一種靶向多肽納米探針及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向多肽納米探針，此靶向多肽納米探針能夠特異性靶向動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成部位，可在該靶向部位進(jìn)行磁共振成像并準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活體內(nèi)發(fā)生以及發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣斑塊的精確可視化，為早期預(yù)防、診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供了更為全面的分子信息。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了此靶向多肽納米探針的制備方法。
【專利說(shuō)明】
一種靶向多肽納米探針及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及造影劑技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種靶向多肽納米探針及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康，影響生活質(zhì)量的 疾病，己成為我國(guó)與西方人口死亡和致殘的主要病因。對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成部位的 動(dòng)態(tài)成像監(jiān)測(cè)已成為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的治療提供有用信息的重要技術(shù)手段。而現(xiàn)有的 用于對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成部位成像的造影劑其靶向性差、不能準(zhǔn)確反映脈粥樣斑塊 及血栓形成部位的動(dòng)態(tài)進(jìn)展或變化過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種靶向多肽納米探針，此靶向多肽納米探針可適用于磁 共振成像，其能夠特異性靶向動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成部位，準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活 體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程。
[0004] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種靶向多肽納米探針的制備方法，以制得靶向多肽 納米探針，此靶向多肽納米探針可用于磁共振成像，其能夠特異性導(dǎo)向動(dòng)脈粥樣斑塊及血 栓形成部位，準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程。
[0005] 本發(fā)明的又一目的在于提供的靶向多肽納米探針應(yīng)用來(lái)制備用于針對(duì)動(dòng)脈粥樣 斑塊成像的造影劑。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種靶向多肽納米探針，其由超順磁性氧化鐵納米顆粒經(jīng)偶聯(lián)劑表面修飾后，再 與多肽偶聯(lián)得到，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。
[0008] -種靶向多肽納米探針的制備方法，其包括：
[0009] 制備超順磁性氧化鐵納米顆粒的膠體溶液，其中，超順磁性氧化鐵納米顆粒偶聯(lián) 劑表面修飾；
[0010] 制備多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO. 3所示或如SEQ ID NO.4所示；以及
[0011] 將多肽加入到膠體溶液中，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0012] 本發(fā)明實(shí)施例提供的靶向多肽納米探針及其制備方法和應(yīng)用有益效果是:將具有 如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示的 氨基酸序列的多肽與經(jīng)偶聯(lián)劑表面修飾后的超順磁性氧化鐵納米顆粒偶聯(lián)，偶聯(lián)后所得到 的靶向多肽納米探針能夠特異性靶向動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成部位，可在該靶向部位進(jìn)行 磁共振成像。進(jìn)而可準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活體內(nèi)發(fā)生以及發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程，實(shí) 現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣斑塊的精確可視化，為早期預(yù)防、診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供了更為 全面的分子信息。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附 圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì) 范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這 些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1和2提供多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒的結(jié)構(gòu)模式圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的超順磁性氧化鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)的TEM圖；
[0016] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的EGFl多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒（EGF1-PEG-SPIONs)的凝膠電泳圖；
[0017] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2的El多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒(El-PEG-SPIONs)的 TEM 圖；
