1?(5,6?二氯?1h?苯并[d]咪唑?2?基)?1h?吡唑?4?羧酸的葡甲胺鹽制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了1?(5,6?二氯?1H?苯并[d]咪唑?2?基)?1H?吡唑?4?羧酸（化合物(1)）的葡甲胺鹽及其可藥用制劑。此類化合物可用于藥物組合物和由脯氨酰羥化酶活性介導(dǎo)的疾病狀態(tài)、障礙和病癥的治療方法。
【專利說明】1 - (5,6-二氯-1 Η-苯并[D ]咪唑-2-基)-1 Η-吡唑-4-羧酸的葡 甲胺鹽制劑
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年10月25日、申請(qǐng)?zhí)枮?01280052789.4、發(fā)明名稱為"Ια ，6_ 二氯-1Η-苯并 [D] 咪唑-2-基 )-1Η-吡唑-4-羧酸的葡甲胺鹽制劑"的發(fā)明專利申請(qǐng)的 分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)是2012年10月25日提交的PCT申請(qǐng)PCT/US2012/061847的國家階段，要求 2011年10月25日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)61/551,395的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及1-(5,6-二氯-1Η-苯并[d]咪唑-2-基)-m-吡唑-4-羧酸的葡甲胺鹽及 相關(guān)制備方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 高度保守的氧、鐵和2-氧代戊二酸依賴性脯氨酰羥化酶(PHD)通過低氧誘導(dǎo)因子 (HIF)的翻譯后修飾來介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)低氧的響應(yīng)（Ivan等人，2001年，Science《科學(xué)》，第292 卷，第464-468頁；Jaakkola等人，2001年，Science《科學(xué)》，第292卷，第468-472頁）。在常氧 條件下，PHD催化HIF中2個(gè)保守的脯氨酸殘基的羥基化。由于PHD對(duì)氧的親和力在氧的生理 范圍內(nèi)，并且氧是修飾羥化HIF的必需輔助因子，因此當(dāng)氧張力降低時(shí)PHD失活。這樣，HIF在 常氧條件下快速分解，但在低氧條件下或當(dāng)PHD被抑制時(shí)在細(xì)胞中積累。
[0006] 已描述了四種 PHD同型：PHD1、PHD2、PHD3 和 PHD4(Epstein 等人，2001年，Cell《細(xì) 胞》，第107卷，第43-54頁;Kae 1 in，2005年，Annu Rev Biochem.《生物化學(xué)年評(píng)》，第74卷，第 115-128頁；Schmid等人，2004年，J Cell Mol Med.《細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)期刊》，第8卷，第423-431頁。不同的同型都廣泛表達(dá)，但卻受到差異調(diào)控，并且在細(xì)胞對(duì)低氧的響應(yīng)中具有獨(dú)特 的生理作用。有證據(jù)證明各種同型對(duì)三種不同的HIF-α亞型具有不同的選擇性(Epstein等 人，出處同上）。就細(xì)胞定位而言，PHD1主要定位在細(xì)胞核，PHD2主要定位在細(xì)胞質(zhì)，而PHD3 似乎在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在(Metzen E等人，2003年，J Cell Sci.《細(xì)胞科學(xué)雜志》，第 116卷第7期，第1319-1326頁）。在常氧條件下，PHD2似乎是主要的HIF-a脯氨酰羥化酶（Ivan 等人，2002年，Proc Natl Acad Sci.USA《美國國家科學(xué)院院刊》，第99卷第21期，第13459-13464頁；Berra等人，2003年，EMBO J.《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第22卷，第4082-4090 頁）。這三種同型具有高度的氨基酸同源性，并且酶的活性位點(diǎn)高度保守。
[0007] 通過小分子對(duì)PHD酶活性的靶向破壞在氧感受和氧分布障礙的治療中具有潛在實(shí) 用性。例子包括但不限于:貧血;鐮狀細(xì)胞性貧血;周圍血管性疾病;冠狀動(dòng)脈疾??；心力衰 竭;保護(hù)組織免于在諸如心肌缺血、心肌梗塞和中風(fēng)的病癥中局部缺血;保存用于移植的器 官；通過調(diào)節(jié)和/或恢復(fù)血流、氧輸送和/或能量利用來治療組織的局部缺血；加速創(chuàng)傷愈 合，尤其是糖尿病和年老患者的創(chuàng)傷愈合;燒傷治療;感染治療;骨愈合和骨生長。另外，預(yù) 期PHD的靶向破壞可用于治療諸如糖尿病、肥胖癥、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸疾病的代謝障礙 以及諸如克羅恩病的相關(guān)障礙。（Recent Patents on Inflammation& AllergyDrugDiscovery《最新炎癥與過敏癥藥物發(fā)現(xiàn)專利》，2009年，第3卷，第1-16頁））。
[0008] 已示出HIF是導(dǎo)致低氧條件下促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生量增加的主要轉(zhuǎn)錄因子(Wang 等人，1993年，出處同上）。雖然已證明用重組人促紅細(xì)胞生成素治療是治療貧血的有效方 法，但可預(yù)期小分子介導(dǎo)的PHD抑制可比用促紅細(xì)胞生成素治療有優(yōu)勢(shì)。具體地講，其他HIF 基因產(chǎn)物的功能為造血所必需的，對(duì)這些因子的調(diào)節(jié)能提高造血效率。對(duì)造血重要的HIF靶 基因產(chǎn)物的例子包括:轉(zhuǎn)鐵蛋白（Rolfs等人，1997年，JBiol Chem.《生物化學(xué)雜志》，第272 卷第32期，第20055-20062頁）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Lok等人，1999年，J Biol Chem.《生物化學(xué)雜 志》，第274卷第34期，第24147-24152頁;Tacchini等人，1999年，J Biol Chem.《生物化學(xué)雜 志》，第274卷第34期，第24142-24146頁）和血漿銅藍(lán)蛋白（Mukhopadhyay等人，2000年，J Biol Chem.《生物化學(xué)雜志》，第275卷第28期，第21048-21054頁）。鐵調(diào)素表達(dá)也被HIF所抑 制(Peyssonnaux等人，2007年，J Clin Invest.《臨床研究雜志》，第117卷第7期，第1926-1932頁），已示出PHD的小分子抑制劑能減少鐵調(diào)素產(chǎn)生量（Braliou等人，2008年，J Hepatol.《肝臟病學(xué)雜志》，第48卷，第801-810頁）。鐵調(diào)素是造血所必需的鐵的利用度的負(fù) 調(diào)控因子，因此預(yù)期鐵調(diào)素產(chǎn)生量的下降對(duì)貧血癥的治療有益。PHD抑制在與其他貧血癥治 療法(包括補(bǔ)鐵和/或外源促紅細(xì)胞生成素)聯(lián)合使用時(shí)也是有用的。對(duì)人群中自然發(fā)生的 PHD2基因的突變的研究，為PHD抑制劑治療貧血癥的用途提供了進(jìn)一步的證據(jù)。最近兩份報(bào) 告已示出，在PHD2基因中存在功能異常突變的患者表現(xiàn)出紅血球增多現(xiàn)象增加和血液血紅 蛋白升高(Percy等人，2007年，PNAS《美國科學(xué)院院報(bào)》，第103卷第3期，第654-659頁;A1-Sheikh等人，2008年，Blood Cells Mol Dis.《血細(xì)胞、分子和疾病》，第40卷，第160-165 頁）。另外，已在健康志愿者和慢性腎病患者中評(píng)估了小分子PHD抑制劑（美國專利申請(qǐng) 如.1^2006/0276477,2006年12月7日）。血漿促紅細(xì)胞生成素以劑量依賴性方式增加，而慢 性腎病患者中血液血紅蛋白濃度增加。
[0009] HIF在低氧條件下的總積累支配著糖酵解作用的適應(yīng)性上調(diào)，氧化磷酸化的下降 導(dǎo)致過氧化氫和超氧化氫產(chǎn)生量下降，氧化磷酸化的最適化能保護(hù)細(xì)胞免受局部缺血損 傷。因此，預(yù)期PHD抑制劑可用于器官和組織移植物的保存（Bernhardt等人，2007年， Methods Enzymol.《酶學(xué)方法》，第435卷，第221-245頁）。雖然該有益效果可通過在收獲器 官以供移植之前先施用PHD抑制劑來實(shí)現(xiàn)，但在收獲之后在儲(chǔ)存(例如停搏液）中或在移植 后將抑制劑施用給器官/組織也會(huì)有治療效果。
