親水活性化合物的納米包封的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種包含水溶性蛋白質(zhì)、葡聚糖和親水活性劑的納米顆粒，所述葡聚糖由偏磷酸鹽至少部分交聯(lián)。
【專利說明】
親水活性化合物的納米包封
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一般地涉及包含親水活性化合物的納米顆粒和用于它們的制備的納米包 封方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 大部分肽和蛋白質(zhì)藥物仍然通過每日注射施用，因此伴隨有依從性問題、疼痛相 關(guān)的問題和對患者的嚴(yán)重不便利。因此，需要用于這樣的藥物的延長的可注射的遞送系統(tǒng) 或非-侵入性遞送系統(tǒng)。
[0004] 口服途徑提供了高患者接受度和依從性的自身給藥的優(yōu)勢。
[0005] 肽和蛋白質(zhì)的口服和可注射的延長的釋放遞送仍是富有挑戰(zhàn)的并且一直是需要 每日施用的腸胃外常規(guī)遞送的最有吸引力的代替。盡管在過去二十年間投入大量努力，由 于與這些親水大分子較差的腸膜滲透性、有限的口服生物利用度、在腸內(nèi)的不穩(wěn)定性和廣 泛的快速代謝相關(guān)的一些缺點(diǎn)和障礙，沒有出現(xiàn)用于親水的有效的大分子的口服遞送的可 行的解決方案。
[0006] 出于開發(fā)具有顯著的生物利用度的口服蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的目的，可以采用三種方 法：
[0007] (a)大分子的物理化學(xué)性質(zhì)的改性；
[0008] (b)大分子的新的官能化;或者
[0009] (C)使用經(jīng)由納米載體的改進(jìn)的載物遞送(cargo delivery)。
[0010] 然而，無論哪種方法，保持蛋白質(zhì)的初始生物學(xué)活性是必要的?？诜f送系統(tǒng)將需 要顯著地提高此類大分子的腸膜滲透性，以取得被考慮進(jìn)行進(jìn)一步臨床試驗(yàn)的可能性的機(jī) 會(huì)。已經(jīng)使用一些納米顆粒遞送系統(tǒng)和微米顆粒遞送系統(tǒng)來改善親水大分子的口服吸收并 且表現(xiàn)出有前景的結(jié)果，但仍受腸吸收和藥物穩(wěn)定性保護(hù)的限制。
[0011]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)納米尺寸的系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、脂質(zhì)和聚合物納米顆粒、膠束等）比用于 蛋白質(zhì)遞送的傳統(tǒng)制劑有利。預(yù)計(jì)生物技術(shù)藥物將在不久的將來成為治療劑的主要來源 [1]。然而，此類分子的治療性利用依賴于開發(fā)能夠令人滿意地克服其使用的內(nèi)在限制（即 低口服生物利用度和生物學(xué)和物理化學(xué)不穩(wěn)定性)的適當(dāng)?shù)闹苿┑目赡苄?。然而，由于它?的蛋白質(zhì)水解不穩(wěn)定性和有限的穿過生物屏障的能力，蛋白質(zhì)藥物的口服施用遇到許多障 礙?；谥|(zhì)體和膠束的遞送系統(tǒng)在腸腔中不穩(wěn)定，并且不能對敏感的大分子產(chǎn)生足夠的 保護(hù)。
[0012] 因此，在藥物制劑中，已經(jīng)成功地探索了納米顆粒用于肽類藥物的藥物遞送[2- 4]。納米顆粒，更具體地，可生物降解的聚合物納米顆粒，具有優(yōu)異的組織生物相容性、可生 物降解性、組成靈活性和小尺寸，使它們適用于多種應(yīng)用。此外，這些制劑表現(xiàn)出在口服施 用后提高藥物生物利用度[5]。
[0013] 盡管用可生物降解的聚合物包封很吸引人，但是對于親水大分子而言，制造工藝 仍然是復(fù)雜且昂貴的。在將蛋白質(zhì)藥物有效包封進(jìn)這些系統(tǒng)的方法的情況中，使用聚合物 包封可以提供(a)在儲(chǔ)存和遞送期間保護(hù)蛋白質(zhì)免于降解和(b)當(dāng)需要時(shí)的持續(xù)釋放特性
[6-8]ο
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[0024] 發(fā)明概述
[0025] 本發(fā)明提供了用于保護(hù)和控制肽類藥物釋放的親水生物大分子的納米包封。此新 的策略允許負(fù)載于納米顆粒內(nèi)的小肽類藥物種類的受控的釋放，而不是當(dāng)在聚合物的混合 物中微米包封時(shí)溶解的藥物在黏膜附近釋放，或可選擇地，當(dāng)使用已經(jīng)描述的納米噴霧干 燥技術(shù)雙重納米包封時(shí)，在腸胃外施用后溶解的藥物在黏膜附近釋放[9]。此類包封在口服 施用的情況中提供使敏感的大分子免于酸性環(huán)境以及無論施用途徑如何，免于被蛋白水解 酶降解的保護(hù)。
[0026] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含水溶性蛋白質(zhì)、葡聚糖和親水活性劑的納 米顆粒，所述葡聚糖由偏磷酸鹽至少部分交聯(lián)。
[0027] 如本文使用的，本發(fā)明的"納米顆粒"是一種顆粒物，為納米膠囊(NC)或納米球 (NS)，其是生物相容的并足夠耐化學(xué)和/或物理破壞，這樣使得足夠量的納米顆粒在施用至 人或動(dòng)物體內(nèi)后基本上保持完整并持續(xù)足夠的時(shí)間以能夠到達(dá)期望的靶組織(器官）。通 常，納米顆粒是球形的形狀，具有最高700nm的平均直徑。在顆粒的形狀不是球形的情況下， 直徑指的是顆粒的最長的尺寸。
[0028] 根據(jù)與親水活性劑相關(guān)的各種參數(shù)(例如，溶解度、分子量、極性、電荷、反應(yīng)性、化 學(xué)穩(wěn)定性、生物活性及其它），試劑可以包含于(包封于)所述納米顆粒中，和/或嵌在制成納 米顆粒的基質(zhì)中。對于所選擇的應(yīng)用，納米顆粒可以因此呈核/殼的形式(在下文中還被叫 作納米膠囊），具有聚合物殼和包含至少一種親水活性劑的核。
[0029]可選擇地，納米顆粒可以是基本均勻的、不具有明顯的核/殼結(jié)構(gòu)特征的組合物。 在本文中，這些納米顆粒指的是納米球(NS)。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，納米顆粒選自納米球和納米膠囊。
[0031] 在其他實(shí)施方案中，平均直徑在約IOOnm和200nm之間。在其他實(shí)施方案中，平均直 徑在約200nm和300nm之間。在另外的實(shí)施方案中，平均直徑在約300nm和400nm之間，平均直 徑在400nm和500nm之間。在另外的實(shí)施方案中，平均直徑在約600nm和700nm之間。
[0032] 在一些其他實(shí)施方案中，平均直徑在約50nm和700nm之間。在其他實(shí)施方案中，平 均直徑在約50nm和500nm之間。在其他實(shí)施方案中，平均直徑在約50nm和400nm之間。在另外 的實(shí)施方案中，平均直徑在約50nm和300nm之間。在另外的實(shí)施方案中，平均直徑在約50nm 和200nm之間。在另外的實(shí)施方案中，平均直徑在約50nm和IOOnm之間。
[0033] 納米顆粒的每一個(gè)可以基本上具有相同的形狀和/或尺寸。在一些實(shí)施方案中，納 米顆粒具有這樣的直徑分布，使得不超過〇. 01 %至10 %的顆粒具有大于以上提及的平均直 徑之上10%或小于平均直徑之下10%的直徑，并且在一些實(shí)施方案中，使得不超過0.1%、 0·2%、0·4%、0·6%、0·8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或 9%的納米顆粒具有大 于上述提及的平均直徑之上10%或小于平均直徑之下10%的直徑。
[0034] "水溶性蛋白質(zhì)"是一種屬于具有允許與溶解介質(zhì)（即水)形成偶極子-偶極子相互 作用、使蛋白質(zhì)可溶于水的結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以是線性的，或具有球狀結(jié)構(gòu)（即， 具有球狀四級結(jié)構(gòu)，其中疏水氨基酸被定向?yàn)槌蚪Y(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，而親水氨基酸被定向?yàn)槌?向外側(cè)）。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，水溶性蛋白質(zhì)是白蛋白。
[0036] 在其它實(shí)施方案中，白蛋白可以選自人血清白蛋白（HSA)和牛血清白蛋白（BSA)。
[0037] 如本文使用的，"葡聚糖"意指包括由糖苷鍵連接在一起的糖單體的多糖。葡聚糖 可以是或葡聚糖，并且可以是天然的、合成的或半合成來源的。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，葡聚糖是α-葡聚糖。