[0018] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2的El多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒(El-PEG-SPIONs)的 磁飽和曲線圖；
[0019] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例2的El多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒(El-PEG-SPIONs)的 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；
[0020] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例3的超順磁性氧化鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)和EGFl多肽偶聯(lián) 超順磁性氧化鐵納米顆粒(EGFl-PEG-SPIONs)的T2加權(quán)像(T2-weighted image，T2WI);
[0021] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例3的超順磁性氧化鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)和EGFl多肽偶聯(lián) 超順磁性氧化鐵納米顆粒(EGFl-PEG-SPIONs)的T2弛豫率；
[0022]圖9為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈切片HE染色圖；
[0023] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈切片油紅0染色圖；
[0024] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈切片免疫組化圖；
[0025] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型在注射不同濃度的超順磁性氧化 鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)和EGFl多肽偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒(EGFl-PEG-SPIONs)后 不同時(shí)間的T2WI圖；
[0026] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型尾靜脈注射EGFl多肽偶聯(lián)超順磁 性氧化鐵納米顆粒(EGFl-PEG-SPIONs)并完成核磁共振掃描后的主動(dòng)脈切片普魯士藍(lán)染色 圖；
[0027] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例3的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型尾靜脈注射超順磁性氧化鐵納米 顆粒(PEG-SPIONs)并完成核磁共振掃描后的主動(dòng)脈切片普魯士藍(lán)染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中 的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建 議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0029] 下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的靶向多肽納米探針和靶向多肽納米探針的制備方法進(jìn)行 具體說(shuō)明。
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例提供的靶向多肽納米探針由超順磁性氧化鐵納米顆粒 (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)經(jīng)偶聯(lián)劑表面修飾后，再與多 肽偶聯(lián)得到。
[0031] 其中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO. 2所示或如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。
[0032] 優(yōu)選地，偶聯(lián)劑為經(jīng)羧基化的聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG) dPEG是一種 水溶性高分子材料，由于其在水中具有很低的界面自由能，而且分子鏈柔性好、活動(dòng)性高， 所以具有良好的生物相容性，在血液中不引起凝血，溶血等不良反應(yīng)，不容易被巨噬細(xì)胞、 抗體等消滅，在血液循環(huán)中可以存在的更久。因此，被PEG修飾的納米顆粒能夠很順利地靶 向到相應(yīng)的組織部位。PEG再經(jīng)過(guò)羧基化修飾后，其末端的羧基可與多肽的氨基進(jìn)行偶聯(lián)， 確保多肽的活性不受影響。PEG對(duì)SPIONs表面修飾后，得到羧基化聚乙二醇修飾的超順磁性 氧化鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)。
[0033]當(dāng)然，偶聯(lián)劑也可以是羧基化的葡萄糖、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、硅 烷以及無(wú)水硅酸等，可根據(jù)實(shí)際使用情況選用。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例提供的靶向多肽納米探針的制備方法包括以下步驟：
[0035] 步驟Sl:制備超順磁性氧化鐵納米顆粒
[0036] 制備經(jīng)偶聯(lián)劑表面修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒的膠體溶液，即磁流體。超順 磁性氧化鐵納米顆粒以其超順磁特性在磁共振成像中具有獨(dú)特的造影功能。相對(duì)于其他的 造影劑，以超順磁性氧化鐵納米顆粒作為造影劑，具有更佳的靈敏性以及更好的弛豫性。其 對(duì)MR影像的作用主要是通過(guò)縮短橫向弛豫時(shí)間即T2時(shí)間，從而降低目標(biāo)區(qū)域的T2信號(hào)強(qiáng) 度，表現(xiàn)出更強(qiáng)的MR造影增強(qiáng)效果。
[0037]優(yōu)選地，偶聯(lián)劑為羧基化的聚乙二醇