[0010] 預(yù)期PHD抑制劑能有效保存組織，使其免受局部缺血和/或低氧影響。這包括與特 別是心絞痛、心肌局部缺血、中風(fēng)、骨骼肌局部缺血有關(guān)的局部缺血/低氧。最近，已證明局 部缺血預(yù)適應(yīng)是一種依賴于HIF的現(xiàn)象(Cai等人，2008年，Cardiovasc Res.《心血管研究》， 第77卷第3期，第463-470頁）。雖然預(yù)適應(yīng)的想法最為人所知的是預(yù)適應(yīng)在心臟中的保護(hù)作 用，但這個(gè)想法也可適用于其他組織，包括但不限于:肝臟、骨骼肌、肝臟、肺、腎臟、腸和大 腦(Pasupathy等人，2005年，Endovasc Surg ·《歐洲血管與血管內(nèi)外科雜志》，第29卷，第 106-115頁;Mallick等人，2004年，Dig Dis Sci.《消化疾病與科學(xué)》，第49卷第9期，第1359-1377頁）。在多個(gè)動(dòng)物模型中已獲得了PHD抑制和HIF升高對(duì)組織的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，包 括:PHD1的種系敲除賦予了對(duì)骨骼肌免受局部缺血傷害的保護(hù)(Aragon6s等人，2008年，Nat Genet.《自然遺傳學(xué)》，第40卷第2期，第170-180頁），通過使用siRNA使PHD2沉默保護(hù)了心臟 免受局部缺血傷害(Natara jan等人，2006年，Circ Res .《循環(huán)研究》，第98卷第1期，第133-140頁），通過施用一氧化碳抑制PHD保護(hù)了心肌免受局部缺血損傷(Chin等人，2007年，Proc Natl Acad Sci.U.S.A.《美國國家科學(xué)院院刊》，第104卷第12期，第5109-5114頁），大腦中 低氧增加了對(duì)局部缺血的耐受(Bernaudin等人，2002年，JCereb BloodFlowMetab.《腦血流 與代謝雜志》，第22卷第4期，第393-403頁）。另外，PHD的小分子抑制劑在實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)模型中 能保護(hù)大腦（Siddiq等人，2005年，J Biol Chem.《生物化學(xué)雜志》，第280卷第50期，第 41732-41743頁）。此外，已證明HIF上調(diào)能保護(hù)糖尿病小鼠（在這種小鼠中結(jié)局通常較差）的 心臟（Natara jan等人，2008年，J Cardiovasc Pharmacol ·《心血管藥理雜志》，第51卷第2 期，第178-187頁）。這些組織保護(hù)作用在伯格病、雷諾病和手足發(fā)紺中也可觀察到。
[0011] 對(duì)通過線粒體中Kreb循環(huán)進(jìn)行的有氧代謝依賴性下降，和對(duì)通過PHD抑制來產(chǎn)生 的厭氧糖酵解的依賴性提高，這在常氧組織中可具有有益作用。要著重指出的是，還示出 PHD抑制在常氧條件下能升高HIF。因此，PHD抑制會(huì)產(chǎn)生假低氧現(xiàn)象，相關(guān)情形是通過HIF引 發(fā)低氧響應(yīng)，但組織氧結(jié)合仍保持正常。預(yù)期由PHD抑制所產(chǎn)生的代謝變化還可為糖尿病、 肥胖癥和相關(guān)障礙(包括并存疾病)提供治療范例。
[0012] 總體而言，由PHD抑制所產(chǎn)生的一批基因表達(dá)變化減少了每單位葡萄糖所產(chǎn)生的 能量數(shù)量，并且會(huì)刺激身體燃燒更多的脂肪以保持能量平衡。糖酵解增加的機(jī)理在上文已 有討論。其他的觀察結(jié)果將低氧響應(yīng)與預(yù)期對(duì)糖尿病和肥胖癥治療有益的作用關(guān)聯(lián)起來。 已示出低氧和低氧模擬物如去鐵胺能防止脂肪細(xì)胞分化(Lin等人，2006年，J Biol Chem. 《生物化學(xué)雜志》，第281卷第41期，第30678-30683頁；Carrigre等人，2004年，J Biol Chem. 《生物化學(xué)雜志》，第279卷第39期，第40462-40469頁）。在脂肪生成的初始階段中抑制PHD活 性，抑制了新的脂肪細(xì)胞的形成(Floyd等人，2007年，J Cell Biochem.《細(xì)胞生物化學(xué)雜 志》，第101卷，第1545-1557頁）。低氧、氯化鈷和去鐵胺升高了HIF并抑制了PPARy 2核激素 受體轉(zhuǎn)錄(Yun等人，2002年，Dev Cell.《發(fā)育細(xì)胞》，第2卷，第331-341頁）。由于PPARy 2是 脂肪細(xì)胞分化的重要信號(hào)，預(yù)期PHD抑制可抑制脂肪細(xì)胞分化。這些作用被示出是通過HIF 調(diào)控的基因 DEC1/Stral3介導(dǎo)的(Yun等人，出處同上）。
[0013]已證明PHD的小分子抑制劑在糖尿病和肥胖癥的動(dòng)物模型中具有有益作用（國際 專利申請(qǐng)公開No · W02004/052284，2004年6月24 日；W02004/052285，2004年6月24 日）。在小 鼠膳食誘導(dǎo)肥胖癥、db/db小鼠和Zucker fa/fa大鼠模型中證明的PHD抑制劑的作用有:血 糖濃度下降、腹部脂肪墊和內(nèi)臟脂肪墊中的脂肪量下降、血紅蛋白Ale下降、血漿甘油三酯 下降、體重下降，以及確立的疾病生物標(biāo)記的變化，例如腎上腺髓質(zhì)素和瘦素水平增加。瘦 素是已知的HIF靶基因產(chǎn)物(Grosfeld等人，2002年，J Biol Chem.《生物化學(xué)雜志》，第277 卷第45期，第42953-42957頁）。參與脂肪細(xì)胞中的代謝的基因產(chǎn)物被證明是通過PHD抑制以 HIF依賴性方式調(diào)控的（國際專利申請(qǐng)公開NO.W02004/052285,出處同上）。這些產(chǎn)物包括載 脂蛋白A-IV、?；鵆oA硫酯酶、肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP)-l。
[0014] PHD抑制劑預(yù)期在治療上可作為血管發(fā)生、血管新生和動(dòng)脈生成的刺激劑使用。這 些過程在局部缺血和/或低氧條件下建立或恢復(fù)對(duì)組織的血流和氧合(Semenza等人，2007 年，J Cell Biochem.《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》，第102卷，第840-847頁；Semenza，2007年，Exp Physiol.《實(shí)驗(yàn)生理學(xué)》，第92卷第6期，第988-991頁）。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中和在人類中已示 出身體鍛煉能增加 HIF-1和血管內(nèi)皮生長因子(Gustafsson等人，2001年，F(xiàn)ront Biosci. 《生物科學(xué)前沿》，第6卷，第D75-89頁），從而增加骨骼肌中的血管數(shù)量。VEGF是眾所周知的 HIF靶基因產(chǎn)物，其是血管新生的主要驅(qū)動(dòng)因子(Liu等人，出處同上hPHD抑制比其他血管 生成療法具有潛在的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗芤訦IF依賴性方式刺激多種血管生長因子的控制表達(dá)， 包括但不限于：胎盤生長因子（PLGF)、促血管生成素-l(ANGPTl)、促血管生成素-2 (△如?了2)、血小板衍生的生長因子0(?〇6?8)(〇3現(xiàn)61丨6扒2〇〇4年，11拉6?1]^(1.《內(nèi)科學(xué)雜 志》，第255卷，第538-561頁;Kelly等人，2003年，Circ Res.《循環(huán)研究》，第93卷，第1074-10781頁)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l(SDF-l)(Ceradini等人，2004年，Nat Med.《自然醫(yī)學(xué)》，第 10卷第8期，第858-864頁）。相比于單獨(dú)施用VEGF所產(chǎn)生的血管，在血管新生過程中促血管 生成素-1的表達(dá)產(chǎn)生了抗?jié)B漏血管（Thurston等人，1999年，Science《科學(xué)》，第286卷，第 2511-2514頁；Thurston等人，2000年，Nat MecL《自然醫(yī)學(xué)》，第6卷第4期，第460-463頁； Elson等人，2001年，Genes Dev.《基因和發(fā)育》，第15卷第19期，第2520-2532頁）。已示出基 質(zhì)細(xì)胞衍生因子l(SDF-l)對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞募集到組織損傷部位的過程是重要的。SDF-1表 達(dá)增加了循環(huán)的CXCR4陽性祖細(xì)胞向局部缺血組織的黏附、迀移和歸巢。此外，對(duì)局部缺血 組織中SDF-1的抑制或者對(duì)循環(huán)的細(xì)胞上CXCR4的阻斷防止了祖細(xì)胞向損傷部位的募集 (Ceradini等人，2004年，出處同上；Ceradini等人，2005年，Trends Cardiovasc Med ·《心血 管醫(yī)學(xué)趨勢(shì)》，第15卷第2期，第57-63頁）。重要的是，在老齡小鼠中內(nèi)皮祖細(xì)胞向損傷部位 的募集減少，而通過在傷口部位增加 HIF進(jìn)行干預(yù)可以對(duì)此進(jìn)行矯正(Chang等人，2007年， Circulation《循環(huán)》，第116卷第24期，第2818-2829頁KPHD抑制所提供的優(yōu)勢(shì)不僅在于增 加多種血管發(fā)生因子的表達(dá)，而且對(duì)這些因子在整個(gè)血管新生過程中的表達(dá)和內(nèi)皮祖細(xì)胞 向局部缺血組織的募集進(jìn)行協(xié)調(diào)。
