Schiglautone A衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)并提供了一種由Schiglautone A的O?(1H?四氮唑基)乙基與O?(苯并咪唑基)乙基衍生物按照質(zhì)量比為65：35組成的組合物以及將上述化合物按照65：35的質(zhì)量比進(jìn)行混合從而制備本發(fā)明組合物的方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的這種組合物在20 ug/ml時(shí)能夠顯著抑制NIH/3T3增殖以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，具有抗肝纖維化的作用，因此本發(fā)明還提供了Schiglautone A的O?(1H?四氮唑基)乙基與O?(苯并咪唑基)乙基衍生物按照質(zhì)量比為65：35組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
Sch i g I autone A衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動(dòng)態(tài)過(guò)程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量 合成、分泌，而降解絕對(duì)或相對(duì)不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞(HC)壞死， 隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的 合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過(guò)程，是影響預(yù)后的重要 因素。
[0003] 過(guò)去的20年間，肝纖維化的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年來(lái)陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中 藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研 究.中華肝病雜志，2005，8(13): 561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對(duì)與肝星狀細(xì)胞激活相 關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是:減輕肝損傷;抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生;調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊 亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞凋亡；抑制肝臟成纖維細(xì)胞的增殖以及星狀細(xì)胞激活大量分泌誘 導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的增殖。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)201 1年發(fā)表（Fan-Yu Meng et al .， 2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011) 1502-1505)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物 III和化合物IV，并用化合物ΠI和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗肝纖維化活性進(jìn) 行了評(píng)價(jià)，其具有抗肝纖維化活性。
[0006] 由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長(zhǎng)因子的大量分泌，這些生長(zhǎng)因子 會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長(zhǎng)因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65%和35%。
[0008]
[0009]
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0011] 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上 可接受的鹽具有同樣的藥效。
[0012] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗成纖維細(xì)胞增殖的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
[0013] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維 細(xì)胞增殖的活性，組合物是一個(gè)極具開(kāi)發(fā)潛力的化合物，它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以 及相關(guān)藥物的制備。
[0014] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1化合物Schiglautone A的制備
[0016] 化合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/ 7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011 )1502-1505)的方法。
[0017]
[0018] 實(shí)施例2Schiglautone A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0019] 將化合物I(502mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(7.52(^，40.00111111〇1)和61^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攪拌Shdh之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后 對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(508mg，71 % )。
[0020] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5l3.40(s,lH),6.10(s,lH),5.63(s,lH),5.53(s,lH), 3.85(d,J = 11.2Hz,4H) ,3.52(d,J=10.8Hz,4H) ,2.96(s,lH) ,2.20(s,lH) ,2.16(s,2H), 2.00(s,lH),1.84(d,J=13.9Hz,4H),1.69(s,lH),1.58(dd,J = 22.2,8.5Hz,4H) ,1.51(s, lH),1.47(s,lH),1.26(dd,J=9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,lH),1.08-0.98(m,4H),0.96-0.94 (m,9H),0.94-0.85(m,6H).
[0021] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51 (s) ,132.01(s) ,127.77(s) ,85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73 (s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s),33.27(s), 29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00 (s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
[0022] HRMS(ESI)m/z[M-H]_calcd for C34H5iBr2〇6:715.2032；found 715.2027.
[0023]
[0024] 實(shí)施例3Schiglautone A的0-(1Η-四氮唑基）乙基衍生物（III)的合成
[0025] 將化合物II(358mg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmo 1)，碘化鉀（84mg，0 · 5mmo 1)和1H-四氮唑（140 lmg，20mmo 1)，混合物加熱回流5h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因 為互變異構(gòu)作用，在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100:1，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶，再將 淡黃色洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100:0.5，v/v)，依次收集 兩個(gè)淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物III的淡黃色固體(79.8mg，23%)。
[0026] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)Sl6.29(s，lH)，9.99(s，lH)，9.93(s，lH)，6.25(s，lH)， 5.76(s,lH),5.40(s,lH),4.57(s,1H),4.38(s,1H),4.32(s,1H),4.21(s,1H),3.96(d,J= 11.9Hz,4H),3.33(s,lH),2.55(s,lH),2.51(s,2H),2.39(s,lH),l.98(s,3H),1.82-1.76 (m,3H),1.73(s,lH),1.65(d,J=6.5Hz,2H),l.60(s,lH),1.53(s,1H),1.47-1.37(m,4H), 1.30(s,lH),1.19(s,lH),1.10(t,J=12.5Hz,3H),1.08(t,J=12.5Hz,9H),1.03(s,3H), 0.86(s,3H).
[0027] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)δ211·72(s),209·42(s),170·36(s),161·38(s),145·37 (s),143.80(s),132.29(s),128.04(s),86.25(s),82.68(s),66.14(s),65.60(s),57.33 (s),52.91(s),52.08(s),46.81(s),45.95(s),40.84(s),38.76(s),38.50(s),35.21(s), 33.74(s),30.01(s),29.16(s),26.91(s),25.66(s),24.23(s),22.51(s),21.22(s),20.74 (s),20.20(s),18.85(s),18.29(s),15.27(s).