[0038]以羧基化的聚乙二醇作為偶聯(lián)劑對(duì)超順磁性氧化鐵納米顆粒進(jìn)行表面修飾，一方 面提高超順磁性氧化鐵納米顆粒的親水性，增加其穩(wěn)定性以及生物相容性;另一方面羧基 化的聚乙二醇可提供羧基，為生物大分子偶聯(lián)提供可能。因此，羧基化聚乙二醇表面修飾后 的超順磁性氧化鐵納米顆粒與多妝的氣基進(jìn)彳丁偶聯(lián)反應(yīng)，可提尚多妝與超順磁性氧化鐵納 米顆粒偶聯(lián)成功的概率，以及確保偶聯(lián)后的多肽的活性不受影響。
[0039]具體的，采用高溫?zé)峤夥?，以鐵鹽為原料例如是FeC13和FeC12,制得以Fe304為核 心的超順磁性氧化鐵納米顆粒;再用羧基化聚乙二醇對(duì)其進(jìn)行表面修飾，也就是功能化修 飾，在超順磁性氧化鐵納米顆粒的表面形成親水膜，轉(zhuǎn)移到水相后，得到經(jīng)羧基化的聚乙二 醇表面修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(PEG-SPIONs)的膠體溶液。
[0040] 步驟S2:制備多肽
[00411 制備多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO. 2所示或如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。
[0042]具體的，采用合成法或宿主細(xì)胞重組表達(dá)多肽再純化的方法得到多肽，得到多肽 后保存于_20°C。進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)前，可將多肽溶于pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，再經(jīng)過(guò) 濾除菌以防止多肽被降解以及氧化。
[0043]具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，即為凝血因子類表皮生長(zhǎng)因子I區(qū)多 肽(EGFl)，該EGFl多肽能夠靶向任何高表達(dá)組織因子(Tissue Factor，TF)的組織部位，由 于動(dòng)脈粥樣斑塊部位高表達(dá)TF，因此，該多肽能夠特異性靶向動(dòng)脈粥樣斑塊部位，且特異性 強(qiáng)。
[0044] TF以不同形式存在于各種細(xì)胞和血液循環(huán)中，依照所起功能不同可分為"解密型" TF與"靜密型"TF。"解密型"TF也就是處于活化狀態(tài)的TF，其主要在于血液循環(huán)中且量比較 少；"靜密型"TF也就是處于非活化狀態(tài)的TF，其主要存在于血管外膜。當(dāng)動(dòng)脈粥樣斑塊具有 破裂傾向時(shí)，局部的TF能迅速釋放并活化，ΒΓ解密型"TF，并結(jié)合血液中的凝血因子FWa等 以啟動(dòng)凝血。而"靜密型" TF發(fā)揮最大促凝潛能需要活化，這個(gè)活化過(guò)程被稱為"解密"。
[0045] 其中，"解密型"TF促凝活性隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的增多而增強(qiáng)，作為凝血途徑 與炎癥反應(yīng)中的共同因子，其在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定斑塊的形成具有重要作 用，是早期發(fā)現(xiàn)易損斑塊的理想靶標(biāo)。
[0046]然而，目前臨床有關(guān)TF的檢測(cè)只能做到定量循環(huán)血漿中總游離TF水平即"解密型" TF和"靜密型" TF的水平。目前，缺乏能夠特異靶向"解密型" TF的造影劑，來(lái)準(zhǔn)確評(píng)估動(dòng)易損 斑塊。
[0047] 優(yōu)選地，制備具有如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多肽，即El多肽，該El多肽凝 血因子類表皮生長(zhǎng)因子I區(qū)多肽(EGFl)的衍生肽，該El多肽同樣具有靶任何高表達(dá)TF的組 織部位的能力，該El多肽也能夠特異性靶向動(dòng)脈粥樣斑塊部位。此外，相對(duì)于EGFl多肽，該 El多肽能夠靶向表達(dá)"解密型" TF。為利用El多肽監(jiān)測(cè)"解密型" TF的活化狀態(tài)來(lái)評(píng)估動(dòng)脈粥 樣斑塊提供了可靠途徑。且該El多肽檢測(cè)的分子量小，有利于提高偶聯(lián)該El多肽后的PEG-SPIONs的穿透力，降低其免疫原性，減少體內(nèi)蓄積；同時(shí)El多肽的構(gòu)象敏感性高、能夠準(zhǔn)確 靶向"解密型"TF，且對(duì)正常人血漿凝血功能無(wú)影響無(wú)副作用。此外，也可以制備具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的E2多肽或如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的E3多肽。E2多肽和E3 多肽的功能與El多肽類似，均能夠靶向"解密型" TF。
[0048] 其中，El多肽、E2多肽以及E3多肽的序列均由發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)資料，利用相 關(guān)分析軟件，采用序列比對(duì)、骨架疊合、對(duì)接打分進(jìn)行驗(yàn)證等方法從EGFl多肽的序列上剪接 所得。
[0049] 步驟S3:偶聯(lián)
[0050]將多肽即EGFl多肽或El多肽或E2多肽或E3多肽與經(jīng)偶聯(lián)劑表面修飾后的超順磁 性氧化鐵納米顆?；旌?，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，以得到EGFl多肽偶聯(lián)的偶聯(lián)劑表面修飾的超順磁 性氧化鐵納米顆粒(EGFl-PEG-SPIONs)或El多肽偶聯(lián)的偶聯(lián)劑表面修飾的超順磁性氧化鐵 納米顆粒(El-PEG-SPIONs)或E2多肽偶聯(lián)的偶聯(lián)劑表面修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒 (E2-PEG-SPI0NS)或E3多肽偶聯(lián)的偶聯(lián)劑表面修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(E3-PEG-SPIONs)，也就是靶向多肽納米探針。
[0051 ]具體的，首先，將步驟Sl中得到含有PEG-SPIONs的膠體溶液，分散于MES緩沖液(2-嗎啉代乙磺酸緩沖液），得到分散液。
[0052]其中，膠體溶液與MES緩沖液的質(zhì)量體積比為0.8~1.2:1。優(yōu)選地，膠體溶液與MES 緩沖液的質(zhì)量體積比為1:1。
[0053] 其中，MES緩沖液的pH為5.8~6.2。優(yōu)選地，MES緩沖液的pH為6.0。