[0015] PHD抑制劑還可用于促血管發(fā)生療法。已證明在成體動(dòng)物的非局部缺血組織中腺 病毒介導(dǎo)的HIF過量表達(dá)能誘導(dǎo)血管新生(Kelly等人，2003年，Circ Res.《循環(huán)研究》，第93 卷第11期，第1074-1081頁），這提供了證據(jù)證明能升高HIF的療法（如PHD抑制）會(huì)誘導(dǎo)血管 新生。胎盤生長因子(PLGF)也是HIF靶基因，已示出它在局部缺血組織中的血管新生中起到 關(guān)鍵作用（Carmeliet，2004年，J Intern Med.《國際醫(yī)學(xué)雜志》，第255卷第5期，第538-561 頁；Luttun等人，2002年，Ann N Y Acad Sci.《紐約科學(xué)院年志》，第979卷，第80-93頁）。在 骨骼肌中(Pajusola等人，2005年，F(xiàn)ASEB J.《美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)刊》，第19卷第10期， 第 1365-1367 頁；Vincent 等人，2000年，Circulation《循環(huán)》，第 102卷，第 2255-2261 頁）和在 心肌中（Shyu等人，2002年，Cardiovasc Res ·《心血管研究》，第54卷，第576-583頁），通過 HIF過量表達(dá)，已證明了能升高HIF的療法的強(qiáng)效促血管新生作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞被HIF靶基因 SDF-1募集到局部缺血心肌，這也已得到證明(Abbott等人，2004年，Circulation《循環(huán)》，第 110卷第21期，第3300-3305頁）。因此，PHD抑制劑在組織局部缺血特別是肌肉局部缺血的情 況中將很可能有效地刺激血管新生。由PHD抑制劑所產(chǎn)生的治療性血管新生將很可能引起 恢復(fù)流向組織的血流，從而改善諸如但不限于以下的疾?。盒慕g痛、心肌缺血和心肌梗塞、 外周缺血疾病、跛行、胃潰瘍和十二指腸潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎以及炎性腸疾病。
[0016] PHD和HIF在組織修復(fù)和再生(包括傷口和潰瘍的愈合）中起到核心作用。最近的研 究已證明，在老齡小鼠中的傷口部位所有三種PHD表達(dá)增加，導(dǎo)致HIF積累下降(Chang等人， 出處同上）。因此，通過施用去鐵胺升高老齡小鼠中的HIF，結(jié)果使傷口愈合程度提升恢復(fù)到 了幼齡小鼠中觀察到的水平。類似地，與非糖尿病的同胎仔鼠相比，在糖尿病小鼠模型中 HIF升高受到了抑制(Mace等人，2007年，Wound Repair Regen.《創(chuàng)傷修復(fù)與再生》，第15卷 第5期，第636-645頁）。氯化鈷(一種低氧模擬物）的局部施用或者缺乏氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域 從而提供組成型活性形式的HIF的鼠 HIF的過量表達(dá)，導(dǎo)致了傷口部位HIF增加，HIF靶基因 如VEGF、Nos2和Hmoxl的表達(dá)增加，以及傷口愈合加速。PHD抑制的有益效果并不限于皮膚， 最近已證明PHD的小分子抑制劑在結(jié)腸炎的小鼠模型中提供益處(Robinson等人，2008年， Gastroenterology《腸胃病學(xué)》，第134卷第1期，第145-155頁）。
[0017]總的來說，PHD抑制導(dǎo)致HIF積累很可能通過以下至少四種機(jī)制起作用，從而促使 傷口的加速且更完全的愈合：1)保護(hù)受低氧和/或局部缺血危害的組織，2)刺激血管發(fā)生以 建立或恢復(fù)流向傷口部位的適當(dāng)血流，3)募集內(nèi)皮祖細(xì)胞到傷口部位，4)刺激能特異性刺 激愈合和再生的生長因子的釋放。
[0018] 由于 PDGF是 HIF基因革巴標(biāo)（Schultz 等人，2006 年，Am J Physiol Heart Circ Physiol.《美國生理學(xué)雜志：心臟與循環(huán)生理學(xué)》，第290卷第6期，第H2528-2534頁;Yoshida 等人，2006年，J Neurooncol.《神經(jīng)腫瘤學(xué)雜志》，第76卷第1期，第13-21頁），PHD抑制很可 能增加內(nèi)源T0GF的表達(dá)，并且所產(chǎn)生的有益效果與單獨(dú)用TOGF所產(chǎn)生的有益效果相似或更 好。在動(dòng)物中進(jìn)行的研究已證明，局部施用TOGF導(dǎo)致傷口DNA、蛋白質(zhì)和羥脯氨酸含量增加； 形成更厚的肉芽和表皮組織；以及傷口部位的細(xì)胞再增殖增加。PDGF可對(duì)新結(jié)締組織形成 的增強(qiáng)發(fā)揮局部作用。由于HIF介導(dǎo)的額外的組織保護(hù)作用和促血管發(fā)生作用，PHD抑制的 有效性很可能大于PDGF所產(chǎn)生的有效性。
[0019] PHD抑制的有益效果不僅延伸到皮膚和結(jié)腸中的加速傷口愈合，而且延伸到包括 但不限于胃腸潰瘍、皮膚移植物置換、燒傷、慢性傷口和凍傷在內(nèi)的其他組織損傷的愈合。
[0020] 在體內(nèi)低氧小生境中發(fā)現(xiàn)存在干細(xì)胞和祖細(xì)胞，低氧調(diào)控它們的分化和細(xì)胞命運(yùn) (Simon等人，2008年，Nat Rev Mol Cell Biol.《自然綜述：分子細(xì)胞生物學(xué)》，第9卷，第 285-296頁）。因此，PHD抑制劑可用于維持干細(xì)胞和祖細(xì)胞處于多能狀態(tài)和用于驅(qū)動(dòng)分化成 為所需的細(xì)胞類型。干細(xì)胞可用于培養(yǎng)和擴(kuò)增干細(xì)胞群體，并可保持細(xì)胞處于多能狀態(tài)，同 時(shí)將激素和其他因子施用給細(xì)胞可影響分化和細(xì)胞命運(yùn)。
[0021] PHD抑制劑在干細(xì)胞和祖細(xì)胞治療領(lǐng)域的又一個(gè)用途，涉及將PHD抑制劑用于調(diào)理 這些細(xì)胞以使其能經(jīng)受住向體內(nèi)的植入過程和產(chǎn)生對(duì)身體的適當(dāng)響應(yīng)，從而使干細(xì)胞和祖 細(xì)胞植入可行(Hu等人，2008年，J Thorac Cardiovasc Surg.《美國心胸外科雜志》，第135 卷第4期，第799-808頁）。更具體地講，PHD抑制劑可促進(jìn)干細(xì)胞的整合，并且一旦干細(xì)胞整 合時(shí)吸引適當(dāng)?shù)难汗?yīng)以維持干細(xì)胞。該血管形成也會(huì)起到將這些細(xì)胞釋放的激素和其 他因子攜帶到身體其他部位的作用。
[0022] PHD抑制劑還可用于治療感染（Peyssonnaux等人，2005年，J Invest Dermatol. 《研究性皮膚病學(xué)雜志》，第115卷第7期，第1806-1815頁；Peyssonnaux等人，2008年，J Invest Dermatol.《研究性皮膚病學(xué)雜志》，2008年8月，第128卷第8期，第1964-1968頁）。已 證明HIF升高能增加吞噬細(xì)胞中和角質(zhì)細(xì)胞中對(duì)感染的先天免疫應(yīng)答。其中HIF升高的吞噬 細(xì)胞顯示出殺細(xì)菌活性提高、氧化氮產(chǎn)生量增加和導(dǎo)管素(cathelicidin)這種抗細(xì)菌肽的 表達(dá)增加。這些效果也可用于治療燒傷感染。
[0023] HIF也已被證明參與骨生長和愈合(Pfander D等人，2003年，J Cell Sci.《細(xì)胞科 學(xué)期刊》，第116卷第Pt9期，第1819-1826頁）;Wang等人，2007年，J Clin Invest·《臨床研究 雜志》，第17卷第6期，第1616-1626頁），因此可用于愈合或防止骨折。HIF刺激糖酵解以提供 能量，以允許在低氧環(huán)境下合成骺軟骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)。HIF還在驅(qū)動(dòng)骨愈合過程中的VEGF 的釋放和血管新生中起作用。血管向生長中或愈合中的骨頭內(nèi)的生長可能是該過程中的限 速步驟。
[0024] PHD的小分子抑制劑在文獻(xiàn)中已有描述，這些小分子抑制劑包括但不限于咪唑并
[l，2_a]吡啶衍生物(Warshakoon等人，2006年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有機(jī)化學(xué)與 醫(yī)藥化學(xué)通訊》，第16卷第21期，第5598-5601頁））、取代的吡啶衍生物(Warshakoon等人， 2006年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊》，第16卷第21期，第5616-5620頁））、吡唑并吡啶(Warshakoon等人，2006年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有機(jī)化學(xué) 與醫(yī)藥化學(xué)通訊》，第16卷第21期，第5687-5690頁））、二環(huán)雜芳族N取代甘氨酸衍生物（國際 專利申請(qǐng)公開No. W02007/103905，2007年9月13日）、基于喹啉的化合物（國際專利申請(qǐng)公開 No . W02007/070359，2007年6月21日）、嘧啶三酮N取代的甘氨酸衍生物（國際專利申請(qǐng)公開 No . W02007/150011，2007年12月27日）、取代的芳基或雜芳基酰胺化合物（美國專利申請(qǐng)公 開No. US2007/0299086，2007年12月27日）和取代的4-羥基嘧啶-5-甲酰胺（國際專利申請(qǐng)公 開N〇.W02009/117269,2009年9月24日）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]本發(fā)明涉及如本文所述定義的通用和優(yōu)選實(shí)施例。根據(jù)下面的【具體實(shí)施方式】并結(jié) 合附圖，本發(fā)明的優(yōu)選和示例性特征將顯而易見。