[0039] 該至少一種葡聚糖可以是兩種或更多種葡聚糖的組合(例如，混合物）。該至少一 種葡聚糖可以是本領(lǐng)域已知的一種或更多種葡聚糖。該至少一種葡聚糖的非限制性實(shí)例為 氧化的纖維素、普魯蘭糖(pullulan)、淀粉、糖原、右旋糖酐、地衣多糖、甘露聚糖、半乳甘露 聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖(galacton)及其任何衍生物。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，該至少一種葡聚糖是右旋糖酐。
[00411在其他實(shí)施方案中，葡聚糖可以具有在約5KDa(千道爾頓）和2000KDa之間的分子 量。
[0042]在本發(fā)明的納米顆粒中，葡聚糖是"至少部分交聯(lián)的"；至少一些葡聚糖分子經(jīng)由 交聯(lián)劑相互連接以形成三維結(jié)構(gòu)。葡聚糖可以是至少1%交聯(lián)的（即，葡聚糖的全部-OH基團(tuán) 的1 %與交聯(lián)劑鍵合），至少2 %交聯(lián)的，至少5 %交聯(lián)的，至少10 %交聯(lián)的，至少20 %交聯(lián)的， 或甚至至少30%交聯(lián)的。
[0043]交聯(lián)可以由任何已知的交聯(lián)劑進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)通過使用偏磷酸鹽 實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)可以通過使用交聯(lián)劑的組合實(shí)現(xiàn)，其至少一種是偏磷酸鹽試 劑。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，一種或更多種偏磷酸鹽被用作交聯(lián)劑以至少部分地交聯(lián)葡聚 糖。術(shù)語"偏磷酸鹽"意指包括具有經(jīng)驗(yàn)式P〇3_的含氧陰離子，并且可以被描述為具有由PO 4 結(jié)構(gòu)單元組成的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，偏磷酸鹽選自三偏磷酸鈉（STMP)、三磷酸五鈉 (STPP)和氯化氧磷(POCl 3)。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，偏磷酸鹽是三偏磷酸鈉(STMP)，其具有以下式：
[0046]
[0047] 不希望囿于理論，STMP僅與葡聚糖的羥基(-OH)基團(tuán)反應(yīng)。與用于類似的系統(tǒng)的典 型的交聯(lián)劑諸如戊二醛不同，STMP不與-NH 2基團(tuán)結(jié)合。從而防止由于不期望的結(jié)合所致的 親水活性劑活性的妨礙，同時(shí)保持用作活性化合物的載體和/或保護(hù)容器的交聯(lián)的納米顆 粒的形成。因此，交聯(lián)的葡聚糖形成用于攜帶蛋白質(zhì)（即白蛋白）的特定結(jié)構(gòu);而蛋白質(zhì)繼而 來充當(dāng)親水活性劑載體和保護(hù)層。
[0048] 在一些實(shí)施方案中，葡聚糖(例如，右旋糖酐)和偏磷酸鹽(例如，STMP)之間的比在 1:10和3:4(w/w)之間。在其他實(shí)施方案中，此比可以為1: 1、1:2、1:4、1:10、2:1和3:4(w/w) 的葡聚糖(例如，右旋糖酐)比偏磷酸鹽(例如，STMP)。
[0049] 如上所述，本發(fā)明的納米顆粒還包括至少一種"親水活性劑"。親水活性劑可以在 用于在受試者(人或非人）中治療或預(yù)防疾病或紊亂的活性親水藥物中選擇。活性藥物可以 以非限制性的方式選自，維生素、蛋白質(zhì)、抗氧化劑、肽、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、激素、抗 體、單克隆抗體、疫苗、預(yù)防劑、診斷劑、造影劑、核酸、營養(yǎng)劑、分子量小于約l，〇〇〇Da或小于 約500Da的小分子、電解質(zhì)、藥物、免疫劑和前述的任何組合。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，親水活性劑可以在激素中選擇。
[0051]在一些實(shí)施方案中，親水活性劑選自胰島素、艾塞那肽(exenatide)、生長激素(例 如，生長素 （somatotropin ))、醋酸奧曲肽、醋酸蘭瑞肽、goserol inacetate、copaxone、依那 西普或單克隆抗體，諸如西妥昔單抗、曲妥珠單抗、阿達(dá)木單抗、貝伐單抗和其他。
[0052] 在一些實(shí)施方案中，親水活性劑具有-NH2末端部分或-NH2懸掛部分。由于STMP不與 此類親水活性劑的-NH2基團(tuán)反應(yīng)，在交聯(lián)過程期間在STMP和活性劑之間不發(fā)生交聯(lián)或任何 化學(xué)反應(yīng)。這導(dǎo)致活性劑包封于納米顆粒內(nèi)，而不破壞或影響其活性和/或結(jié)構(gòu)。
[0053]本發(fā)明的納米顆?？梢员挥米鬟f送媒介物，所述遞送媒介物用于將寬范圍的親水 活性劑局部地、經(jīng)眼地、經(jīng)口地、通過吸入、經(jīng)鼻地或胃腸外地遞送至循環(huán)系統(tǒng)。本發(fā)明的納 米顆粒遞送系統(tǒng)有利于靶向的藥物遞送和受控的釋放應(yīng)用，還由于清除率的降低提高在作 用位點(diǎn)的藥物生物利用度、降低給藥頻率和最小化副作用。本發(fā)明的納米顆粒可以以干粉 的形式使用（以原樣施用，例如，用于可吸入的組合物），或可以在水性介質(zhì)中重構(gòu)以形成可 注射的制劑。
[0054]當(dāng)需要時(shí)，為了提供活性化合物抗不同環(huán)境的另外的保護(hù)和穩(wěn)定，本發(fā)明的納米 顆?？梢赃M(jìn)一步被包封成更大的顆粒，即，用于胃腸外施用的納米膠囊或用于口服施用的 微米顆粒。
[0055]因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包含疏水聚合物和多個(gè)如本文 定義的本發(fā)明的納米顆粒的載體，所述多個(gè)納米顆粒(i)被疏水聚合物例如PLGA包封(即形 成雙層納米包封）；或（ii)被嵌入在基質(zhì)中，諸如由疏水聚合物混合物形成的基質(zhì)。此類聚 合物混合物可以是Eudragi t: HPMC混合物，其中Eudragi t具有依賴pH的溶解度，而無論pH如 何HPMC是水溶的。
[0056] 此類進(jìn)一步包封可以導(dǎo)致包含納米顆粒的多種結(jié)構(gòu)。例如，當(dāng)納米顆粒是納米球 時(shí)，疏水聚合物可以通過形成外殼包封納米球，即，形成包括納米球的納米膠囊(一級NS于 二級NC中）?？蛇x擇地，疏水聚合物可以呈納米球被嵌入在其中的基質(zhì)的形式(一級NS于二 級微米球中）。
[0057]類似地，當(dāng)納米顆粒是納米膠囊時(shí)，疏水聚合物可以包封納米膠囊(一級NC于二級 NC中），或可以呈基質(zhì)的形式(一級NC于二級微米球中）。
[0058]在一些實(shí)施方案中，藥物載體可以呈選自納米膠囊、納米球及其混合物的形式。
[0059] 術(shù)語"疏水聚合物"指具有很小或沒有吸收水的傾向的聚合物材料。不希望囿于理 論，此類聚合物充當(dāng)在水性環(huán)境中的親水活性劑的保護(hù)層或遞送基質(zhì)。疏水聚合物還可用 于賦予本發(fā)明的載體緩慢釋放或控制釋放特性，以預(yù)定方式釋放親水活性劑。
[0060] 在一些實(shí)施方案中，疏水聚合物選自聚(乳酸羥基乙酸）（PLGA)、聚甲基-丙烯酸甲 酯(PMMA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚（乳酸）（PLA)、聚(乳酸羥基乙酸共聚物）（PLG)、聚 (丙交酯）、聚羥基乙酸(PGA)和聚(羥基丁酸）。
[0061 ] 在一些實(shí)施方案中，疏水聚合物選自聚(乳酸羥基乙酸）(PLGA)、聚(乳酸）（PLA)和 聚(乳酸羥基乙酸共聚物）(PLG)。
[0062] 載體通常可以是一般的球形的形狀，在一些實(shí)施方案中，具有在約200nm至900nm 之間的直徑。在其他實(shí)施方案中，載體的直徑可以在約200nm和800nm之間、在約200nm和 700nm之間、在約200nm和600nm之間或在200nm和500nm之間。在一些其他實(shí)施方案中，載體 的直徑可以在約300nm和900nm之間、在約400nm和900nm之間、在約500nm和900nm之間、在約 600nm和900nm之間或在約700nm和900nm之間。
[0063] 本發(fā)明的納米顆粒和/或載體可以被配制成藥物組合物。因此，在另一方面，本發(fā) 明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如本文描述的本發(fā)明的納米顆粒和/或載 體。