[0054]接著，往上述分散液中加入過(guò)量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，進(jìn)行活化處理，在搖床上80~100rpm/min、4°C條件 下活化反應(yīng)30~45min。
[0055] EDC和NHS的主要作用在于，該兩種試劑可對(duì)PEG-SPIONs的羧基進(jìn)行活化，提高其 后續(xù)與多肽偶聯(lián)反應(yīng)的成功率。
[0056]然后，將活化處理后的分散液進(jìn)行超濾離心處理，將分散液轉(zhuǎn)移到超濾離心管(孔 徑30KD)，在5000~6000rpm/min、4°C條件下離心30~45min，以去除分散液中未參與活化反 應(yīng)的EDC和NHS。
[0057]再接著，往分散液中加入多肽即EGFl多肽或El多肽或E2多肽或E3多肽，多肽的量 與上述膠體溶液的質(zhì)量比為0.5~0.8:1，再在搖床上80~100rpm/min、4°C條件下進(jìn)行偶聯(lián) 反應(yīng)12~16小時(shí)。
[0058]反應(yīng)結(jié)束后，再進(jìn)行超濾離心，將分散液轉(zhuǎn)移到超濾管超濾離心管(孔徑30KD)中， 在5000~6000rpm/min、4°C條件下離心30~45min。該步驟目的在于將沒(méi)有偶聯(lián)上的多肽濾 去，即得到靶向多肽納米探針，也就是EGFl-PEG-SPIONs或El-PEG-SPIONs或E2-PEG-SPI0Ns 或E3-PEG-SPI0Ns。
[0059] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0060] 實(shí)施例1 [0061 ] 制備EGFl多肽
[0062]采用化學(xué)合成法制備EGFl多肽，由杭州中肽生化有限公司合成，EGFl多肽的氨基 酉愛(ài)序列：Cys-Ala-Ser-Asn-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Gln-Asp-His-Leu-Lys-Ser-Tyr-Val-Cys-Leu-Cys-Pro-Leu-Asp-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys。凍干 EGFl 多肽保存 于-20。。。
[0063] 制備 PEG-SPIONs
[0064] 采用高溫?zé)峤夥?，以鐵鹽為原料例如是FeC13和FeC12,制得以Fe304為核心的 SPIONs;用油酸包覆、再用羧基化的PEG對(duì)其進(jìn)行表面修飾，轉(zhuǎn)移到水相后，得到PEG-SPIONs 的膠體溶液。當(dāng)然，該P(yáng)EG-SPIONs膠體溶液也可在市面上直接購(gòu)買(mǎi)。
[0065] 偶聯(lián)
[0066]首先，將5mg的膠體溶液分散于5mL MES緩沖液中，得到PEG-SPIONs分散均勻的分 散液。其中，MES緩沖液PH為6，
[0067] 然后，往上述分散液中加入0.5mL EDC(濃度為10mg/mL)和ImL NHS(濃度為IOmg/ mL)，在80rpm/min的搖床上、4°C，活化反應(yīng)30min。
[0068]再然后，將進(jìn)行活化反應(yīng)后的分散液轉(zhuǎn)移到超濾離心管（孔徑30KD)中，在 5000rpm/min、4°C條件下離心30min，去除多余的EDC和NHS。
[0069] 接著，往超濾離心后的分散液中加入2.5mg EGF1多肽，在80rpm/min、4 °C條件下進(jìn) 行偶聯(lián)反應(yīng)12小時(shí)。
[0070] 再接著，將反應(yīng)結(jié)束后的分散液再次轉(zhuǎn)移到新的超濾離心管中（孔徑30KD)，在 5000rpm/min、4°C條件下離心30min，濾去沒(méi)有偶聯(lián)上的EGFl多肽。收集濾液，該濾液即含有 EGFl-PEG-SPIONs，即靶向多肽納米探針。EGFl-PEG-SPIONs的結(jié)構(gòu)模式圖如圖1所示。保存 濾液，并對(duì)該EGFl-PEG-SPIONs進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
[0071] 對(duì)EGFl-PEG-SPIONs的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如下。
[0072] (1)偶聯(lián)效率
[0073] 采用BCA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，在紫外分光光度計(jì)(SMMADZU，UV-3600)檢 測(cè)濾液中所含多肽的量。結(jié)果顯示，5mL的濾液中，EGFl多肽濃度為2.07mg/mL。偶聯(lián)效率為 82.8 %，即2.5mg EGFl多肽進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后有2.07mg的EGFl多肽成功偶聯(lián)上PEG-SPIONs。 此外，含EGFl-PEG-SPIONs的5mL濾液中的鐵濃度為1.16mg/mL。
[0074] (2)EGFl-PEG_SPI0Ns的電鏡尺寸、水動(dòng)力尺寸（DLS hydrodynamic diameter)以 及Zeta電位檢測(cè)
[0075]利用透射電子顯微鏡(TEM，Tokyo，JE0L2100)分別檢測(cè)超順磁性氧化鐵納米顆粒 (PEG-SPIONs)和EGFl-PEG-SPIONs的電鏡尺寸大小；利用粒度電位分析儀(Malvern，ZETA SIZER，Nano ZS90)分別檢測(cè)PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs的Zeta電位和水動(dòng)力尺寸 (DLS)大小，結(jié)果如表1和圖2所示。
[0076] 表1EGFI-PEG-SPI ONs的電鏡尺寸、DLS尺寸以及Ze ta電位檢測(cè)結(jié)果
[0078]由圖2可知，在透射電鏡觀察下，PEG-SPIONs顆粒大小均勻、外觀圓整，結(jié)合表1可 知，PEG-SPIONs的粒徑大小在9.90nm左右。由于EGFl-PEG-SPIONs的偶聯(lián)多肽的分子太小， 通過(guò)染色，透射電鏡觀察顯示EGFl-PEG-SPIONs的電鏡尺寸與PEG-SPIONs大小一致。
[0079] 水動(dòng)力尺寸（DLS hydrodynamic diameter)-般大于TEM尺寸，其原因在于PEG-SPIONs的粒徑大小包括了表面修飾層及其水化層的厚度。由表1可知，PEG-SPIONs的DLS尺 寸大于TEM尺寸，說(shuō)明該P(yáng)EG-SPIONs探針?biāo)瘜虞^厚，顆粒穩(wěn)定性較好。EGFl多肽偶聯(lián)PEG-SPIONs后，得到的EGFl-PEG-SPIONs的DLS尺寸有一定程度的增大，說(shuō)明EGFl多肽與PEG-SPIONs偶聯(lián)成功。由表1可知，EGFl-PEG-SPIONs的水動(dòng)力尺寸大于PEG-SPIONs，同樣說(shuō)明 EGFl多肽成功偶聯(lián)PEG-SPIONs。