[0026]在其許多實(shí)施例中，本發(fā)明涉及脯氨酰羥化酶(PHD)的抑制劑的新型鹽，并且提供 了治療、預(yù)防、抑制或改善與PHD酶相關(guān)的一種或多種疾病障礙的方法。
[0027] 更具體地講，本發(fā)明涉及下式的化合物的葡甲胺鹽：
[0028]
[0029]以及制備或制造該化合物的相關(guān)方法。
[0030] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及化合物(1)的葡甲胺鹽的含水形式。
[0031] 根據(jù)下面詳細(xì)的討論、方案、例子和權(quán)利要求，本發(fā)明的另外的實(shí)施例和優(yōu)點(diǎn)將變 得顯而易見。
【附圖說明】
[0032] 圖1示出了溶液中化合物(1)的飽和度的pH依賴性。
[0033]圖2示出了化合物（1)的葡甲胺鹽的PXRD數(shù)據(jù)。
[0034]圖3示出了化合物（1)的葡甲胺鹽的DSC、TGA和X射線數(shù)據(jù)。
[0035] 圖4示出了 ：（A)化合物（1)的葡甲胺鹽的單晶結(jié)構(gòu);和(B)化合物（1)的葡甲胺鹽的 單晶的實(shí)驗(yàn)和模擬粉末圖樣。
[0036] 圖5示出了 HIFl-α在暴露于化合物（1)的葡甲胺鹽的制劑時(shí)的刺激百分比。
[0037] 圖6示出了在受傷小鼠中局部施用化合物（1)的葡甲胺鹽的制劑后的血漿水平(全 身負(fù)荷）。
[0038] 圖7示出了在施用化合物（1)的葡甲胺鹽的制劑后使用弗朗茨擴(kuò)散池 （Franz diffusion cell)得出的化合物（1)經(jīng)過皮膚(人真皮)和人工膜的流量的相關(guān)性。
[0039] 圖8示出了施用化合物（1)的葡甲胺鹽的制劑未引起刺激至引起非常低的刺激，如 HET-CAM分析中測試。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明涉及具有下式的化合物的新型鹽：
[0041] ' *
7
[0042]其為脯氨酰羥化酶(PHD)的抑制劑，及其用于治療、改善或抑制與脯氨酰羥化酶的 調(diào)節(jié)相關(guān)的障礙和疾病的組合物。本發(fā)明還涉及制備此類化合物、其藥物組合物、可藥用 鹽、可藥用前藥和藥物活性代謝物的方法。
[0043] A)術(shù)語
[0044] 通過引用本文提供的以下定義、附圖和示例性公開最全面地理解本發(fā)明。
[0045] 術(shù)語"包括"、"含有"和"包含"在本文中以其開放的、非限制性的意義使用。
[0046] "施用"意指以藥理學(xué)上有用的方式為患者提供藥物。
[0047] "組合物"意指含有本發(fā)明化合物的產(chǎn)品（例如包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以 及直接或間接通過此類規(guī)定量的規(guī)定成分的組合獲得的任何產(chǎn)品）。
[0048] "化合物"或"藥物"意指式（1)的化合物或其可藥用形式。
[0049] "形式"意指一種或多種式（1)的化合物及其鹽或水合物的各種異構(gòu)體和混合物。 術(shù)語"異構(gòu)體"是指具有相同組成和分子量但物理性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)不同的化合物。此類 物質(zhì)具有相同數(shù)量和種類的原子但結(jié)構(gòu)不同。結(jié)構(gòu)差異可存在于構(gòu)成(幾何異構(gòu)體)或存在 于旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力(立體異構(gòu)體）。術(shù)語"立體異構(gòu)體"是指構(gòu)成相同但其原子在空間 中的排列不同的異構(gòu)體。對(duì)映體和非對(duì)映體是立體異構(gòu)體，其中不對(duì)稱取代的碳原子充當(dāng) 手性中心。術(shù)語"手性"是指與其鏡像不可重合的分子，這意味著不存在對(duì)稱軸和對(duì)稱平面 或?qū)ΨQ中心。
[0050] 術(shù)語"低氧"或"低氧障礙"是指提供在血液或供應(yīng)給組織和器官的氧水平不足的 病癥。低氧障礙可通過多種機(jī)制發(fā)生，包括血液攜氧能力不足的情況（即貧血），由心力衰竭 或血管和/或動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致的流向組織和/或器官的血流不足的情況（即局部缺血），氣壓減 小的情況（即在高海拔地區(qū)的高原?。蚬δ苁д{(diào)細(xì)胞不能正確利用氧的情況（即組織中 毒性病癥）。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解到，本發(fā)明可用于治療多種低氧病癥，包括貧 血、心力衰竭、冠狀動(dòng)脈疾病、血栓栓塞、中風(fēng)、心絞痛等。
[0051] "患者"或"受試者"意指需要治療介入的動(dòng)物、優(yōu)選地哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選地人類。
[0052] "可藥用"意指具有用于本發(fā)明的組合物或藥物的制劑的足夠純度和質(zhì)量的分子 實(shí)體和組合物。由于人用（臨床和非處方)和獸用兩者等同地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此 制劑將包括人用或獸用組合物或藥物。
[0053] "可藥用賦形劑"是指無毒的、生物學(xué)上可耐受的，以及換句話講在生物學(xué)上適于 施用給受試者的物質(zhì)，例如惰性物質(zhì)，其被加入藥物組合物或換句話講用作溶媒、載體或稀 釋劑以有利于藥劑的施用，并且與藥劑相容。賦形劑的例子包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和 各種淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
[0054] "可藥用鹽"意指本發(fā)明的化合物的酸或堿鹽，其具有用于本發(fā)明的組合物或藥物 的制劑的足夠的純度和質(zhì)量，并且具有耐受性和充分無毒，以用于藥物制劑中。合適的可藥 用鹽包括酸加成鹽，其可例如通過將藥物化合物與諸如鹽酸、硫酸、富馬酸、馬來酸、琥珀 酸、乙酸、苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸之類的合適的可藥用酸反應(yīng)而形成。
[0055] 術(shù)語"溶劑化物"意指通過此類化合物與一種或多種溶劑分子以溶液或以固體或 晶體形式的相互作用或絡(luò)合作用而形成的那些化合物。術(shù)語"水合物"意指溶劑化物，其中 溶劑為水。
[0056] "治療有效量"意指能在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人體上引起研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他 臨床醫(yī)師正在尋求的生物或藥物反應(yīng)(包括所治療疾病或障礙的癥狀的治療緩解）的化合 物的量。
[0057] 如本文所用，除非另外指明，否則術(shù)語"治療"意指逆轉(zhuǎn)、緩解、抑制此類術(shù)語適用 的障礙或病癥或此類障礙或病癥的一種或多種癥狀的過程，降低其嚴(yán)重性或?qū)ζ溥M(jìn)行預(yù) 防。如本文所用，除非另外指明，術(shù)語"治療"是指治療行為。
[0058] B)化合物
[0059] 本發(fā)明涉及式（1)的化合物的新型鹽。具體地講，本發(fā)明涉及式（1)的化合物的葡 甲胺鹽。一般而言，本發(fā)明涉及施用給需要治療與脯氨酰羥化酶的調(diào)節(jié)相關(guān)的障礙和疾病 的患者的所有化合物。
[0060] 本發(fā)明的一些實(shí)施例包括此類化合物的水合物、溶劑化物或多晶型及其混合物， 即便這些形式未在本說明書中明確陳述。優(yōu)選地，式（1)的化合物或其可藥用鹽的一些實(shí)施 例包括溶劑化物。更優(yōu)選地，式(1)的化合物或其可藥用鹽的一些實(shí)施例包括水合物。
[0061 ]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例包括式（1)的化合物的晶體形式或者式（1)的化合物的可 藥用鹽可作為共晶體獲得。
[0062] 在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，式（1)的化合物以晶體形式獲得。在其他實(shí)施例中，式 (1)的化合物的晶體形式實(shí)質(zhì)上為立方體。在其他實(shí)施例中，式（1)的化合物的可藥用鹽以 晶體形式獲得。在其他實(shí)施例中，式（1)的化合物以若干多晶型形式中的一種，作為晶體形 式的混合物，作為多晶型形式或作為非晶態(tài)形式獲得。在其他實(shí)施例中，式（1)的化合物在 溶液中在一個(gè)或多個(gè)晶體形式和/或多晶型形式之間轉(zhuǎn)換。