[0064] 在另一方面，提供了親水活性劑的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括疏水聚合物以及 包封于所述疏水聚合物中的多個(gè)如本文描述的納米顆粒。
[0065] 本發(fā)明的另外的方面提供了親水活性劑的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括形成基質(zhì) 的疏水聚合物以及嵌入在所述基質(zhì)中的多個(gè)如本文描述的納米顆粒。
[0066]本發(fā)明的遞送系統(tǒng)適合于以允許在諸如至少約12小時(shí)內(nèi)，或在一些實(shí)施方案中， 至少約24小時(shí)內(nèi)、至少7天或甚至至少2周的時(shí)間段內(nèi)藥劑的控制釋放的速率來遞送活性 劑。這樣，遞送系統(tǒng)可被用于多種應(yīng)用，諸如，不限于，藥物遞送、基因療法、醫(yī)學(xué)診斷及用于 例如皮膚病理、癌癥、病原體傳播疾病、激素相關(guān)疾病、與器官移植相關(guān)的反應(yīng)副產(chǎn)物及其 他異常的細(xì)胞或組織生長的醫(yī)學(xué)治療。
[0067]納米顆粒和/或載體在藥物組合物中的濃度，可以被選擇以使量是足以遞送期望 有效量的親水活性劑至受試者，并根據(jù)所選擇的特定的施用方式被選擇。如已知的，用于本 文目的的"有效量"可通過如本領(lǐng)域已知的此類考慮事項(xiàng)來確定。量必須是有效的以獲得期 望的治療效果，除其他以外，取決于待治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度和治療方案。通常在合 理設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)(劑量范圍研究）中確定有效量，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何適當(dāng)?shù)?進(jìn)行此類試驗(yàn)以確定有效量。如眾所周知的，有效量取決于多種因素，除其他以外，其在體 內(nèi)的分布概況、多種藥理學(xué)參數(shù)諸如在體內(nèi)的半衰期；取決于不期望的副作用（如果有的 話）；取決于因素諸如年齡和性別以及其他。
[0068] 藥物組合物可以還包含藥學(xué)上可接受的添加劑，所述添加劑可以為，例如媒介物、 佐劑、賦形劑或稀釋劑，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且是公眾容易得到的。應(yīng)注意 到，藥學(xué)上可接受的添加劑對與活性劑化學(xué)惰性的并且在使用條件下不具有有害的副作用 或毒性。此外，組合物可以包含其他標(biāo)準(zhǔn)的添加劑，諸如軟化劑(emollient)、濕潤劑、增稠 劑、乳化劑、中和劑、著色劑、香料、吸收劑(absorber)或填充劑、防腐劑和/或膠凝劑。
[0069] 在一些實(shí)施方案中，藥物組合物適合于所述親水活性劑的局部、口服、吸入、經(jīng)鼻、 透皮、經(jīng)眼或胃腸外施用。在其他實(shí)施方案中，藥物組合物適合于所述親水活性劑的口服施 用。在一些其他實(shí)施方案中，藥物組合物適合于所述親水活性劑通過注射的施用。
[0070] 添加劑的選擇將部分地由特定活性劑以及用于施用組合物的特定方法或遞送系 統(tǒng)確定。
[0071] 適于口服施用的藥物組合物可以由以下組成：（a)液體溶液，諸如溶解于稀釋劑諸 如水、生理鹽水或橙汁中的有效量的化合物；（b)膠囊、小袋、片劑、錠劑(lozenge)和糖錠劑 (troch)，每個(gè)包含預(yù)定量的作為固體或顆粒的活性成分;和（c)粉末;膠囊形式可以是包 含，例如，表面活性劑、潤滑劑和惰性填充劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸鈣和玉米淀粉的一般的 硬殼或軟殼明膠類型。片劑形式可包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻 酸、微晶纖維素、阿拉伯樹膠、明膠、瓜爾膠、膠體二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂 酸鋅、硬脂酸，以及其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、崩解劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào)味劑和 藥理學(xué)上相容的載體中的一種或多種。錠劑形式可包含于調(diào)味劑(通常是蔗糖和阿拉伯樹 膠或黃蓍膠）中的活性成分，以及包含于惰性基質(zhì)(諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠） 中的活性制劑的軟錠劑，除活性成分之外包含如載體的乳劑、凝膠以及類似物，此類載體是 本領(lǐng)域已知的。
[0072] 本發(fā)明的納米顆粒，單獨(dú)地或與其他適當(dāng)?shù)慕M分組合，可以被制成經(jīng)由吸入施用 的氣溶膠制劑。這些氣溶膠制劑可以被放置于加壓的可接受的推進(jìn)劑中，諸如二氯二氟甲 烷、丙烷、氮?dú)饧邦愃莆?。它們也可以被配制為用于非加壓的制劑的藥物，諸如在噴霧器或 霧化器中。
[0073] 適于腸道外施用的組合物包括水性等滲無菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖 劑、抑菌劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn) 定劑和防腐劑的水性無菌懸液。胃腸外制劑通常將在溶液中含有以重量計(jì)約0.5%至約 25%的活性成分。適合的防腐劑和緩沖劑可在此類制劑中使用。為了最小化或消除在注射 部位的刺激，此類組合物可以包含具有約12至約17的親水-親油平衡值(HLB)的一種或更多 種非離子型表面活性劑。此類制劑中表面活性劑的量的范圍為以重量計(jì)約5%至約15%。適 合的表面活性劑包括聚乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯和環(huán)氧乙 烷與通過環(huán)氧丙烷與丙二醇的縮合形成的疏水性基質(zhì)的高分子量加合物。胃腸外制劑可以 存在于單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿和小瓶，并且可以儲(chǔ)存在冷凍干燥(凍干） 條件下，僅需要在即將使用前加入無菌液體載體，例如注射用水。
[0074] 本發(fā)明的組合物可以被制成可注射制劑。對用于可注射組合物的有效藥物載體的 要求是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。
[0075] 如本文使用的，術(shù)語"局部的"指根據(jù)本發(fā)明的組合物直接應(yīng)用在受試者的皮膚 (人或非人的皮膚)的至少一部分上，以在應(yīng)用部位實(shí)現(xiàn)期望的作用，例如，美容作用或治療 作用。
[0076] 本發(fā)明的納米顆粒、載體和/或遞送系統(tǒng)可以在生物相容的水溶液中施用。此溶液 可以包括，但不限于生理鹽水、水或藥學(xué)上可接受的介質(zhì)。
[0077] 可在某一時(shí)間間隔之后以單一的劑量或以重復(fù)一次或幾次的劑量進(jìn)行遞送系統(tǒng) 制劑的施用。適當(dāng)?shù)膭┝靠筛鶕?jù)諸如根據(jù)被治療個(gè)體口授的和直接取決于被治療個(gè)體的治 療上有效的劑量、施用方式、治療劑的獨(dú)特特征及待實(shí)現(xiàn)的特定治療效果的參數(shù)變化。適當(dāng) 的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確立。
[0078] 在一些實(shí)施方案中，遞送系統(tǒng)還可以包封于可生物降解的膠囊中，通常用于口服 施用。在此類實(shí)施方案中，所述可生物降解的膠囊呈腸衣膠囊的形式。
[0079] 在一些其他實(shí)施方案中，遞送系統(tǒng)適用于所述親水活性劑的便利的靶向治療遞送 和控制釋放施用。
[0080] 本發(fā)明的另一方面提供了如本文描述的本發(fā)明的納米顆?；蜉d體用于制備用于 治療疾病、紊亂或慢性狀況的藥物組合物的用途。慢性狀況的非限制性實(shí)例是糖尿病、肥胖 癥、激素缺乏、蛋白質(zhì)缺乏等。由于本發(fā)明的顆粒提供活性劑(例如，激素或蛋白質(zhì)）的延長 的釋放，本發(fā)明的這些納米顆粒的施用可以降低要求的常規(guī)治療的次數(shù)，從而產(chǎn)生改善的 患者的生活質(zhì)量以及提高的患者對治療的依從性。
[0081] 如本文使用的，術(shù)語"治療"或其任何語言的變化形式，指的是施用有效減輕與疾 病相關(guān)的不期望的癥狀的治療量的本發(fā)明的納米顆粒或遞送系統(tǒng)，以在癥狀發(fā)作之前預(yù)防 此類癥狀的表現(xiàn)、減緩疾病的發(fā)展、減緩癥狀的惡化、穩(wěn)定慢性狀況、增強(qiáng)緩解期的開始、減 緩在疾病發(fā)展慢性階段引起的不可逆的損害、延遲所述發(fā)展階段的開始、減輕疾病的嚴(yán)重 程度或治愈疾病、提高存活率或引起更快的恢復(fù)，或防止疾病發(fā)作，或以上兩種或更多種的 組合。