[0080] 此外，由表1可知，EGFI-PEG-SPI ONs的Ze ta電位相對(duì)于PEG-SPI ONs的發(fā)生了變化， 也就表明EGFl-PEG-SPIONs的EGFl多肽偶聯(lián)成功。
[0081 ] (3)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)EGFl多肽與PEG-SPIONs的偶聯(lián)情況 [0082] 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分別檢測(cè)EGFl-PEG-SPI0Ns、EGFl多肽、PEG-SPIONs、 EGFl多肽和PEG-SPIONs混合液的電泳情況，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知（圖中1表示樣 品為EGFl-PEG-SPI0Ns、2 為EGFl多肽、3 為 PEG-SPIONs、4 為EGFl多肽和 PEG-SPIONs 的混合 液，2、3和4均為對(duì)照），EGFl-PEG-SPIONs在聚丙烯酰胺凝膠有一定的迀移，EGFl多基本未發(fā) 生迀移，說(shuō)明EGFl-PEG-SPIONs的EGFl多肽成功偶聯(lián)上PEG-SPIONs。
[0083] 實(shí)施例2
[0084] 制備El多肽
[0085]采用化學(xué)合成法合成El多肽或E2多肽或E3多肽，其中El多肽的氨基酸序列：116_ Cys-Phe-Cys-Leu-Pro ;E2 多肽的氨基酸序列：Ser-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly ;E3 多肽的氨基酸 序列：Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln。將凍干El多肽或E2多肽或E3多肽、保存于-20 °C。以下以 E1多肽為例說(shuō)明制備E1多肽偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒(EI-PEG-SPI ONs)的制備方 法。制備E2多肽偶聯(lián)的超超順磁性氧化鐵納米顆粒(E2-PEG-SPIONs)或E3多肽偶聯(lián)的超順 磁性氧化鐵納米顆粒(E3-PEG-SPIONs)的方法原理與制備El-PEG-SPIONs的方法原理一致。
[0086]制備超順磁性氧化鐵納米顆粒
[0087]采用高溫?zé)峤夥?，以鐵鹽為原料例如是FeC13和FeC12,制得SPIONs;再用羧基化 PEG對(duì)其進(jìn)行表面修飾，轉(zhuǎn)移到水相后，得到PEG-SPIONs的膠體溶液。當(dāng)然，該膠體溶液也可 在市面上直接購(gòu)買(mǎi)。
[0088] 偶聯(lián)
[0089]首先，將5mg的膠體溶液分散于5mL MES緩沖液中，得到PEG-SPIONs分散均勻的分 散液。其中，MES緩沖液PH為6。
[0090] 然后，往上述分散液中加入過(guò)量的0.5mL EDC(濃度為10mg/mL)和ImL NHS(濃度為 10mg/mL)，在80rpm/min的搖床上、4°C，活化反應(yīng)30min。
[0091] 再然后，將進(jìn)行活化反應(yīng)后的分散液轉(zhuǎn)移到超濾離心管（孔徑30KD)中，在 5000rpm/min、4°C條件下離心30min，去除未參與活化反應(yīng)的EDC和NHS。
[0092] 接著，往超濾離心后的分散液中加入2.5mg El多肽，在80rpm/min、4°C條件下進(jìn)行 偶聯(lián)反應(yīng)12小時(shí)。
[0093]再接著，將反應(yīng)結(jié)束后的分散液再次轉(zhuǎn)移到新的超濾離心管中（孔徑30KD)，在 5000rpm/min、4°C條件下離心30min，濾去沒(méi)有偶聯(lián)上的El多肽。收集濾液，該濾液即含有 EI-PEG-SPIONs，即靶向多肽納米探針。EI-PEG-SPIONs的結(jié)構(gòu)模式圖如圖1所示。保存濾液， 并對(duì)該El-PEG-SPIONs進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。相應(yīng)地，也可以得到E2-El-PEG-SPI0Ns或E3-PEG-SPIONso
[0094] 對(duì)El-PEG-SPIONs的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如下。
[0095] (1)偶聯(lián)效率
[0096]采用BCA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，在紫外分光光度計(jì)(SMMADZU，UV-3600)檢 測(cè)濾液中所含多肽的量。結(jié)果顯示，Img SPIONs與0.5mg El多肽偶聯(lián)。
[0097] (2)El-PEG_SPI0Ns 的電鏡觀察
[0098] 利用透射電子顯微鏡（TEM，Tokyo, JE0L2100)觀察El-PEG-SPIONs，結(jié)果如圖4所 不。
[0099]由圖4可知，在透射電鏡觀察下，El-PEG-SPIONs顆粒大小均勻、外觀圓整，粒徑增 大。
[0100] (3)El-PEG-SPI0Ns 磁飽和強(qiáng)度
[0101] 利用磁強(qiáng)振動(dòng)計(jì)對(duì)El-PEG-SPIONs進(jìn)行磁飽和強(qiáng)度檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。
[0102]由圖5可知，El-PEG-SPIONs能夠適用于磁共振成像，可適用于作為特異性靶向動(dòng) 脈粥樣斑塊的造影劑。
[0103] (4)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)El多肽與PEG-SPIONs的偶聯(lián)情況
[0104] 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分別檢測(cè)El-PEG-SPI0Ns、El多肽、PEG_SPI0Ns、El多肽 和PEG-SPIONs混合液的電泳情況，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
[0105] 由圖6可知（圖中1表示樣品為El-PEG-SPI0Ns、2為El多肽、3為PEG-SPI0Ns、4為El 多肽和PEG-SPIONs的混合液，2、3和4均為對(duì)照），El-PEG-SPIONs在聚丙烯酰胺凝膠有一定 的迀移，El多肽未發(fā)生迀移，說(shuō)明El-PEG-SPIONs的El多肽成功偶聯(lián)上PEG-SPIONs。
[0106] 實(shí)施例3