[0028] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C36H55N8〇6:695.4245;found:695.4248〇
[0029]
[0030] 實(shí)施例4Schiglautone A的0-(苯并咪唑基）乙基衍生物的合成
[0031 ] 將化合物II(358mg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmol)，鵬化鉀(84mg，0 · 5mmol)和苯并咪唑（1180mg，lOmmol)，混合物加熱回流6h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物IV的棕色固體（169.9mg，43 % )。
[0032] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)Sl3.32(s，lH)，8.38(s，2H)，7.66(d，J = 25.0Hz，4H)， 7.39(s,2H),7.32(s,2H),6.25(s,1H),5.64(d,J=18.7Hz,2H),4.34(s,1H),4.28(s,lH), 4.18(d,J=13.7Hz,2H),4.04(s,2H),3.99(s,2H),3.13(s,1H),2.65(s,2H),2.26(s,1H), 2.17(s,lH) ,2.06(s,lH),l.98(s,3H) ,1.87(d,J= 16.4Hz,2H) ,1.66(dd,J = 8.0,6.6Hz, 4H),1.62(s,lH),1.49(s,lH),1.41(dd J=19.6,10.4Hz,2H),1.37(d,2H),1.20-l.ll(m, 4H) ,1.07(d,J = 20.0Hz,6H),103(d,J = 20.0Hz,3H),1.01(d,J = 20.0Hz,3H) ,0.95(d,J = 20.0Hz,3H).
[0033] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S211.30(s),208.98(s),169.90(s),160.96(s),146.28 (s),143.34(s),139.64(s),133.48(s),131.85(s),127.61(s),123.92(s),123.35(s), 118.55(s),110.85(s),85.79(s),82.26(s),67.74(s),67.20(s),57.00(s),52.56(s), 51.73(s),45.63(s),44.94(s),40.49(s),38.42(s),38.17(s),34.86(s),33.40(s),29.68 (s),28.81(s),26.57(s),25.33(s),23.88(s),22.17(s),20.89(s),20.39(s),19.86(s), 18.52(s),17.87(s),14.93(s).
[0034] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C48H63N4〇6:791.4748;found:791.4744。
[0035]
[0036] 實(shí)施例5組合物抗肝纖維化活性
[0037] 由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長(zhǎng)因子的大量分泌，這些生長(zhǎng)因子 會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長(zhǎng)因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。
[0038] 組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的65mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200 目網(wǎng)的35mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時(shí)用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0039]實(shí)驗(yàn)例1:組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3增殖的抑制作用
[0040] -、實(shí)驗(yàn)方法：
[0041] NIH/3T3細(xì)胞株購(gòu)自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。
[0042] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25%胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM 培養(yǎng)液(含l〇%FCS)制成lX104cell/ml的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定存活率大于95%，按 每孔100ul加入96孔板中，在37°C、5%⑶ 2培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的 DMEM培養(yǎng)液（含10%FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入 150ulDMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取0D值，結(jié)果以0D49Q表示。
[0043] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0044] 1、形態(tài)學(xué)觀察
[0045] NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度 快;而加組合物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì) 胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多?；衔颕II和化合物IV無(wú)此作用。
[0046] MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0047] 表1 :MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3增殖的抑制作用
[0048]
[0049] 注:*，與細(xì)胞陰性對(duì)照P〈0.05
[0050] 結(jié)果:組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表 明組合物體外對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無(wú)此作用。
[0051] 實(shí)驗(yàn)例2:組合物對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-iMTGF-fo)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用 [0052] TGF-&是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-β dOng/ml 刺激細(xì)胞增殖，再檢測(cè)藥物對(duì)TGF-m誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作 用機(jī)理。
[0053] 表2 :MTT法檢測(cè)組合物對(duì)TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用
[0054] 123456 2 注:*，與細(xì)胞+TGF 對(duì)照Ρ〈0·05 3 結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF-fo的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯 著的抑制作用，化合物III和化合物IV無(wú)此作用。表明組合物體外對(duì)纖維細(xì)胞增殖的抑制作 用可能是通過(guò)干預(yù)TGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 4
[0058] 結(jié)論:組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著 的抑制作用；組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-fo的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作 用。組合物可以用來(lái)制備抗肝纖維化藥物。化合物III和化合物IV對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖無(wú)顯著的抑制作用，對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-仏的 誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖無(wú)顯著的抑制作用，不可以用來(lái)制備抗肝纖維化藥物。 5 實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備 6 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0061 ]實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0062]取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65%和35%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65 %和35 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制成纖維細(xì)胞增殖。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述生長(zhǎng)因子 為T(mén)GF-01。
【文檔編號(hào)】C07D257/04GK106038554SQ201610419841
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】陸賢
【申請(qǐng)人】南京廣康協(xié)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司