[0082] 在另一方面，提供了用于制備包含水溶性蛋白質(zhì)、葡聚糖和親水活性劑的納米顆 粒的方法，所述葡聚糖由偏磷酸鹽至少部分交聯(lián)，所述方法包括：
[0083]-將有機(jī)溶劑遞送(例如通過注射)至包含第一水性溶液和第二水性溶液的混合物 中，所述第一水性溶液包含所述水溶性蛋白質(zhì)，所述第二水性溶液包含所述親水活性劑;和
[0084]-將所述偏磷酸鹽添加至所述混合物，從而至少部分交聯(lián)的所述葡聚糖用于獲得 所述納米顆粒。
[0085]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0086] -獲得第一水性溶液和第二水性溶液的混合物，所述第一水性溶液包含所述水溶 性蛋白質(zhì)和所述葡聚糖，所述第二水溶液包含所述親水活性劑；
[0087] -將有機(jī)溶劑遞送(例如，注射)至所述混合物;和
[0088] -將所述偏磷酸鹽添加至所述混合物，從而至少部分交聯(lián)所述葡聚糖用于獲得所 述納米顆粒。
[0089] 在另外的實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0090] -將第一水性溶液和第二水性溶液混合以獲得混合物，所述第一水溶液包含所述 水溶性蛋白質(zhì)和所述葡聚糖，所述第二水溶液包含所述親水活性劑；
[0091] -將有機(jī)溶劑遞送(例如，注射)至所述混合物;和
[0092] -將所述偏磷酸鹽添加至所述混合物，從而至少部分交聯(lián)所述葡聚糖用于獲得所 述納米顆粒。
[0093] 在另外的實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑通過注射被遞送至混合物中。
[0094] 附圖簡述
[0095] 為了更好地理解本文公開的主題和為了例示主題可以如何在實(shí)踐中實(shí)施，現(xiàn)在將 參考附圖通過僅非限制性實(shí)例的方式描述實(shí)施方案，在附圖中：
[0096]圖IA是用STMP的右旋糖酐的交聯(lián)機(jī)制的示意性說明；圖IB是交聯(lián)的顆粒的示意性 描繪。
[0097]圖2示出了白蛋白的交聯(lián)反應(yīng)，該交聯(lián)反應(yīng)使白蛋白在水溶液中不溶。
[0098]圖3示出了不同艾塞那肽制劑(FI-V)和Byetta的體重結(jié)果。
[0099]圖4示出了來自使用Byetta的預(yù)實(shí)驗(yàn)的血糖水平。
[0100]圖5示出了來自不同艾塞那肽制劑(FI-V)和Byetta的血糖水平。
[0101] 圖6示出了不同組在不同天的血漿胰島素水平。
[0102] 圖7A示出了不同組在不同天的糖基化血紅蛋白水平；圖7B示出了在10天的治療中 糖基化血紅蛋白水平的總平均值。
[0103] 圖8A-8B代表DX-50NP制劑（圖8A)和DX-150NP制劑（圖8B)的冷凍-TEM圖像。
[0104] 圖 9A-9C 示出了 Glut-IMP 制劑（圖 9A)、DX_5〇MP 制劑（圖 9B)和 DX-I5OMP 制劑（圖 9〇 的XHR-SEM圖像。
[0105] 圖10示出了以20yg/大鼠（56yg/kg)的劑量皮下注射Byetta?和艾塞那肽溶液后和 以50yg/大鼠（對于DEX50和DEX150，分別為165和65yg/kg)的劑量口服施用不同制劑后大鼠 中艾塞那肽的藥物動(dòng)力學(xué)譜。
[0106] 圖IIA-IIC是冷凍-保護(hù)步驟后雙重包封的BSA/胰島素 NP的冷凍斷裂SEM圖像。
[0107] 圖12示出了在禁食條件下皮下施用不同的負(fù)載胰島素的納米顆粒制劑后的血糖 水平(N=3)。
[0108] 圖13示出了在禁食條件下皮下施用不同的負(fù)載h-胰島素的納米顆粒制劑后的血 糖水平(N=3)。
【具體實(shí)施方式】
[0109] 艾塞那肽是合成形式的exendin-4,是在毒蜥(Gila monster)的唾液中發(fā)現(xiàn)的、表 現(xiàn)出與人胰高血糖素樣肽-UGLP-I)相似的生物學(xué)性質(zhì)的激素，人胰高血糖素樣肽-1是葡 萄糖代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)物。腸促胰島素激素，GLP-I和葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽 (GIP)，是在食物攝入后由小腸的L和K內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的。GLP-I和GIP刺激胰島素從胰腺中 的朗格漢斯氏島的辟田胞分泌。盡管在糖尿病狀態(tài)中，僅GLP-I引起胰島素分泌，但它作為糖 尿病的臨床治療是無效的，因?yàn)樗隗w內(nèi)具有非常短的半衰期(幾分鐘）。
[0110]艾塞那肽是一種39個(gè)氨基酸的肽、一種具有葡萄糖調(diào)節(jié)作用的胰島素促分泌劑。 該藥物使用填充筆裝置每天兩次皮下注射。艾塞那肽與GLP-I具有50%氨基酸同源性，與 GLP-I結(jié)構(gòu)上類似并且在體內(nèi)具有更長的半衰期(2.4h)。因此，在哺乳動(dòng)物中測試了它刺激 胰島素分泌和降低血糖的能力，并且發(fā)現(xiàn)它在糖尿病狀態(tài)中有效。在嚙齒動(dòng)物的研究中，也 示出了它增加胰腺中辟田胞的數(shù)目。
[0111] 艾塞那肽快速提高胰島素水平(在施用約10分鐘內(nèi)），胰島素水平基本上經(jīng)過接下 來的1或2個(gè)小時(shí)下降。已經(jīng)證明，艾塞那肽作為用于II型糖尿病患者的輔助療法不能通過 口服抗糖尿病劑實(shí)現(xiàn)血糖控制。餐后服用的一劑藥比餐前服用的一劑藥具有對血糖小得多 的作用。對血糖的作用在6至8小時(shí)后消退。藥物可以以兩種劑量獲得:5yg和10yg。治療經(jīng)常 以5yg劑量開始，如果不利作用不明顯，則增加劑量。根據(jù)制造商，在第一次使用前，自動(dòng)注 射器必須儲(chǔ)存在2°C和8°C之間的冰箱中，然后儲(chǔ)存在2°C和25°C之間的溫度下。因此，在熱 天，應(yīng)當(dāng)將它持續(xù)地冷藏。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，艾塞那肽臨床應(yīng)用中的潛在的缺點(diǎn)是需要頻繁的皮下 注射。SC注射可以在注射部位引起疼痛、副作用和可能的感染，這可能不利地影響患者依從 性。
[0112] 已經(jīng)開發(fā)艾塞那肽的長效釋放形式用于作為每周一次注射劑使用。此持續(xù)釋放制 劑由艾塞那肽和聚(D，L-乳酸-羥基乙酸共聚物）的可注射的微米球組成，聚(D，L-乳酸-羥 基乙酸共聚物)是在可吸收的縫合線和延長釋放藥物方面具有已確定的用途的常見的可生 物降解的聚合物，其允許以受控的速率逐漸遞送藥物。因此，艾塞那肽延長釋放是用于II型 糖尿病的治療的有用的選擇，特別是在其中體重?fù)p失是個(gè)體患者治療（individual patient's management)的重要方面的患者中。然而，它仍然是注射劑并且需要每周注射一 次。
[0113]根據(jù)在動(dòng)物中再生的數(shù)據(jù)外推，艾塞那肽和胰島素是表現(xiàn)出人的低口服生物利用 度(估計(jì)少于2%)的親水生物大分子，這歸因于蛋白水解不穩(wěn)定性和有限的滲透通過生物 膜的能力。
[0114] 在本發(fā)明中，示范了對艾塞那肽和胰島素的親水大分子的包封。第一個(gè)目標(biāo)是將 艾塞那肽以合理的水平包埋于納米顆粒的基質(zhì)中，目的是增加納米顆粒在用于口服施用的 微米顆粒中的負(fù)載，以確保最終粉末化制劑中的藥物含量盡可能的高。
[0115] 本發(fā)明還提供將肽類藥物并入到一級納米膠囊或納米顆粒中，該一級納米膠囊或 納米顆粒被進(jìn)一步嵌入到更大的納米膠囊中，導(dǎo)致雙層包衣的納米顆粒的遞送系統(tǒng)的形 成，該雙層包衣的納米顆粒的遞送系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為保護(hù)肽免于外環(huán)境的有害作用，以用于使 用腸胃外施用途徑的延長釋放。負(fù)載肽的一級納米膠囊被包封于更大的二級納米膠囊中。 應(yīng)注意，在具有直徑為400nm或600nm的納米膠囊中，基于體積計(jì)算，理論上可能分別并入至 少64個(gè)和216個(gè)直徑IOOnm的納米膠囊。
[0116] 二級微米顆粒，即包封本發(fā)明的一級納米顆粒的載體，通過噴霧干燥技術(shù)獲得。噴 霧干燥是以連續(xù)的單一步驟方法將液體或懸浮液轉(zhuǎn)化為干粉的方法。通過使用Buchi實(shí)驗(yàn) 室級噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，該噴霧干燥器對于小樣品量(數(shù)毫克或數(shù)毫升)可以以高收 率（>70% )產(chǎn)生尺寸范圍為1000 nm至20μηι的微米顆粒，從而以相對高的收率形成微米顆 粒。二級微米顆粒通常具有在1微米和30微米之間的尺寸(直徑）。