[0107] 采用本發(fā)明實(shí)施例提供的EGFl-PEG-SPIONs進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的造影過(guò)程和結(jié)果如 下。
[0108] (1)不同濃度PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs的MRI成像和弛豫率r2的測(cè)量計(jì)算
[0109] 將濃度范圍從2、4、6、8到 10yg/mL的 PEG-SPIONs 和 EGFl-PEG-SPIONs分別置于 96 孔 板中進(jìn)行磁共振成像。采用Bruker Biospec 7.OT小動(dòng)物磁共振成像儀，對(duì)其進(jìn)行T2自旋回 波多層脈沖序列掃描，掃描參數(shù)如下：F0V = 4.5/3.5cm，TR = 3000.0 ms，TE = 12，24，36，48， 60ms，F(xiàn)A= 180 · Odeg，層厚1.0/1.0mm。通過(guò)Bruker Biospec自帶工作站分析上述圖像數(shù)據(jù) 并計(jì)算各個(gè)濃度PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs組的T2弛豫時(shí)間。以鐵濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì) 應(yīng)的T2弛豫時(shí)間倒數(shù)（R 2 = I/T2)為縱坐標(biāo)作圖，繪制出不同濃度的PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs的濃度-弛豫強(qiáng)度曲線，所得直線的斜率即為該樣品的弛豫率。
[0110] 結(jié)果如圖7和圖8所示，將濃度范圍從2、4、6、8到10yg/mL的PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs進(jìn)行磁共振成像，發(fā)現(xiàn)兩組溶液均能明顯降低水的T2信號(hào)，并且隨著溶液濃度 增加信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低，即圖像灰度逐漸變暗，且EGFl-PEG-SPIONs組比PEG-SPIONs組信號(hào) 強(qiáng)度減低更為明顯（如圖7所示）。然后分別測(cè)量PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs在各個(gè)濃度 下的T2值，并繪制出不同濃度的PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs的濃度-弛豫強(qiáng)度曲線（如 圖8所示），從曲線上可以看出，PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs的濃度和弛豫時(shí)間呈線性關(guān) 系，隨著樣品濃度增大，其R 2也增大。根據(jù)計(jì)算得到PEG-SPIONs的弛豫率^為174.6πιΜΛ一1， EGFl-PEG-SPIONs的弛豫率r 2為216 JmT1S'由此可知，EGFl-PEG-SPIONs比PEG-SPIONs的 弛豫率更高，有更好的負(fù)性對(duì)比增強(qiáng)效果。（弛豫率r 2是反映MRI對(duì)比劑對(duì)T2弛豫過(guò)程速率 的影響程度，一種順磁性物質(zhì)的弛豫率越大，則表明其縮短質(zhì)子弛豫時(shí)間的能力就越強(qiáng)，在 MRI上造成組織間的信號(hào)對(duì)比就越大，負(fù)性增強(qiáng)效果也就越明顯，那么這種物質(zhì)就越適合用 作MRI的陰性對(duì)比劑。）
[0111] (2)EGFl-PEG-SPI0Ns用于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的MRI成像
[0112] 首先，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立
[0113] 動(dòng)物模型建立:ApoE-/-小鼠（購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，6周齡，雄 性，合格證號(hào)為SCXK(京）2014-0004)，前期通過(guò)高脂飲食(Western Diet for Rodents-5TJN, TestDiet)喂養(yǎng)。
[0114] 病理檢測(cè)：
[0115] ①常規(guī)HE染色：取16周造模小鼠處死，分離主動(dòng)脈，新鮮組織固定于4%多聚甲醛 24h以上，脫水、石蠟包埋、切片;石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I20min-二甲苯 112〇111丨11-無(wú)水乙醇11〇111丨11-無(wú)水乙醇111〇111丨11-95%酒精5111丨11-90%酒精5111丨11-80%酒精 5min-70%酒精5min-蒸餾水洗;蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min，自來(lái)水 洗，1 %的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗;伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片 入伊紅染液中染色l-3min;脫水封片:將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5min-95%酒精I(xiàn)I 5min-無(wú)水乙醇I5min_無(wú)水乙醇Π 5min_二甲苯I5min_二甲苯Π 5min中脫水透明，將切片從二甲 苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。
[0116] ②冰凍切片油紅0染色:取16周造模小鼠處死，分離主動(dòng)脈，新鮮組織固定于4%多 聚甲醛24h以上，脫水、OCT包埋、切片-20°保存；固定:將冰凍切片復(fù)溫干燥IOmin;細(xì)胞爬片 4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗3次，5min/次;染色:入油紅O工作液孵育10-15min;細(xì)胞爬 片破膜l〇_15min，PBS漂洗3次，5min/次，入油紅O工作液37°染色1-2h;分化:75 %酒精分化 2s，水洗Imin;復(fù)染細(xì)胞核:Harr is蘇木素復(fù)染l-2min左右，自來(lái)水洗，1 %的鹽酸酒精分化 數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗;封片：用紙巾吸去周邊水分，甘油明膠封片。
