37°C，5%⑶2條件下孵育過(guò)夜。棄掉舊的培養(yǎng)基，重新加入含不同濃度的AuOBSA-NHA的新鮮培養(yǎng)基(濃度梯度為50和100yg/mL)，將兩塊6孔板分別在常氧狀態(tài)(95%02)及乏氧狀態(tài)下(I %02)共孵育24h。孵育結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，PBS洗滌、離心后用ICP-AES測(cè)細(xì)胞內(nèi)Au的量，比較細(xì)胞在常氧和乏氧狀態(tài)下對(duì)AuOBSA-NHA的吞噬量，同時(shí)與AuOBSA作對(duì)比，如圖3所示。
[0032]實(shí)施例5:腫瘤活體靶向CT成像活體實(shí)驗(yàn)
[0033]人胰腺癌BxPC-3裸鼠皮下腫瘤模型建立成功后，待腫瘤直徑達(dá)約0.5?0.8cm時(shí)(接種后大約10天)，腹腔注射10yL戊巴比妥鈉麻醉后，尾靜脈注射300yL(300mg Au/kg)AuiBSA-NHA，分別在注射前和注射后I，3，5，7，12，24，36和48h后行CT掃描，動(dòng)態(tài)觀察腫瘤內(nèi)密度的變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)掃3只鼠，掃描結(jié)束后測(cè)腫瘤部位的CT值。掃描參數(shù):選擇FOV =25.0cm，層厚=0.625mm，球管管電壓100kV，管電流80mA。同時(shí)相同劑量下注射無(wú)靶向作用的AuOBSA作為對(duì)照。
[0034]實(shí)驗(yàn)例6:檢驗(yàn)AuOBSA-NHA乏氧成像的靈敏性
[0035]利用與胰腺癌腫瘤乏氧水平不同的人纖維肉瘤HT-1080皮下腫瘤模型作對(duì)比，觀察AuOBSA-NHA對(duì)兩種腫瘤模型的CT成像差異。CT掃描方案見(jiàn)實(shí)施例5。
[0036]小鼠腫瘤活體CT成像見(jiàn)圖4。
[0037]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于金納米粒子的革E向腫瘤乏氧CT成像納米探針，其特征在于，以AuOBSA作為探針載體，通過(guò)酰胺化反應(yīng)，將其與功能基團(tuán)NHA連接。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針的制備方法，其特征在于，采用以下步驟: (1)室溫條件下，將HAuCl4溶液和BSA溶液混合均勻，在持續(xù)磁力攪拌下，逐滴加入NaBH4水溶液，反應(yīng)完全后將得到的產(chǎn)物透析并冷凍干燥制備得到AuOBSA納米粒子； (2)乏氧功能基團(tuán)NHA的合成:首先利用6-溴己酸乙酯把2-硝基咪唑烷化，再在濃鹽酸條件下把乙烷基裂解掉，得到表面帶有羧基的NHA; (3)通過(guò)EDC/NHS活化劑將NHA上的羧基活化后，與AuOBSA表面上的氨基相連，制備得到AuOBSA-NHA03.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針的制備方法，其特征在于，步驟(I)中HAuCl4和NaBH4的質(zhì)量比是1:5?10。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于金納米粒子的靶向腫瘤乏氧CT成像納米探針的制備方法，其特征在于，步驟(2)的具體步驟為: 首先在單口燒瓶?jī)?nèi)加入乙腈，磁力攪拌下加入KC03、2-硝基咪唑和6-溴己酸乙酯，將上述混合物加熱至60 °C反應(yīng)6天;反應(yīng)結(jié)束后加入KCO3使反應(yīng)物的pH值調(diào)至7?8，之后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀懸蒸，將上述有機(jī)層液體清洗并用無(wú)水硫酸鈉干燥后得到淺黃色油狀液體，即得中間產(chǎn)物乙基_(2-咪唑基)己酸;將得到的中間產(chǎn)物乙基_(2-咪唑基)己酸溶解在濃鹽酸中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，最后將上述反應(yīng)液體懸蒸得最終產(chǎn)物NHA。
【文檔編號(hào)】A61K49/04GK105920621SQ201610453135
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】繆飛, 史紅媛, 賈能勤, 黃楚森, 王智明
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院, 上海師范大學(xué)