[0063] 本發(fā)明的藥物化合物還包括立體異構(gòu)體的混合物，或各自純的或基本上純的異構(gòu) 體。例如，本發(fā)明化合物可任選地在含有任何一個(gè)取代基的碳原子處具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì) 稱中心。因此，化合物可以對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其混合物的形式存在。當(dāng)本發(fā)明化 合物含有雙鍵時(shí)，本發(fā)明化合物可以幾何異構(gòu)體(順式-化合物、反式-化合物)的形式存在， 而當(dāng)本發(fā)明化合物含有不飽和鍵如羰基時(shí)，則本發(fā)明化合物可以互變異構(gòu)體形式存在，并 且本發(fā)明化合物還包括這些異構(gòu)體或其混合物。在制備本發(fā)明化合物的過程中可使用外消 旋混合物、對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體形式的起始化合物。當(dāng)本發(fā)明化合物以非對(duì)映異構(gòu) 體或?qū)τ钞悩?gòu)體的形式獲得時(shí)，則它們可通過常規(guī)方法如色譜法或分級(jí)結(jié)晶法進(jìn)行分離。 此外，本發(fā)明化合物包括其分子內(nèi)鹽、水合物、溶劑化物或多型。合適的藥物化合物為在穿 透粘膜、真皮后或在口服的情況下在用唾液輸送到胃腸道后發(fā)揮局部生理效應(yīng)或全身效應(yīng) 的那些。
[0064] 本發(fā)明還涉及式（1)的化合物的可藥用鹽和使用此類鹽的方法?？伤幱名}是指化 合物的游離酸或堿的鹽，其是無毒的、生物學(xué)耐受的或換句話說在生物學(xué)上適于施用給受 試者。一般來講，參見S.M.Berge等人，"Pharmaceutical Salts"，J.Pharm. Sci · "藥用鹽"， 《藥物科學(xué)雜志》，1977年，第66卷，第1-19頁）以及Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties，Selection，and Use《藥用鹽手冊(cè)：特性、選擇與應(yīng)用》，2002年，Stahl和 Wermuth編輯，Wiley-VCH and VHCA，蘇黎世。優(yōu)選的可藥用鹽是藥理學(xué)上有效和適于與患 者的組織接觸而不具有不適當(dāng)?shù)亩拘?、刺激或過敏反應(yīng)的那些?；衔锟删哂凶銐虻乃嵝?基團(tuán)、足夠的堿性基團(tuán)或兩種類型的官能團(tuán)，并且因此與多種無機(jī)或有機(jī)堿及無機(jī)和有機(jī) 酸反應(yīng)，以形成可藥用鹽。可藥用鹽的例子包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞 硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、 乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、 草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、 己炔-1，6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸 鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸 鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ -羥丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸 鹽、萘-2-磺酸鹽和扁桃酸鹽。
[0065] 在存在堿性氮的情況下，所需的可藥用鹽可通過本領(lǐng)域可用的任何合適方法制 備，例如用無機(jī)酸處理該游離堿，所述無機(jī)酸例如是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、高氯酸、硫酸、氨 基磺酸、硝酸、硼酸、磷酸等，或者用有機(jī)酸處理該游離堿，所述有機(jī)酸例如乙酸、三氟乙酸、 苯乙酸、丙酸、硬脂酸、乳酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、蘋果酸、帕莫酸、羥乙磺酸、琥 珀酸、戊酸、富馬酸、糖精酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、油酸、棕櫚酸、月桂酸、 吡喃糖苷基酸（如葡糖醛酸或半乳糖醛酸）、α_羥酸（如扁桃酸、檸檬酸或酒石酸）、氨基酸 (如天冬氨酸或谷氨酸）、芳族酸(如苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、萘甲酸或肉桂酸）、磺酸(如 月桂基磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、對(duì)甲苯璜酸、甲磺酸、乙磺酸、羥基乙磺酸、環(huán)己基磺酸）、諸 如本文作為例子給出的那些酸的任何相容性混合物，以及根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技能水平 被認(rèn)為是等效物或可接受取代物的任何其他酸及其混合物。
[0066] 在存在酸基團(tuán)如羧酸或磺酸的情況下，所需的可藥用鹽可通過任何合適的方法制 備，例如用無機(jī)或有機(jī)堿處理該游離酸，所述無機(jī)或有機(jī)堿例如胺(伯胺、仲胺或叔胺）、堿 金屬氫氧化物、堿土金屬氫氧化物、諸如本文作為例子給出的那些堿的任何相容性混合物， 以及根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技能水平被認(rèn)為是等效物或可接受取代物的任何其他堿及其 混合物。合適的鹽的示例性例子包括衍生自下述物質(zhì)的有機(jī)鹽:氨基酸(例如甘氨酸和精氨 酸）、氨、碳酸鹽、碳酸氫鹽、伯胺、仲胺、叔胺和環(huán)胺(例如芐胺、吡咯烷、哌啶、嗎啉和哌嗪）， 以及衍生自下列物質(zhì)的無機(jī)鹽:鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁和鋰。代表性的有機(jī)或無機(jī) 堿還包括芐星、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和普魯卡因。
[0067] 本發(fā)明還涉及化合物的可藥用前藥，以及使用此類可藥用前藥的治療方法。術(shù)語 "前藥"意指指定化合物的前體，該前體在施用給受試者后，在體內(nèi)通過諸如溶劑分解或酶 解的化學(xué)或生理過程或在生理?xiàng)l件下生成化合物。"可藥用前藥"是無毒的、生物學(xué)上可耐 受的，以及換句話講在生物學(xué)上適于施用給受試者的前藥。例如，在"Design ofProdrugs" "前藥設(shè)計(jì)"，H. Bundgaard編輯，1985年，El sevier中描述了用于選擇和制備合適的前藥衍 生物的示例性工序。
[0068] 附加類型的前藥可例如通過將化合物的結(jié)構(gòu)的游離羧基衍生為酰胺或烷基酯來 制備。酰胺的例子包括衍生自氨、伯烷基胺和仲二烷基胺的那些。仲胺包括5元或6元雜環(huán)烷 基或雜芳基環(huán)部分。酰胺的例子包括衍生自氨、烷基伯胺和二烷基胺的那些。本發(fā)明的酯的 例子包括烷基酯、環(huán)烷基酯、苯酯和苯基烷基酯。優(yōu)選的酯包括甲酯。還可以按照諸如 Fleisher等人，Adv.Drug Delivery Rev.《藥物遞送進(jìn)展綜述》，1996年，第19卷，第115-130 頁中所述的那些工序，通過使用包括半琥珀酸酯、磷酸酯、二甲基氨基乙酸酯和磷酰氧基甲 氧基羰基在內(nèi)的基團(tuán)使游離羥基衍生化來制備前藥。羥基和氨基的氨基甲酸酯衍生物也可 產(chǎn)生前藥。羥基的碳酸酯衍生物、磺酸酯和硫酸酯也可以提供前藥。將羥基衍生化為酰氧基 甲醚和酰氧基乙醚，其中?；蔀槿芜x被一個(gè)或多個(gè)醚、胺或羧酸官能團(tuán)取代的烷基酯，或 者其中?；鶠槿缟纤龅陌被狨ィ@也可用于產(chǎn)生前藥。該類型的前藥可如Greenwald等 人，J.Med. Chem.《藥物化學(xué)雜志》，1996年，第39卷第10期，第1938-1940頁中所述制備。游離 胺也可衍生化為酰胺、磺酰胺或膦酰胺。所有這些前藥部分都可摻入包括醚、胺和羧酸官能 團(tuán)在內(nèi)的基團(tuán)。
[0069] 本發(fā)明還涉及式（1)的化合物的藥物活性代謝物，其也可用于本發(fā)明的方法中。 "藥物活性代謝物"意指該化合物或其鹽的體內(nèi)代謝的藥理活性產(chǎn)物?；衔锏那八幒突钚?代謝物可使用本領(lǐng)域已知或可利用的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行確定。參見例如Bertolini等人， J.Med. Chem.《藥物化學(xué)雜志》，1997年，第40卷，第2011-2016頁；Shan等人，J.Pharm. Sci . 《制藥科學(xué)雜志》，1997年，第86卷第7期，第765-767頁;Bagshawe，Drug Dev· Res ·《藥物開發(fā) 研究》，1995年，第34卷，第220-230頁）；Bodor，Adv.DrugRes.《藥物研究進(jìn)展》，1984年，第13 卷，第224-331頁）；Bundgaard，Design of Prodrugs，《前藥設(shè)計(jì)》，1985年，愛思唯爾出版 社）；以及Larsen，Design and Application ofProdrugs，"前藥的設(shè)計(jì)與應(yīng)用"，《藥物設(shè)計(jì) 與開發(fā)》，1991年，Krogsgaard-Larsen等人編輯，哈伍德學(xué)術(shù)出版社）。
[0070] C)藥物組合物
[0071] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，式（1)的化合物的鹽更具體地講葡甲胺鹽單獨(dú)使用或 者與一種或多種附加成分組合使用來配制藥物組合物。藥物組合物包含有效量的至少一種 根據(jù)本發(fā)明的化合物。