[0117] ③冰凍切片免疫組化檢測(cè)斑塊部位TF表達(dá)：冰凍切片置于4 %多聚甲醛固定 15min，于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min;組織切片置于盛滿EDTA抗原 修復(fù)緩沖液（PH9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后將玻片置于PBS (PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min;阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:切片放入3%過(guò) 氧化氫溶液，室溫避光孵育25min，將玻片置于PBS (PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每 次5min;切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA或 者10 %正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min;輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一 定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜;玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上 晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加組化試劑盒內(nèi)與一抗相應(yīng)種屬的二抗 (HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50min;玻片置于I 3BS (PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次， 每次5min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，自來(lái)水沖洗切片終止顯色;復(fù) 染細(xì)胞核:Harri s蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1 %的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗， 氨水返藍(lán)，流水沖洗;脫水封片:將切片依次放入75 %酒精6min-85 %酒精6min-無(wú)水乙醇I 6min_無(wú)水乙醇Π 6min_二甲苯I5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍瞭干，中性樹(shù)膠 封片。
[0118] 結(jié)果如圖9~圖11所示，造模小鼠主動(dòng)脈竇部血管切片HE染色（如圖9所示，圖中箭 頭所示造模小鼠主動(dòng)脈斑塊部位)和油紅〇染色（如圖10所示，圖中箭頭所示造模小鼠主動(dòng) 脈斑塊部位)清楚顯示主動(dòng)脈竇部已有斑塊形成，表明已成功構(gòu)建了 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣 硬化模型;主動(dòng)脈竇部免疫組化SP法(如圖11所示，圖中箭頭所示造模小鼠主動(dòng)脈斑塊部位 TF表達(dá))可清楚顯示斑塊處TF高表達(dá)。
[0119] 然后，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的MRI成像
[0120]材料:Bruker Biospec 7.OT小動(dòng)物磁共振成像儀，小動(dòng)物心電監(jiān)護(hù)儀，小動(dòng)物吸 入式氣體麻醉機(jī)，異氟烷，PEG-SPIONs和EGFl-PEG-SPIONs納米粒，16周動(dòng)脈粥樣硬化造模 小鼠，移液器，注射器。
[0121 ]動(dòng)物麻醉:小鼠連接心電監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測(cè)呼吸心率，通過(guò)小動(dòng)物吸入式氣體麻醉機(jī)調(diào) 整異氟烷的濃度進(jìn)行麻醉，維持呼吸心率在正常范圍內(nèi)。
[0122] MRI掃描：由于偶聯(lián)EGFl的超順磁性氧化鐵納米顆粒主要影響組織的T2弛豫時(shí)間， 因此采用T2序列掃描，掃描參數(shù)如下：FOV = 3.00cm，TR = 3000 .Oms，TE = 36ms，F(xiàn)A = 180 · Odeg，層厚 0 · 80/0 · 80mm。
[0123] 以動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠分別尾靜脈注射EGFl-PEG-SPIONs溶液的為實(shí)驗(yàn)組，以 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠分別尾靜脈注射PEG-SPIONs溶液的為對(duì)照組，兩組的注射鐵量為 12mgFe/kg，在2分鐘內(nèi)注射完畢。分別在注射前、剛注射完、注射后30min、注射后Ih、注射后 2h、注射后4h和注射后24h重復(fù)進(jìn)行T2WI掃描，觀察腹主動(dòng)脈斑塊部位的信號(hào)變化。掃描完 畢分別測(cè)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組感興趣區(qū)（ROI)的T2WI圖像信號(hào)強(qiáng)度（Signal Intensity，SI) 值，ROI放在腹主動(dòng)脈上，相同面積測(cè)量3次，取其平均值，用如下公式計(jì)算信號(hào)值的變化率： (^1 = (51_-51[)。^)/51[^*100%(51[^和51 [)。^分別代表注射前后腹主動(dòng)脈斑塊部位的信號(hào) 值)。
[0124] 結(jié)果圖12所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別注射EGFl-PEG-SPIONs和PEG-SPIONs后重復(fù) T2WI掃描，圖像結(jié)果顯示：注射前可清楚看到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組斑塊處高信號(hào)影，在注射 EGFl-TOG-SPIONs完后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹主動(dòng)脈粥樣斑塊處隨即出現(xiàn)信號(hào)減低區(qū)，掃描至 3〇 1^11、111、211、411圖像仍可見(jiàn)信號(hào)減低區(qū)，且較前范圍擴(kuò)大，甚至整個(gè)血管壁信號(hào)均明顯減 低;而對(duì)照組小鼠在注射和PEG-SPIONs后雖也有信號(hào)減低，但信號(hào)減低不如實(shí)驗(yàn)組明顯;此 外，24h后實(shí)驗(yàn)組斑塊處仍有信號(hào)減低影，而對(duì)照組斑塊處已基本沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的信號(hào)減 低。由此說(shuō)明EGFl-PEG-SPIONs對(duì)粥樣斑塊具有特異性的靶向作用，且能在斑塊處停留較長(zhǎng) 時(shí)間，有助于粥樣斑塊的特異性成像。