[0117] 材料
[0118]從Sigma-Aldrich(Rehovot，Israel)購買牛血清白蛋白（BSA)和右旋糖酐 12KDa。 艾塞那肽由Teva Pharmaceuticals(Jerusalem, Israel)慷慨地贈(zèng)予。從Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)購買在水中的戊二酸8%。從Alfa Aesar(Haverther chemicals and hill，MA,USA)購買三偏磷酸鈉（STMP)。從Rohm(Dramstadt .GmbH,Germany)獲得聚（甲基丙 稀酸，丙稀酸乙酯）I: I (EudrEgit?:L100_55)。從Dow Chemical Company (Midland ,MI ,USA) 購買輕丙基甲基纖維素 （Methocel E4M Premium)。從Mallinckrodt chemicals (Phi llipsburg，NJ，USA)購買一水合磷酸二氫鈉。所有有機(jī)溶劑為HPLC級并且購自 J.T.Baker(Deventer,Holland)〇
[0119] -級NP的制備
[0120] 對敏感的生物大分子艾塞那肽的第一道保護(hù)通過將肽負(fù)載在一級BSA NP中實(shí)現(xiàn)。 制備兩種不同類型的NP:與戊二醛8%交聯(lián)的BSA Np和與STMP交聯(lián)的BSA與右旋糖酐12KDa 組合的NP。
[0121] 與戊二醛交聯(lián)的BSA NP
[0122] 與戊二醛交聯(lián)的BSA NP由Weber等人之前描述的已建立的去溶劑化方法[ref-Desolvation process and surface characterisation of protein nanoparticles]制 備。將200mg BSA和4mg或8mg艾塞那肽溶解于20ml雙蒸水(DDW)中。0.5小時(shí)后，用0.1 M NaOH 將溶液的PH調(diào)節(jié)至8.5。然后，將40ml丙酮緩慢加至水相。如分散介質(zhì)中快速形成乳白色證 明的，形成了ο/w乳液。然后用12.5μ1戊二醛8%溶液經(jīng)2小時(shí)交聯(lián)BSA NP。交聯(lián)反應(yīng)完成后， 在空氣層流下蒸發(fā)丙酮。此制劑被命名為Glut-I。
[0123] 與STMP交聯(lián)的BSA/右旋糖酐NP
[0124] 通過在20ml DDW中溶解以下化合物類似地制備BSA/右旋糖酐NP:200mg BSA、50mg 右旋糖酐12KDa，以及當(dāng)需要時(shí)，4mg或8mg艾塞那肽。0.5小時(shí)后，用0.1 M NaOH將溶液的pH調(diào) 節(jié)至8.5,以確保右旋糖酐上鄰近的羥基基團(tuán)可用于與STMP交聯(lián)劑的反應(yīng)。然后，將20ml丙 酮緩慢加至水相。然后，使用50mg STMP經(jīng)3小時(shí)交聯(lián)BSA/右旋糖酐NP，并且如上所述蒸發(fā)丙 酮。制備預(yù)制劑并通過改變工藝參數(shù)評價(jià)。選擇右旋糖酐量不同的兩個(gè)制劑進(jìn)行進(jìn)一步動(dòng) 物研究：50和150mg。50mg的制劑被命名為DX-50，且150mg的制劑被命名為DX-150。
[0125] 微米球(MP)制備
[0126] 通過使用噴霧干燥技術(shù)將含艾塞那肽的NP微米包封來形成微米顆粒(MP)。出于微 米包封的目的，制備100ml NaH2PO4緩沖液。用IM NaOH溶液將緩沖液的pH調(diào)節(jié)至6.5。將 750mg的量的Eudragit溶解于pH保持在6.5的該溶液中。此外，通過將1000 mg羥丙基甲基纖 維素（HPMC)加至10Om 1預(yù)熱（~80 °C )的DDW來制備1 % w/V HPMC溶液。然后，經(jīng)具有g(shù)aza band的漏斗（以過濾可能還未溶解的Eudrag i t顆粒)將Eudrag i t溶液加至HPMC溶液。
[0127] 一旦丙酮從NP懸浮液蒸發(fā)，將微米顆粒聚合物的合并的溶液加至NP懸浮液。然后， 用Buchi迷你噴霧干燥器B-190裝置(Flawil ,Switzerland)在以下條件下噴霧干燥懸浮液： 入口溫度160°C;出口溫度85°C;吸氣量(aspiration)100% ;懸浮液的進(jìn)料速度為7ml/min; 在旋風(fēng)分離器中收集粉末并計(jì)算出口收率。
[0128] NP和之后的MP的物理化學(xué)表征
[0129] NP 表征
[0130] 用MalvernZetasizer (Nano系列，Nanos-ZS，UK)在25 °C并使用水作為稀釋劑表征 各NP的平均直徑和ζ電勢。使用冷凍透射電子顯微鏡(Cryo-TEM)進(jìn)行形態(tài)評估。在Cryo-TEM 法中，將一滴溶液置于支持于300目Cu格柵(Ted Pella Ltd.，此(1虹即，4，1^4)上的碳-包 被的多孔的聚合物膜上，并且使用Vitrobot(FEI)用在液體乙烷中快速冷激至-170°C使樣 本自動(dòng)地玻璃化。用FEI Tecnai 12G2TEM在120kV用保持在-180°C的Gatan冷凍支架研究樣 品，并且在慢掃描冷卻電荷耦合裝置相機(jī)上記錄圖像。
[0131] MP的超高分辨率掃描電子顯微鏡(SEM)研究
[0132] 使用超高分辨率掃描電子顯微鏡（模型：Magellan 400L，F(xiàn)EI ,Germany)進(jìn)行形態(tài) 和尺寸評估。用雙面膠帶將樣品固定在SEM-托柱（SEM-stub)上，并隨后在真空下用金濺射 (gold spattering)(Pilaron E5100)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)包衣使之導(dǎo)電。
[0133] 藥物含量
[0134] 通過將樣品溶解于2ml水中過夜，分析粉末中的艾塞那肽的總量。之后，將混合物 在HOOOrpm離心2min。將來自上清的Iml在以下條件下注射到HPLC中：柱Restek Viva C4(5 μπι)，250/4.6mm。柱溫保持在45°C。流動(dòng)相A為乙腈(ACN)，且流動(dòng)相B為用磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.5 的磷酸二氫鉀(1(冊〇4,2〇111111〇1/1)。使用前將1(趾〇4緩沖液過濾通過0^111膜過濾器。對艾塞 那肽使用以下梯度條件：在15min內(nèi)從30%至45%流動(dòng)相A，并且重新平衡至30%流動(dòng)相 A3min。流速為1.5mL/min。注射體積為20yL。在215nm檢測UV信號(hào)。使用由范圍在0至20μg/ml 之間的艾塞那肽濃度建立的、獲得線性相關(guān)(r2 = 0.999)的校正曲線計(jì)算艾塞那肽含量。
[0135] 大鼠中藥物動(dòng)力學(xué)研究
[0136] 耶路撒冷的希伯來大學(xué)的當(dāng)?shù)氐膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了所有動(dòng)物研究 (MD-13575-4)。在此研究中使用Sprague Dawley雄性大鼠（300-350g)。將動(dòng)物安置在SPF條 件下，禁食并自由獲得飲用水。隨機(jī)分為7組，每組3只大鼠，來評價(jià)口服吸收和隨時(shí)間的艾 塞那肽血漿水平。艾塞那肽作為溶液被皮下注射或以65yg/kg(20yg/大鼠）的劑量配制于 Byetta_?中。第三組和第四組大鼠經(jīng)口施用在外部摻有艾塞那肽的31mg空白MP，或以165μ g/kg(50yg/大鼠）的劑量經(jīng)口施用艾塞那肽溶液，以確定空白制劑是否有效果。最后，以165 yg/kg(50yg/大鼠）的劑量分別經(jīng)口施用35mg Glut-l、33mg DX-50和32mg DX-150。所有口 服懸浮液分散于2mL DDW中，而皮下注射的體積為200μ1。
[0137] 在0、0.5、1、2、4、6、8和2處從大鼠的尾巴采集血液樣品（50(^1)。將樣品收集在含 EDTA和抑肽酶的管中。將樣品在10,000印111、4°(：離心1011111，之后將25(^1血漿樣品轉(zhuǎn)移到新 管中并在-80 °C保存直至被分析。依照公司建議的方案，使用CEK-0130-0IELISA試劑盒(AB Biolabs，USA)確定艾塞那肽水平。
[0138] 生物利用度計(jì)算
[0139] 使用WinNonl in軟件計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將梯形法則應(yīng)用于AUC的計(jì)算。依據(jù)尺 寸-劑量校正調(diào)整AUC值。
[0140]使用以下等式計(jì)算與皮下注射的標(biāo)準(zhǔn)市售制劑Byetta?湘比的不同口服制劑的 相對生物壬丨丨田_.