[0072] 本公開還提供了包含本文所述的化合物或衍生物以及可藥用載體、賦形劑和稀釋 劑中的一種或多種的組合物(包括藥物組合物）。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，組合物還可包 含微量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。在具體實(shí)施例中，藥物組合物對(duì)于施用給人類是藥 學(xué)上可接受的。在某些實(shí)施例中，藥物組合物包含治療有效量或預(yù)防有效量的本文所述的 化合物或衍生物?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定本發(fā)明的化合物或衍生物將治療有效或預(yù)防有 效的量。示例性的有效量在以下部分中更詳細(xì)地描述。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，組合物還 可含有穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑為降低化合物（1)的組合物的化學(xué)降解速率的化合物。合適的穩(wěn)定劑 包括但不限于抗氧化劑，如抗壞血酸、pH緩沖劑或鹽緩沖劑。
[0073] 藥物組合物可為適于施用給受試者(優(yōu)選地人類受試者）的任何形式。在某些實(shí)施 例中，組合物為溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑和緩釋制劑的形式。組合物還 可為特定單位劑型。單位劑型的例子包括但不限于:片劑;膠囊片;膠囊劑，例如軟彈性明膠 膠囊劑;扁囊劑;糖錠劑;錠劑;分散劑;栓劑;膏劑;泥罨劑(巴布膏）；糊劑;散劑;敷料劑;霜 劑;膏藥劑;溶液;貼劑;噴霧劑(如鼻噴霧劑或吸入劑）；凝膠劑;適于口服或粘膜施用給患 者的液體劑型，包括懸浮劑(如含水或不含水液體懸浮劑、水包油型乳液或油包水型乳液）、 溶液劑和酏劑;適于腸胃外施用給受試者的液體劑型；以及無菌固體(例如結(jié)晶固體或非晶 態(tài)固體），其可被重構(gòu)以提供適于腸胃外施用給受試者的液體劑型。
[0074] 在具體實(shí)施例中，受試者是諸如牛、馬、羊、豬、家禽、貓、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠 的哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，受試者是人類。優(yōu)選地，藥物組合物適于獸類和/或人類施 用。根據(jù)該實(shí)施例，術(shù)語"可藥用"意指經(jīng)聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列入美國藥典或其 他公認(rèn)的藥典以用于動(dòng)物，更具體地講用于人類。
[0075] 用于組合物中的合適的藥物載體是無菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物 或合成來源的那些。在具體實(shí)施例中，油是花生油、大豆油、礦物油或芝麻油。當(dāng)靜脈內(nèi)施用 藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液體載 體，尤其是用于可注射溶液。合適的藥物載體的其他例子為本領(lǐng)域已知，例如Remington' sPharmaceutical Sciences《雷氏藥學(xué)大全》，1990年，第18版，Mack出版，賓夕法尼亞州伊 斯頓中所述。
[0076] 用于組合物中的合適的賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面 粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和 乙醇。具體賦形劑是否適于摻入到藥物組合物中取決于本領(lǐng)域熟知的多種因素，包括但不 限于施用途徑和組合物中的具體活性成分。
[0077] 包含本文所述的化合物或衍生物或其可藥用鹽和溶劑化物的藥物組合物被配制 為與預(yù)期施用途徑相容。制劑優(yōu)選地用于局部施用，但可通過其他方式施用，例如通過吸入 或吹入(經(jīng)□或經(jīng)鼻)施用、真皮內(nèi)施用、口腔施用、皮下施用、含服施用、腸胃外施用、經(jīng)陰 道或直腸施用。優(yōu)選地，組合物還被配制成在儲(chǔ)存和輸送過程中為化合物提供增強(qiáng)的化學(xué) 穩(wěn)定性。制劑可以是凍干制劑或液體制劑。
[0078] D)施用
[0079] 本文所述的化合物或衍生物或其可藥用鹽優(yōu)選地作為組合物的組分施用，該組合 物任選地包含可藥用載體。化合物或衍生物優(yōu)選地通過口服施用。另一種優(yōu)選的施用方法 是通過局部施用化合物或衍生物。
[0080] 在某些實(shí)施例中，化合物或衍生物通過任何其他常規(guī)途徑施用，例如通過經(jīng)皮膚、 上皮或皮膚粘膜內(nèi)層(例如(表皮)真皮、口腔粘膜、直腸和腸粘膜)吸收。施用方法包括但不 限于通過吸入或局部(尤其是對(duì)于耳、鼻、眼或皮膚）的腸胃外施用、真皮內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施 用、腹膜內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、鼻內(nèi)施用、硬膜外施用、口腔施用、舌下施用、鼻內(nèi) 施用、大腦內(nèi)施用、陰道內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、直腸施用。在大多數(shù)情況下，施用將導(dǎo)致化合物 或衍生物釋放到血流中。在優(yōu)選的實(shí)施例中，化合物或衍生物通過口腔遞送。
[0081] 此外，本發(fā)明涉及使用本文所述的化合物治療受試者的方法，所述受試者被診斷 有或罹患由脯氨酰羥化酶介導(dǎo)的疾病、障礙或病癥，例如:貧血、血管障礙、代謝障礙和傷口 愈合。
[0082] 在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防貧血，包括治療與以下疾 病有關(guān)的貧血病癥:慢性腎病、多囊性腎病、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、骨髓 移植貧血、丘-施二氏綜合征、布-戴二氏貧血、范可尼貧血、費(fèi)爾蒂綜合征、移植物抗宿主 病、造血干細(xì)胞移植、溶血性尿毒綜合征、骨髓增生異常綜合征、夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿癥、 骨髓纖維化、各類血細(xì)胞減少癥、純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、過敏性紫癜、原始細(xì)胞增多性 難治性貧血、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、施瓦茨曼（Shwachman)綜合征、鐮形細(xì)胞病、重型地中海貧 血、輕型地中海貧血、血小板減少性紫癜、進(jìn)行外科手術(shù)的貧血癥或非貧血癥患者、創(chuàng)傷相 關(guān)或次生的貧血癥、鐵粒幼細(xì)胞貧血、其他治療次生的貧血，所述其他治療包括:治療HIV的 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素、含環(huán)狀順鉑或不含順鉑的化療藥物、長春花生物堿、有 絲分裂抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑、蒽環(huán)類抗生素、烷基化劑，特別是炎癥、衰老和/或慢 性疾病次生的貧血。PHD抑制還可用于治療貧血的癥狀，包括慢性疲勞、臉色蒼白和頭暈。
[0083] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的分子可用于治療或預(yù)防代謝障礙的疾病，包 括但不限于糖尿病和肥胖癥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的分子可用于治療或預(yù)防 血管障礙。這些障礙包括但不限于低氧或傷口愈合相關(guān)的疾病，其需要促血管發(fā)生介導(dǎo)因 子來進(jìn)行血管發(fā)生、血管生成和動(dòng)脈生成。
[0084] 在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，將有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥劑施用給罹患或診斷有 此類疾病、障礙或病癥的受試者。"有效量"意指足以通常在需要對(duì)指定疾病、障礙或病癥進(jìn) 行這種治療的患者中產(chǎn)生所需的治療或預(yù)防益處的量或劑量。本發(fā)明化合物的有效量或劑 量可通過常規(guī)方法確定，例如建模、劑量遞增研究或臨床試驗(yàn)，和通過考慮常規(guī)因素來確 定，如施用或藥物遞送的方式或途徑，化合物的藥代動(dòng)力學(xué)，疾病、障礙或病癥的嚴(yán)重程度 和病程，受試者之前進(jìn)行和現(xiàn)在進(jìn)行的療法，受試者的健康狀況和對(duì)藥物的響應(yīng)，以及治療 醫(yī)師的判斷。劑量的例子在這樣的范圍內(nèi)：約0.001至約200mg化合物/kg受試者體重/天，優(yōu) 選約0.05至100mg/kg/天、或約1至35mg/kg/天，并采用單一劑量單位或分開劑量單位的形 式(例如每日兩次、每日三次、每日四次）。對(duì)于70kg的人，合適劑量的示例性范圍為約0.05 至約7g/天或約0.2至約2.5g/天。