[0125] 接著，掃描后組織普魯士藍(lán)染色
[0126] 方法：取掃描后小鼠處死，分離主動(dòng)脈，新鮮組織固定于4%多聚甲醛24h以上，脫 水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水;取等量2 %亞鐵氫化鉀和2 %鹽酸等比例混合，切片入染液中 染色10-20min;流水沖洗2min，蒸餾水洗;0.1 %核固紅復(fù)染核5-10min，蒸餾水洗數(shù)分鐘;將 切片依次放入95%酒精1511^11-95%酒精1151^11-無(wú)水乙醇151^11-無(wú)水乙醇1151^11-二甲 苯15min-二甲苯Π 5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍瞭干，中性樹(shù)膠封片。
[0127] 結(jié)果如圖13和圖14所示，實(shí)驗(yàn)組注射EGFI-PEG-SPI ONs掃描后，心臟瓣膜區(qū)可見(jiàn)大 量染色顆粒(如圖13所示，圖中箭頭所示染色顆粒），即為EGF卜PEG-SPIONs所在區(qū)域，斑塊 處均有納米顆粒分布;而對(duì)照組注射PEG-SPIONs掃描后，心臟瓣膜區(qū)只有極少量染色顆粒 (如圖14所示，圖中箭頭所示染色顆粒）。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組斑塊處的納米顆粒的沉積明顯高于對(duì) 照組，由此表明EGFl -PEG-SPIONs對(duì)粥樣斑塊具有特異性的靶向作用。
[0128] 實(shí)施例4
[0129] 將實(shí)施例1和2方法制備的靶向多肽納米探針作為針對(duì)脈粥樣斑塊部位成像的造 影劑，直接應(yīng)用注射到活體內(nèi)，然后進(jìn)行磁共振成像。該靶向多肽納米探針可特異性靶向動(dòng) 脈粥樣斑塊部位，通過(guò)磁共振檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活體內(nèi)發(fā) 生以及發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程，為早期預(yù)防、診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供了更為全 面的分子信息。
[0130]綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例提供靶向多肽納米探針的制備方法能夠成功將EGFl多肽 或El多肽偶聯(lián)在PEG-SPIONs上，制得具有靶向動(dòng)脈粥樣斑塊的靶向多肽納米探針，即EGFl-PEG-SPIONs或El-PEG-SPIONs。該兩種靶向多肽納米探針能夠適用于靶向動(dòng)脈粥樣斑塊的 磁共振成像，通過(guò)其特異性的靶向能力，能夠準(zhǔn)確反映動(dòng)脈粥樣斑塊在活體內(nèi)發(fā)生以及發(fā) 展的分子生物學(xué)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣斑塊的精確可視化監(jiān)測(cè)，為早期預(yù)防、診斷和治療動(dòng) 脈粥樣硬化疾病提供了更為全面的分子信息。此外，當(dāng)然任何組織發(fā)生病理改變時(shí)如某些 腫瘤的血管新生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中只要其高表達(dá)TF，該探針就可適用于該病變組織的磁共振成 像，為采用有效地治療方案提供可靠的分子信息。
[0131]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向多肽納米探針，其特征在于，其由超順磁性氧化鐵納米顆粒經(jīng)偶聯(lián)劑進(jìn)行 表面修飾后，再與多肽偶聯(lián)得到，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向多肽納米探針，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為羧基化的聚乙 二醇。3. -種靶向多肽納米探針的制備方法，其特征在于，其包括： 制備超順磁性氧化鐵納米顆粒的膠體溶液，其中，超順磁性氧化鐵納米顆粒經(jīng)偶聯(lián)劑 表面修飾； 制備多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO. 3所示或如SEQ ID NO.4所示；以及 將所述多肽與所述膠體溶液混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在所述偶聯(lián)反應(yīng)之前，還包括:將所述 膠體溶液分散于MES緩沖液中，得到分散液，所述MES緩沖液的pH為5.8~6.2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述膠體溶液與所述MES緩沖液的質(zhì) 量體積比為0.8~1.2:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，還包括:往所述分散液中加入1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，進(jìn)行活化反應(yīng)，所述活化 反應(yīng)在轉(zhuǎn)速80~100rpm/min、4°C條件下反應(yīng)30~45min。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為羧基化的聚乙二醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述多肽與所述膠體溶液的質(zhì)量比為 0 · 5~0 · 6:1 〇9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述偶聯(lián)反應(yīng)在轉(zhuǎn)速80~lOOrpm/ min、4°C條件下反應(yīng)12~16小時(shí)。10. -種如權(quán)利要求1或2所述的靶向多肽納米探針在制備用于動(dòng)脈粥樣斑塊成像造影 劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/14GK105963719SQ201610268526
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】胡豫, 梅恒, 魏求哲
【申請(qǐng)人】華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院