[0141]
[0142] 艾塞那肽制劑
[0143] 制劑F-I:用BSA和交聯(lián)的右旋糖酐的艾塞那肽一級納米包封
[0144] 將200mg BSA(Sigma-A7906)和50mg右旋糖酐 12KDa(Sigma-31418)溶解于IOml DDW。將4mg艾塞那肽單獨(dú)地溶解于IOml DDW。將白蛋白/右旋糖酐溶液加至艾塞那肽溶液以 完成肽溶解(溶液A)。用NaOH 0.1 M調(diào)節(jié)pH 6.8以達(dá)到pH為約8.5。在強(qiáng)烈攪拌期間將20ml丙 酮注射至溶液-A，以引起包含大部分艾塞那肽的BSA-右旋糖酐NP的形成。通過加入5% (Iml)三偏磷酸鈉（STMP)并將溶液在室溫下、在900rpm攪拌超過3小時(shí)獲得右旋糖酐交聯(lián)。 制劑F-I的合成的示意圖在圖1A-1B中示出。
[0145] 制劑F-2:用BSA和交聯(lián)的戊二醛的艾塞那肽一級納米包封
[0146] 將200mg BSA(Sigma-A7906)溶解于IOml DDW。將4mg艾塞那肽單獨(dú)溶解于IOml DDW。將白蛋白溶液加至艾塞那肽溶液以完成肽溶解。用NaOH 0.1 M調(diào)節(jié)pH以達(dá)到pH為8.5。 在強(qiáng)烈渦旋期間，將15ml丙酮注射至溶液-A，以引起包含大部分艾塞那肽的BSA-艾塞那肽 NP的形成。通過加入25μ1戊二醛4%并將溶液在900rpm在室溫下經(jīng)3小時(shí)攪拌獲得BSA交聯(lián)。 制劑F-2的交聯(lián)的示意圖在圖2中示出。
[0147] 制劑F-3 :艾塞那肽至納米顆粒表面的綴合
[0148] 通過使4mg艾塞那肽與間隔物硫代-SMCC(硫代琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基 甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)在室溫反應(yīng)2小時(shí)進(jìn)行艾塞那肽活化。
[0149] 為了 制備納米顆粒，將150mg PLGA(50K)(Resomer RG 504H，Boehr ingen Ingelheim)、150mg PLGA-PEG共聚物（45K和5K)(Resomer RGP d 50105)和IOmg油基半脫氛 酰胺溶解于50ml丙酮。將IOOmg Solutol HS 15(BASF)邊攪拌邊溶解于100ml DDW。在攪拌 下(900rpm)將有機(jī)相加至水相并允許經(jīng)15min混合。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下、在37°C將制 劑蒸發(fā)至少于IOml。用NaOH 0 . IM將pH調(diào)節(jié)至6.7-6.8并將體積調(diào)節(jié)至IOml。將制劑在 4000rpm離心以沉淀大顆粒(3-4% )。只將膠體上清液用于最終制劑。
[0150] 將經(jīng)活化的艾塞那肽立刻與預(yù)先形成的制劑孵育。在磁力攪拌器上，室溫，過夜進(jìn) 行孵育。LC-SMCC的馬來酰亞胺基團(tuán)與油基半胱氨酰胺的巰基基團(tuán)在pH=6.5-7.5反應(yīng)以形 成穩(wěn)定的硫醋鍵。
[0151] 制劑F-4:艾塞那肽雙重包封
[0152] 將IOOmg BSA(Sigma-A7906)溶解于2ml DDW。將5mg艾塞那肽單獨(dú)地溶解于3ml DDW。將白蛋白溶液加至艾塞那肽溶液以完成肽溶解。用NaOH IM將pH調(diào)節(jié)至7.4-8。在強(qiáng)烈 攪拌期間，將IOml丙酮注射至該溶液以引起包含大部分艾塞那肽的BSA納米顆粒的形成。
[0153] 將128mg PLGA(50K)溶解于93ml乙腈。在攪拌期間加入6ml BSA納米顆粒制劑以形 成雙重包封(納米噴霧條件:4μπι目，溫度:50°C)。
[0154] 用Eudragit L和HPMC將制劑Fl-F4微米包封
[0155] 將500mg HPMC溶解于100mL預(yù)熱的DDW，并將500mgEudragit(陰離子型）溶解于 100ml PBS0
[0156] 向納米顆粒溶液添加 Eudragi t溶液和HPMC溶液。在500rpm、室溫將合并的溶液攪 拌30分鐘;將合并的分散物用噴霧干燥器在以下條件下蒸發(fā):入口溫度= 160°C;出口溫度 = 100°C。獲得包含載藥納米顆粒的微米顆粒。
[0157] 載藥納米顆粒的物理化學(xué)表征在表1中示出。

[0160] 表1:艾塞那肽制劑的物理化學(xué)性質(zhì)。*將2批合并
[0161] **對于合并的制劑
[0162] 不同制劑(F1-F5)中的艾塞那肽對0Β/0Β小鼠降低葡萄糖作用的評估
[0163] 通過給予葡萄糖并經(jīng)6小時(shí)監(jiān)測葡萄糖水平使小鼠順應(yīng)數(shù)天。之后，以20yg/kg的 劑量向所有小鼠注射Byetta(商業(yè)的可注射的艾塞那肽制劑)并經(jīng)6小時(shí)監(jiān)測葡萄糖水平。
[0164] 用n = 8每組動(dòng)物的組大小進(jìn)行不同制劑中的艾塞那肽對0Β/0Β小鼠降低葡萄糖作 用的評價(jià)。向每組0Β/0Β小鼠提供以下中的一種：
[0165] i)生理鹽水+空媒介物(F-5)
[0166] ii)Byetta_ 注射劑
[0167] iii)艾塞那肽(F-I)
[0168] iv)艾塞那肽(F-2)
[0169] iv)艾塞那肽(F-3)
[0170] iv)艾塞那肽(F-4)
[0171] 在第1天，在實(shí)驗(yàn)前將所有動(dòng)物禁食18小時(shí)，然后在禁食后監(jiān)測血糖。通過腹腔注 射向所有動(dòng)物注射葡萄糖（18mg/kg);葡萄糖注射后60min檢查以下參數(shù):血糖測量、血液收 集用于Elisa、體重測量。然后，經(jīng)口施用制劑F1_F5(通過皮下注射施用Byetta)。施用后，在 施用后30min、l小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)監(jiān)測血糖水平。
[0172] 從第2天至第9天，在時(shí)間0時(shí)測量體重并收集血液用于ELISA。之后，施用制劑并在 藥物施用后1小時(shí)內(nèi)測量血糖水平(并且收集血液用于ELISA)。
[0173] 在第10天，在施用受試制劑的最后的劑量之前，再次給予葡萄糖，隨后體重測量并 收集血液用于ELISA。在此之后，以雙倍劑量向每只動(dòng)物施用制劑（以檢查這些制劑的增強(qiáng) 作用），然后在藥物施用后1小時(shí)，測量血糖水平并收集血液用于ELISA。
[0174] 體重測量
[0175] 對于每只小鼠，在相同時(shí)間進(jìn)行體重測量。不同艾塞那肽制劑(F1-F5)和Byetta的 結(jié)果在圖3中不出。
[0176] 血糖水平測量
[0177] 在第1至第10天收集血液樣品。在血糖測量程序前，通過將小鼠轉(zhuǎn)移到潔凈的籠底 座(cage base)來使15-19周齡的動(dòng)物禁食過夜(最高達(dá)16h)，該潔凈的籠底座具有潔凈的 筑巢材料和少量土質(zhì)墊料和來自它們的舊籠的豐富環(huán)境?；\子和墊料的改變避免了小鼠可 以接近灑出的食物的可能性。在整個(gè)禁食期間，保持水可被自由獲得。在收集最后的血液樣 品后歸還食物。通過用刀片在尾尖切口從未禁食的小鼠獲得一滴血。使用手持血糖儀 (Accu-chek Aviva ,Roche Diagnostics，UK)進(jìn)行測量。來自使用Byetta的預(yù)實(shí)驗(yàn)的血糖水 平在圖4中示出，而艾塞那肽的不同制劑(F1-F5)和Byetta的血糖水平在圖5中示出。
[0178] 血漿胰島素水平
[0179]對于胰島素確定，從尾靜脈采集150mL血液樣品（在離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/min處理血 液IOmin和5min)。將血衆(zhòng)分離到2個(gè)肝素包被的管中用于血液參數(shù)和胰島素測量（每管 30mL)。使用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Mercodia,Sylveniusgatan,Sweden)測 量血漿胰島素水平。不同組在不同天的血漿胰島素水平在圖6中示出。
[0180] 糖基化血紅蛋白水平
[0181] 使用EDTA作為抗凝劑收集血漿。在收集后30分鐘內(nèi)以1000 X g離心樣品15分鐘。移 除血漿并立即測定，或在-20°C或-80°C以等分試樣儲(chǔ)存樣品。使用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸 附測定試劑盒(Life Science，Inc,Florida,USA)測量糖基化血紅蛋白水平。不同組在不同 天的糖基化血紅蛋白水平在圖7中示出。
[0182] NP和之后的MP的物理化學(xué)表征
[0183] 牛血清白蛋白（BSA)是公知的并且是用于口服藥物遞送(除肽和蛋白質(zhì)以外）的豐 富的蛋白質(zhì)載體。其主要優(yōu)勢是生物可降解性、生物相容性、安全性、非-抗原性、良好耐受 性和可得性。此外，將肽和蛋白質(zhì)并入一級NP是富有挑戰(zhàn)的，因?yàn)榇蟛糠职戮酆衔锟扇苡?水并且需要被交聯(lián)以在漏槽條件下在體外產(chǎn)生肽的延長的釋放。在廣泛接受的納米載體 BSA NP的情況下，此問題甚至更復(fù)雜。白蛋白的任何變性方法，包括用戊二醛交聯(lián)、通過加 熱或使用有機(jī)溶劑變性將顯然影響肽或蛋白質(zhì)的化學(xué)完整性，如也在本工作中觀察到的。
[0184] 為避免此缺點(diǎn)，如圖8中示出的，將BSA基質(zhì)與多糖右旋糖酐結(jié)合，右旋糖酐可以經(jīng) 由其反應(yīng)性羥基基團(tuán)交聯(lián)[**多糖作為納米治療劑的組成單元(building block)]。為實(shí)現(xiàn) 穩(wěn)定的納米顆粒系統(tǒng)，在合適的pH條件下，使用TSMP交聯(lián)右旋糖酐的反應(yīng)性羥基基團(tuán)。