[0085] 口服片劑可包含與可藥用賦形劑混合的根據(jù)本發(fā)明的化合物，所述賦形劑例如為 惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性填料包 括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露 糖醇、山梨糖醇等。示例性液體口服賦形劑包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、羥基乙酸淀粉鈉、微晶纖維素和海藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可包括淀粉和明膠。 潤滑劑如果存在的話可以是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，片劑可用諸如單硬脂酸甘 油酯或二硬脂酸甘油酯的材料進(jìn)行包衣，以延遲在胃腸道中的吸收，或者可用腸溶衣進(jìn)行 包衣。
[0086] 用于口服施用的膠囊劑包括硬明膠膠囊劑或軟明膠膠囊劑。為制備硬明膠膠囊， 可將本發(fā)明化合物與固體、半固體或液體稀釋劑混合。軟明膠膠囊劑可通過將本發(fā)明化合 物與水、油（例如花生油或橄欖油）、液體石蠟、短鏈脂肪酸的單甘油酯和二甘油酯的混合 物、聚乙二醇400或丙二醇混合來制備。
[0087] 口服施用的液體可以為懸浮劑、溶液、乳劑或糖漿劑的形式，或者可以干燥產(chǎn)品形 式呈現(xiàn)，供臨用前用水或其他合適的溶媒進(jìn)行重構(gòu)。這種液體組合物可任選含有:可藥用賦 形劑如懸浮劑(例如山梨糖醇、甲基纖維素、海藻酸鈉、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、 硬脂酸鋁凝膠等）；非水溶媒，例如油（例如杏仁油或分級(jí)椰子油）、丙二醇、乙醇或水;防腐 劑(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸）；濕潤劑，例如卵磷脂；以及如果 需要的話，還有矯味劑或著色劑。
[0088] 本發(fā)明的活性劑還可通過非口服途徑施用。例如，組合物可配制成栓劑供經(jīng)直腸 施用。對(duì)于腸胃外施用的使用，包括靜脈內(nèi)注射途徑、肌肉內(nèi)注射途徑、腹膜內(nèi)途徑或皮下 注射途徑，本發(fā)明的化合物可以在無菌水溶液或懸浮劑中提供，并緩沖至適當(dāng)?shù)腜H和等滲 性或者在腸胃外可接受的油中提供。合適的含水溶媒包括林格氏溶液和等滲氯化鈉。這類 形式將以單位劑量形式呈現(xiàn)，例如安瓿或一次性注射裝置，以多劑量形式呈現(xiàn)，如可從中抽 取適當(dāng)劑量的小瓶，或者以可用于制備可注射制劑的固體形式或預(yù)濃縮物形式呈現(xiàn)。示例 性的輸注劑量的范圍可在約1至1 OOOyg/kg/分鐘化合物的范圍內(nèi)，與藥用載體在數(shù)分鐘至 數(shù)天的時(shí)間范圍內(nèi)混合。
[0089] 就局部施用而言，化合物可以與藥用載體以約0.1 %至約10%的藥物與溶媒的濃 度混合在一起。例子包括洗劑、霜?jiǎng)?、膏劑等等，并且可通過已知的方法配制。另一種施用本 發(fā)明化合物的方式可采用貼劑來實(shí)現(xiàn)透皮遞送。
[0090] 進(jìn)行鹽選擇評(píng)價(jià)，以確定具有最適于開發(fā)的性質(zhì)的化合物（1)的鹽。被視為對(duì)選擇 過程重要的標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)晶度，重結(jié)晶過程的形式再現(xiàn)性，加速條件下的化學(xué)和物理穩(wěn)定性以 及支持原料藥和藥品開發(fā)的充分溶解性。
[0091] 在實(shí)施例中，化合物被配制為適于施用給需要該化合物的患者的劑型。用于制備 藥物和載體顆粒的方法和設(shè)備公開于Pharmaceutical Sciences，Remington《藥物科學(xué)》， Remington，1985年，第 17版，第1585-1594頁；Chemical Engineers Handbook,Perry《化學(xué) 工程師手冊(cè)》，Perry，1984年，第6版，第21-13至21-19頁（1984) ;Parrot等人，1974年， J.Pharm.Sci.《藥物科學(xué)雜志》，第61卷第6期，第813-829頁；以及Hixon等人，1990年， Chem. Engineering《化學(xué)工程》，第94-103頁中。
[0092]根據(jù)治療適應(yīng)癥和所需的施用周期，如每12小時(shí)、每24小時(shí)等，摻入本發(fā)明的劑型 中的化合物的量通?？稍诮M合物的約10重量％至約90重量％變化。根椐所需待施用的化合 物的劑量，可施用一種或多種劑型。根據(jù)制劑，化合物將優(yōu)選地為乙酸鹽的形式或游離堿形 式。
[0093] 另外，本發(fā)明還涉及上文所述用于人類或非人類動(dòng)物體的治療或診斷方法中的藥 物組合物或藥物劑型。
[0094] 本發(fā)明還涉及用于制造供需要治療的哺乳動(dòng)物口服的藥物劑型的藥物組合物，其 特征在于所述劑型可在一天中任何時(shí)間施用，與所述哺乳動(dòng)物攝入的食物無關(guān)。
[0095] 本發(fā)明還涉及人類或非人類動(dòng)物體的治療或診斷方法，該方法包括對(duì)所述主體施 用治療或診斷有效劑量的本文所述的藥物組合物。
[0096] 本發(fā)明還涉及適于商業(yè)銷售的藥物包裝，所述藥物包裝包括容器、如本文所述的 劑型并帶有所述包裝書寫物，所述包裝書寫物不限于劑型可與食物同時(shí)施用還是不與食物 同時(shí)施用。
[0097] 以下制劑實(shí)例僅為示例性的并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0098] ^Ij
[0099] 制備化合物（1)的5種型式，即游離酸、鈉鹽、鉀鹽、氨基丁三醇鹽和葡甲胺鹽，并且 它們的物理性質(zhì)和可制造性潛能引導(dǎo)了化合物的優(yōu)選形式的選擇。
[0100] E)實(shí)例
[0101]合成為獲得以下實(shí)例中所述的化合物及其相應(yīng)的分析數(shù)據(jù)，除非另外指明，否則 遵循以下實(shí)驗(yàn)和分析方案。除非另外說明，否則在室溫(rt)下磁力攪拌反應(yīng)混合物，溶液通 常在諸如Na2S0 4或MgS04的干燥劑上"干燥"，并且混合物、溶液和提取物通常在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上進(jìn)行減壓"濃縮"。
[0102] 數(shù)據(jù)分析設(shè)置
[0103] 使用默克(Merck)硅膠60F2542 · 5cm X 7 · 5cm 250μπι或5 · 0cm X 10 · 0cm250ym預(yù)涂覆 的硅膠板進(jìn)行薄層色譜法(TLC)。使用具有20cmX4cm濃縮區(qū)的EM Science硅膠60F25420cm X20cm 0.5mm預(yù)涂覆的板進(jìn)行制備型薄層色譜。
[0104] 除非另外說明，否則在硅膠（Si〇2)上用己烷/乙酸乙酯洗脫進(jìn)行正相快速柱色譜 法(FCC)，而在具有菲羅門月神(Phenomenex Luna)Ci8(5ym，4.6X 150mm)柱的惠普(Hewlett Packard)HPLC系列1100上進(jìn)行反相HPLC，在λ = 230、254和280nm處以10%至99%乙腈/水 (0.05%三氟乙酸）的梯度和1毫升/分鐘的流速進(jìn)行檢測5.0分鐘。作為另外一種選擇，在運(yùn) 行Gilson Unipoint LC軟件的吉爾森(Gilson)自動(dòng)HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行制備型HPLC純化，在λ = 220nm處進(jìn)行紫外峰檢測，配有反相YMC-Pack0DS-A(5ym，30X250mm)柱；流動(dòng)相梯度為 10-99%乙腈/水(0.05%三氟乙酸），持續(xù)15-20分鐘，并且流速為10-20毫升/分鐘。
[0105]除非另外指明，否則在配有ESI/APCI正和負(fù)多模式電離源的安捷倫(Agilent)系 列1100MSD上獲得質(zhì)譜(MS)，并且在布魯克(Bruker)型DRX光譜儀上獲得核磁共振(NMR)譜， 其1H NMR數(shù)據(jù)示出四甲基硅烷參照物的低場化學(xué)位移（以ppm為單位）（表觀多重性，耦合常 數(shù)J(以Hz為單位），積分）。
[0106] 實(shí)例1:1-(5,6-二氯-1!!-苯并咪唑-2-基)-1!1-吡唑-4-羧酸(化合物（1))的游離酸
[0107] 12345 方法 A:
2