[0185] 通過改變不同參數(shù)，諸如pH、交聯(lián)分子的類型、TSMP量、右旋糖酐量制備不同制劑。 用戊二醛作為交聯(lián)劑制備的包含艾塞那肽的BSA NP表現(xiàn)出基于三次測量的平均直徑尺寸 為59.34±0.32nm，多分散性指數(shù)(PDI)值為0.138(反映窄尺寸范圍），并且ζ電勢值為-50.3 ± 3.03mV。包括BSA:右旋糖酐混合物的NP制劑的性質(zhì)在表2中示出?；诒?中描繪的數(shù)據(jù)， 如之前提及的，選擇右旋糖酐量為50mg和150mg的右旋糖酐量不同的兩個(gè)制劑。無論制劑如 何，NP的平均直徑的范圍從190nm至210nm，具有相對窄的分布范圍，如觀察到的相對低的 PDI值反映的。
[0187] 表2:從BSA和右旋糖酐的混合物制備的不同NP制劑的組成和性質(zhì)
[0188] 包含BSA/右旋糖酐混合物的一級NP的可視化使用冷凍TEM進(jìn)行（圖1A-B)。圖像示 出了無論組成差異如何NP為球狀的形態(tài)，直徑尺寸的范圍值與Zetasizer測量觀察到的范 圍相似。
[0189] 多種負(fù)載NP的MP的表征主要由XHR SEM分析可視化（圖9A、B、C)。微米包封的NP，示 出了MP的包衣是光滑的，定性地尺寸的范圍從Ιμπι至15μπι，并且由于為了 SEM可視化而應(yīng)用 了真空，MP是癟的。
[0190] Glut-1、DX-50 和 DX-150 中最終艾塞那肽含量分別為0 · 147、0 · 153 和0 · 158%w/w， 無論制劑如何均導(dǎo)致約40%的包封產(chǎn)率。
[0191] 大鼠藥物動(dòng)力學(xué)和吸收研究
[0192] 對于每個(gè)處理，來自3只大鼠的艾塞那肽血漿水平在圖10中示出。在8和24小時(shí)時(shí)， 無論制劑如何，艾塞那肽血漿濃度低于試劑盒的檢出限，因此數(shù)據(jù)未示出。此外，從圖10中 示出的結(jié)果可以注意到，經(jīng)口施用的摻入艾塞那肽溶液的空白MP制劑（用不具有艾塞那肽 的DX-50NP制備）、Glut-l制劑和游離艾塞那肽溶液不引起任何可檢測的艾塞那肽血漿水 平。還觀察到，實(shí)際的艾塞那肽引起與商業(yè)的Byetta?產(chǎn)品的血漿譜接近的譜，而制劑DX-50 引起比DX-150更高的藥物動(dòng)力學(xué)譜，但二者都以比可注射的制劑高得多的劑量施用（分別 為165yg/kg對65yg/kg)。
[0193] 的確，在計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)后，可以清楚地注意到，在將劑量歸一化后，最高的 AUC值由Byetta注射劑引起，接著是注射的艾塞那肽溶液、DX-50制劑和DX-150制劑。此外， 無論劑量如何，所有制劑引起高于l，〇〇〇ng/ml的(："^值，并且在T max值沒有差異。更重要的 是，ANOVA分析指出，在Byeatt和艾塞那肽溶液之間的歸一化的AUC值和DX-50 口服懸浮液之 間沒有顯著的差異。僅有的顯著差異是DX-150,其引起46.5%的相對口服生物利用度。
[0194]
[0195] 表3:以65yg/kg的劑量皮下注射Byetta和艾塞那肽溶液(Exe.Sol.)和以165yg/kg 的劑量口服施用DX-50和DX-150后的平均PK參數(shù)值(平均值土SE)，N=3
[0196] 纏
[0197] 此研究中與動(dòng)物操作、護(hù)理和處理相關(guān)的所有程序根據(jù)遵守國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評估和 認(rèn)可委員會(huì)（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（Institutional Animal Care and Use Committee，IA⑶C)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。
[0198] 圖和正本中的所有值以η個(gè)觀察的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(s.e.m)表示。對于體內(nèi)研究，η 代表被研究的動(dòng)物數(shù)目。在涉及組織學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，示出的數(shù)值代表在不同實(shí)驗(yàn)日在從每組 的所有動(dòng)物收集的組織切片上進(jìn)行的至少3個(gè)實(shí)驗(yàn)(組織染色）。用單因素方差分析或雙因 素方差分析檢查數(shù)據(jù)組，并且然后比較單獨(dú)的組平均值和Student's非配對t檢驗(yàn)。P-值小 于0.05被認(rèn)為是顯著的。
[0199]
[0200]在0Β/0Β小鼠中評價(jià)艾塞那肽的不同制劑(Fl -F5)的治療功效和安全性。特別地， 在艾塞那肽(F1-F5)和Byetta的施用后，在體重上不存在顯著差異（圖3)。
[0201 ]在用Byetta的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，在葡萄糖注射后Ih，向小鼠施用Byetta，如圖4中所示;直 至Ij6h，展示了血糖水平的降低。此結(jié)果支持這樣的觀點(diǎn):Byetta代表糖尿病的治療中的目標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)。另外，比較艾塞那肽的不同制劑(F1-F4)和Byetta治療。注意到艾塞那肽制劑(F1-F4) 被經(jīng)口施用，而Byetta組合物通過注射施用。結(jié)果示出了，每日口服施用F-I和F-2能夠在 0Β/0Β小鼠中減少血糖水平的增加（圖5)。在此基礎(chǔ)上，推測這兩種制劑表現(xiàn)出最令人感興 趣的結(jié)果。
[0202]圖6中的數(shù)據(jù)證明了不同組在不同天的血漿胰島素水平。如可以觀察到的，用艾塞 那肽的不同制劑(F1-F5)治療以及Byetta治療能夠增加胰島素水平。
[0203]此外，在10天治療期間，發(fā)現(xiàn)Byetta注射劑降低0Β/0Β小鼠中的糖基化的血紅蛋白 (HbAlc)的水平（圖7-11)。如與圖5比較的，糖基化血紅蛋白澄清(clarified)的速率，示出 了只有兩種艾塞那肽的制劑F-I和F-2表現(xiàn)出糖基化血紅蛋白水平降低的作用。
[0204] 從此得出結(jié)論，每日口服施用艾塞那肽F-l(并且口服施用F-2達(dá)顯著較低的程度， 因?yàn)殡谋晃於┙宦?lián)并且失去其部分活性），可以在糖尿病的癥狀治療中具有有益效果。
[0205] h_胰島素的雙重納米包封
[0206] 制備包含h_胰島素的雙重納米包封的樣品用于獲得用于在體內(nèi)引起肽的延長的 釋放的可注射的干粉。
[0207] 使用HSA的h-胰島素一級納米包封:
[0208] 在攪拌下，將200mg人血清白蛋白（HAS)溶解于5ml DDW。單獨(dú)地，將20mg人或牛胰 島素溶解于5ml DDW并渦旋30秒。然后將h-胰島素溶液加至HSA溶液并攪拌30分鐘以完成肽 溶解。用NaOH 0.1 M將所得溶液的pH調(diào)節(jié)至7.4-8。然后，在劇烈攪拌(900rpm)下，快速注射 (在20秒內(nèi)）20ml丙酮，以引起負(fù)載h-胰島素的HSA納米膠囊(溶液A)的形成。將溶液A用鋁箱 覆蓋以避免丙酮蒸發(fā)并以900rpm經(jīng)1小時(shí)攪拌。在攪拌1小時(shí)后吸取樣品（50-100μ1)用于ζ 電勢和尺寸測量。單獨(dú)的，將PLGAlOOK的溶液(50:50)溶解于80ml乙腈并加至溶液A。
[0209] 使用納米噴霧干燥器將HSA/h-胰島素納米顆粒納米包封進(jìn)PLGA-有機(jī)模式
[0210] 通過在以'閉環(huán)'模式運(yùn)行的NSD B-90上噴霧干燥來制備納米膠囊，因此，N2(g)和 C02(g)代替空氣在該系統(tǒng)中流動(dòng)。在所有實(shí)驗(yàn)中，氣流為約1201/min。將浸有揮發(fā)性蒸氣和 濕氣的空氣轉(zhuǎn)移到除濕單元，用于干燥和凝聚，然后在圓形路徑中干燥返回至系統(tǒng)。在低溫 下(T in = 30 °C-60 °C)用4μπι網(wǎng)孔尺寸的膜進(jìn)行噴霧干燥。制備不同HSA/h-胰島素/PLGA比的 多種制劑。與基于紊流運(yùn)行的常規(guī)噴霧干燥器不同，NSD B-90基于層流運(yùn)行；因此，溫和的 加熱是可實(shí)現(xiàn)的，從而使系統(tǒng)與對熱敏感的生物制藥產(chǎn)品相容。
[0211] 載藥的一級納米膠囊的物理化學(xué)表征
[0212] 一級納米膠囊內(nèi)的胰島素含量
[0213]在以下條件開發(fā)適當(dāng)?shù)腍PLC分析方法：
[0214] 使用c4柱分離和分析h_膜島素 （RESTEK viva 4 · 6mm X 250mm，i · d ·，5μηι顆粒， Bellefonte ,PA.USA)。柱溫保持在45°C。流動(dòng)相A為乙腈(ACN)，且流動(dòng)相B為用磷酸調(diào)節(jié)至 pH 2.5的磷酸二氫鉀(KH2P〇4,20mmol/L)。使用前，將流動(dòng)相過濾通過0.45μπι膜過濾器并由 真空排氣。
[0215] 對h-胰島素使用以下梯度條件:在15min內(nèi)從30%至45%流動(dòng)相Α，并且重新平衡 至30%流動(dòng)相A3min。流速為1.5mL/min。注射體積為20yL。在215nm檢測UV信號(hào)。
[0217]表4:不同制劑中h-胰島素含量
[0219]表5:不同制劑的一級納米膠囊的ζ電勢和粒徑 [0220] 納米膠囊的液體界面處的冷凍斷裂SEM圖像
[0221]在冷凍前將樣品懸浮于超純水+渦旋，并然后搖動(dòng)至少30分鐘。將1.5yL懸浮液體 積夾在兩個(gè)扁平鋁片之間，該兩個(gè)扁平鋁片具有200目的TEM網(wǎng)格被用作它們之間的間隔 物。然后將樣品在HPM010高壓冷凍機(jī)(Bal-Tec，Liechtenstein)中高壓冷凍。然后將冷凍的 樣品裝在支架上并轉(zhuǎn)移到使用VCT 100真空冷凍轉(zhuǎn)移裝置(Bal-Tec)的MF 60冷凍斷裂裝 置（Bal-Tec)。在-120Γ的溫度斷裂后，樣品在-IUTC蝕刻5分鐘并通過雙軸旋轉(zhuǎn)投影 (double axis rotary shadowing)用3nm Pt/C包被。將樣品用VCT 100轉(zhuǎn)移到Ultra 55SEM (Zeiss,Germany)并用二次電子透射檢測器（secondary electrons in-lens detector)在 1.5kV在-120 °C的溫度觀察。SEM圖像在圖IIA-IIC示出。
[0222] 糖尿病(DM)的誘導(dǎo)
[0223]通過靜脈注射稀釋于0.05M檸檬酸緩沖液的鏈脲菌素(STZ)(50mg/kg體重)在大鼠 中誘導(dǎo)DM。兩周后，被選作患糖尿病的動(dòng)物是表現(xiàn)出空腹血糖高于250mg/dL的那些。使用臨 床血糖儀（Contour ?,BAYER)用葡萄糖氧化酶法（Bergmeyer and Bernt, 1974)測量糖血 癥。
[0224] 然后患糖尿病的大鼠被用于評價(jià)在不同條件下（禁食和未禁食的）以5IU; IOIU/ (175;350yg)/動(dòng)物經(jīng)口服喂料的和以5IU(175yg)/動(dòng)物皮下注射的包含胰島素的納米膠囊 的不同制劑降低血糖的作用。
[0225] 圖12-13分別示出了在禁食的和非禁食條件下皮下施用不同的負(fù)載胰島素的納米 顆粒制劑后的血糖水平(N=3)。
[0226] 從SEM圖像可以看出，h-胰島素的一級HSA納米膠囊被納米包封于更大的PLGA納米 膠囊中。這些一級納米膠囊也在內(nèi)部被聚合物PLA包被，這表明胰島素釋放可以在肌肉內(nèi)或 皮下注射時(shí)控制。此假設(shè)被證實(shí)(如可以在圖12-13中看到），因?yàn)殡p重納米膠囊中的兩種類 型的胰島素注射都在禁食條件下引起超過24h的明顯延長的血糖降低，而在非禁食條件中 此作用較短?？梢缘贸鼋Y(jié)論，新的技術(shù)至少不顯著影響胰島素的藥理學(xué)活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種納米顆粒，所述納米顆粒包含水溶性蛋白質(zhì)、葡聚糖和親水活性劑，所述葡聚糖 由偏磷酸鹽至少部分交聯(lián)。2. 權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中所述水溶性蛋白質(zhì)是白蛋白。3. 權(quán)利要求2所述的納米顆粒，其中所述白蛋白選自人血清白蛋白（HSA)和牛血清白蛋 白(BSA)04. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述葡聚糖是α-葡聚糖。5. 權(quán)利要求4所述的納米顆粒，其中所述α-葡聚糖選自右旋糖酐、糖原、普魯蘭糖、淀 粉、糖原、地衣多糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖和半乳聚糖。6. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述葡聚糖具有在約5KDa和2 ,OOOKDa 之間的分子量。7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述偏磷酸鹽選自三偏磷酸鈉 (STMP)、三磷酸五鈉(STPP)和氯化氧磷(POCl 3)。8. 權(quán)利要求7所述的納米顆粒，其中所述偏磷酸鹽是三偏磷酸鈉。9. 權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述親水活性劑包含-NH2末端部分或-Mfe懸掛部分。10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述親水活性劑選自維生素、蛋白質(zhì)、 抗氧化劑、肽、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、激素、抗體、單克隆抗體、疫苗、預(yù)防劑、診斷劑、造影 劑、核酸、營養(yǎng)劑、分子量小于約I，OOODa或小于約500Da的小分子、電解質(zhì)、藥物、免疫劑及 其任何組合。11. 權(quán)利要求10所述的納米顆粒，其中所述親水活性劑選自胰島素、艾塞那肽、生長激 素、醋酸奧曲肽、醋酸蘭瑞肽、goserolin acetate、copaxone、依那西普和單克隆抗體。12. 權(quán)利要求10或11所述的納米顆粒，其中所述親水活性劑選自胰島素和艾塞那肽。13. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，所述納米顆粒具有至多500nm的直徑。14. 權(quán)利要求13所述的納米顆粒，所述納米顆粒具有在約50nm和250nm之間的直徑。15. 權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，所述納米顆粒是納米球或納米膠囊。16. -種載體，所述載體包括疏水聚合物和多個(gè)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的納米顆 粒，所述多個(gè)納米顆粒（i)被所述疏水聚合物包封或（ii)被嵌入在所述疏水的聚合物形成 的基質(zhì)中。17. 權(quán)利要求16所述的載體，其中所述疏水聚合物選自聚(乳酸羥基乙酸）（PLGA)、聚甲 基-丙烯酸甲酯(PMMA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚(乳酸）（PLA)、聚(乳酸羥基乙酸共聚 物）(PLG)、聚(丙交酯）、聚羥基乙酸(PGA)和聚(羥基丁酸）。18. 權(quán)利要求16或17所述的載體，其中所述納米顆粒具有在約200nm至900nm之間的直 徑。19. 權(quán)利要求18所述的載體，其中所述納米顆粒被嵌入在具有在1微米和30微米之間的 直徑的納米膠囊中。20. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的納米顆粒 和/或權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的載體。21. 權(quán)利要求20所述的藥物組合物，所述藥物組合物適合于所述親水活性劑的局部、口 月艮、吸入、經(jīng)鼻、透皮、經(jīng)眼或腸胃外施用。22. 權(quán)利要求21所述的藥物組合物，所述藥物組合物適合于所述親水活性劑的口服施 用。23. 權(quán)利要求21所述的藥物組合物，所述藥物組合物適合于所述親水活性劑通過注射 的施用。24. -種親水活性劑的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括： 疏水聚合物，和 包封在所述疏水聚合物內(nèi)的多個(gè)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的納米顆粒。25. -種親水活性劑的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括： 形成基質(zhì)的疏水聚合物，和 被嵌入在所述疏水聚合物內(nèi)的多個(gè)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的納米顆粒。26. 權(quán)利要求24或25所述的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)還包封在可生物降解的膠囊內(nèi)。27. 權(quán)利要求26所述的遞送系統(tǒng)，其中所述可生物降解的膠囊呈腸衣膠囊的形式。28. 權(quán)利要求24至27中任一項(xiàng)所述的遞送系統(tǒng)，其中所述遞送系統(tǒng)適合于所述親水活 性劑的便利的靶向的治療劑遞送及控制釋放的施用。29. 權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的納米顆?；驒?quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的載體 用于制備用于治療疾病、紊亂或慢性狀況的藥物組合物的用途。30. 權(quán)利要求29所述的用途，其中所述藥物組合物適合作為遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)用 于局部地、口服地、通過吸入、經(jīng)鼻地、透皮地、經(jīng)眼地或腸胃外地運(yùn)送治療劑進(jìn)入受試者的 循環(huán)系統(tǒng)的遞送系統(tǒng)。31. 用于制備包含水溶性球狀蛋白質(zhì)、葡聚糖和親水活性劑的納米顆粒的方法，所述葡 聚糖由偏磷酸鹽至少部分交聯(lián)，所述方法包括： -將第一水性溶液與第二水性溶液混合以形成混合物，所述第一水性溶液包含所述水 溶性球狀蛋白質(zhì)和所述葡聚糖，所述第二水性溶液包含所述親水活性劑； -將有機(jī)溶劑注射到所述混合物中；和 -將所述偏磷酸鹽添加至所述混合物，從而至少部分交聯(lián)的所述葡聚糖用于獲得所述 納米顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK105960232SQ201580005925
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2015年1月26日
【發(fā)明人】S·貝妮塔, T·納薩爾, 利亞特·柯查威-桑德萊
【申請人】耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展有限公司