[0109] 通過使用2,5,6_三氯-1H-苯并咪唑和1H-吡唑-4-羧酸來制備化合物（1)的游離 酸。MS(ESI/CI):對(duì)于(：ηΗ6(η2Ν4〇2計(jì)算的質(zhì)量為297.1;質(zhì)荷比實(shí)測值為296 . (ΚΜ-Η]-。1!! NMR(500MHz，DMS0-d6):14.18-12.52(br s，2H)，8.89(d，J = 0.5Hz，lH)，8.31(d，J = 0.5Hz， lH),7.80(s,2H)〇 3 方法 B: 4 步驟A:5,6-二氯-1,3-二氫-苯并咪唑-2-酮：向4,5-二氯-苯-1,2-二胺（25g， 0.14mol)在干燥的DMF(200mL)中的溶液加入固體形式的CDI (23g，0.14mol)。將反應(yīng)溶液在 室溫下攪拌1小時(shí)，然后加入水(500mL)。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，徹底干燥，以 得到標(biāo)題化合物(26.0g，90%)。粗產(chǎn)物在以下反應(yīng)中使用，無需進(jìn)一步純化。 5 步驟b : 2，5，6-三氯-1H-苯并咪唑：將徹底干燥的5，6-二氯-1，3-二氫-苯并咪唑-2-酮(28.4g，0.14mo 1)混懸于P0C13 (75mL)中。將反應(yīng)溶液加熱至回流溫度并持續(xù)3小時(shí)，然 后冷卻至室溫。將溶液緩慢倒入碎冰/水（1.5L)，同時(shí)充分?jǐn)嚢?。用NaOH將溶液中和至pH = 7.0。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，并干燥，以得到標(biāo)題化合物(27.9g，90%)。粗產(chǎn) 物在以下反應(yīng)中使用，無需進(jìn)一步純化。
[0113] 步驟C: 1-(5,6-二氯-1-二甲胺基磺?；?1H-苯并咪唑-2-基)-1Η-吡唑-4-羧酸乙 酯。將2，5，6-三氯-1H-苯并咪唑2(27.6g，0.125mol)溶解于干燥DMF(200mL)中，然后加入 1( 2(：03(20.78,0.15111〇1)和二甲胺基磺酰氯（17.98,0.125111〇1)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌 16小時(shí)。HPLC分析顯示2，5，6-三氯-苯并咪唑-1-磺酸二甲基酰胺完全形成。在相同反應(yīng)釜 中，在不分離2，5，6-三氯-苯并咪唑-1-磺酸二甲基酰胺的情況下，加入1H-吡唑-4-羧酸乙 酯（17 · 5g，0 · 125mol)和K2⑶3(20 · 7g，0 · 15mo 1)。將反應(yīng)混合物在70°C下攪拌4小時(shí)，并在反 應(yīng)溶液仍然溫?zé)岬臅r(shí)候加入水(500mL)。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫。通過過濾收集沉淀的固 體，用水洗滌，并干燥。粗產(chǎn)物在以下反應(yīng)中使用，無需進(jìn)一步純化。
[0114] 步驟D: 1-(5,6-二氯-1H-苯并咪唑-2-基)-1Η-吡唑-4-羧酸。將粗制的1-(5,6-二 氯-1-二甲胺基磺?；?1H-苯并咪唑-2-基)-1Η-吡唑-4-羧酸乙酯溶解于THF(125mL)中，加 入Li0H · H20 (21 g，0.5mo 1)的水溶液(250mL)。將反應(yīng)混合物在回流溫度下攪拌2小時(shí)并冷 卻至室溫。加入濃HC1以調(diào)節(jié)pH至2.0。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌并干燥。將固體 在熱EtOAc(lL)中磨碎。在冷卻至室溫并過濾后，獲得黃褐色固體形式的式（I)的化合物 (18.5 8,50%)。]\^[]\1+!1]+實(shí)測值為297.0。1!1匪1?(5001抱，015〇-(16) :13.71(8，1!〇，12.99(8， 1H)，8.90(s，1H)，8.32(s，1H)，7.94(s，1H)，7.67(s，1H)。
[0115] 6.0g每批的化合物（1)的游離酸的熱性質(zhì)、晶體性質(zhì)、表觀純度和水分吸收匯總于 表1中?；衔?1)的飽和度數(shù)據(jù)示于圖1中。
[0116] 表1
[0117]
[0118] a 分解
[0119] 實(shí)例2:化合物(1)的鉀鹽
[0120] 通過在回流溫度下將游離酸（55g，1.7mol)混懸于EtOH(l. 5L)中，并在5分鐘內(nèi)逐 滴加入K2C〇3( 12 · 79g，0 · 85mol)的20mL水溶液來制備1-(5，6-二氯-1H-苯并咪唑-2-基)-1Η-吡唑-4-羧酸的鉀鹽。需要強(qiáng)力機(jī)械攪拌來確保適當(dāng)攪動(dòng)。將混懸液在回流溫度下攪拌8小 時(shí)，然后在5小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。通過過濾收集沉淀的固體，并用100mL水然后用EtOH快速洗 滌。獲得白色固體狀鉀鹽(38g，65%)。隨后，濃縮母液并重復(fù)一次上述過程，從而得到第二 批鉀鹽（13 8,22%)。]\^[]\1+!1] + = 297.0。1!1匪1?(5001抱，015〇-(16):8.65(8，1!〇,7.96(8，1!〇， 7.57(s,2H)〇
[0121] 通過上述再漿化方法制備的鉀鹽為非吸濕性的并且與通過PXRD和熱分析觀察到 的不良結(jié)晶水合物一致。通過DSC觀察到化合物（1)的鉀鹽的2個(gè)較寬的吸熱峰，它們可分別 與脫水事件和熔化/分解相關(guān)(表2)。
[0122] 整
[0123] d 分解
[0124] 實(shí)例3:化合物(1)的鈉鹽
[0125] 化合物（1)的鈉鹽是不良結(jié)晶的含水固體，如通過PXRD和熱分析所示。DSC顯示出2 個(gè)較寬的吸熱峰;第一事件與失水(通過TGA測得為約9%)相關(guān)，而第二吸熱峰由鹽的熔化/ 分解導(dǎo)致。以與用于制備鉀鹽(漿化方法)的方法類似的方法制備鈉鹽。
[0126] 實(shí)例4:化合物(1)的氨基丁三醇鹽的結(jié)晶工序
[0127] 迄今為止已制得兩種形式的氨基丁三醇鹽。第一形式通過化合物（1)和氨基丁三 醇在含水乙醇（14%水）中的漿液獲得。雖然不是鹽，但該物理混合物并非要尋求的。第二形 式由包含過量的抗衡離子的含水后處理(aqueous workup)制得。該形式為水合鹽，據(jù)觀察 該水合鹽具有比鉀鹽更低的表觀水溶性。該化合物還表現(xiàn)出較弱的體性質(zhì)。
[0128] 實(shí)例5:化合物(1)的葡甲胺鹽的結(jié)晶工序
[0129] 在微熱后在含水甲醇（12 %水）中制備化合物（1)的游離酸和1.2摩爾當(dāng)量的葡甲 胺的澄清溶液(30mg/mL)。在存在晶種的情況下室溫?cái)嚢杌蛟诖嬖诨虿淮嬖诰ХN的情況下 冷藏始終導(dǎo)致葡甲胺鹽結(jié)晶，該葡甲胺鹽通過過濾收集。使用該方法制備2g-批的鹽。將上 述過程中的溶劑組合物改為含水乙醇，并由PDMS API SM開發(fā)組用于制備8.7kg GMP級(jí)材料 以支持進(jìn)入首次人體試驗(yàn)和首次人體試驗(yàn)研究。
[0130] 化合物（1)的葡甲胺鹽的熱性質(zhì)、晶體性質(zhì)和表觀純度匯總于表3中。圖2和3示出 了化合物（1)的葡甲胺鹽的鹽體性質(zhì)，分別包括PXRD數(shù)據(jù)和DSC、TGA和X射線數(shù)據(jù)。單晶數(shù)據(jù) 證明化合物（1)的葡甲胺鹽為二水合物，其模擬粉末圖樣與如圖4A和4B中所示實(shí)驗(yàn)粉末圖 樣具有極好的一致性。據(jù)觀察，與化合物（1)的游離酸或鉀鹽相比，化合物（1)的葡甲胺鹽具 有改善的體性質(zhì)、溶解性和提高的可加工性。
[0131] 表3
[0132]
[0133] 實(shí)例6:化合物(1)的葡甲胺鹽的局部用制劑
[0134] 用于開發(fā)化合物（1)的葡甲胺鹽的局部用制劑的材料和賦形劑列于表4中。
[0135] 產(chǎn)|
[0136]
[0137] *由于賦形劑的熱可逆性在5°C下溶解
[0138] 表5列出了化合物（1)的葡甲胺鹽的選擇制劑在儲(chǔ)存4周后表現(xiàn)的物理和化學(xué)穩(wěn)定 性結(jié)果。
[0139] 表5:
[0140]
123 *在小瓶中觀察到沉淀 2 HPLC分析顯示，6種制劑組合物在所研究的儲(chǔ)存條件下的化學(xué)穩(wěn)定性維持4周。基 于泊洛沙姆的制劑(實(shí)驗(yàn)4)的質(zhì)量平衡的表觀損失歸因于化合物（1)的游離酸在40°C下沉 淀并且未降解。在40°C下，聚合物降解，這導(dǎo)致乙酸、醛類形成，同時(shí)粘度喪失并且pH下降。 所得酸性環(huán)境導(dǎo)致化合物（1)的不可溶游離酸沉淀以及制劑變色。泊洛沙姆(或lutrol)的 不穩(wěn)定性為已知的并且已公開于Erlandsson，B.，2002，Polym.Degrad.and Stab. ,78:571-575(Erlandsson，B.，2002年，《聚合物降解和穩(wěn)定性》，第78卷，第571-575頁）中。在室溫下 存儲(chǔ)或冷藏的樣品中未觀察到這種降解。 3 化合物（1)的葡甲胺鹽的制劑的溶解性篩查的結(jié)果示于表6中。所研究的10種溶媒 中的4種，即1 %Na-CMC(實(shí)驗(yàn)1)、1 %卡波姆941 (實(shí)驗(yàn)2)、1 %卡波姆934P(實(shí)驗(yàn)3)和20%HP- β-CD(實(shí)驗(yàn)4)不滿足lOmg/mL(游離酸當(dāng)量）的目標(biāo)溶解性標(biāo)準(zhǔn)或者對(duì)海拉細(xì)胞有毒。1%MC 溶媒對(duì)于含有2%MC的產(chǎn)品不具有顯著的優(yōu)勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)5和7-11中，化合物(1)的葡甲胺鹽在 可接受的pH范圍(6-8.5)內(nèi)是充分溶解的。
[0144] 表6:
[0145]
[0146] *制劑對(duì)海拉細(xì)胞有毒
[0147] F)生物學(xué)實(shí)例
[0148] HIFl-α的細(xì)胞測定
[0149] 將海拉細(xì)胞（美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC， Manassas，VA))以20，000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中，每孔具有100μΙ的DMEM，其中含有10% 胎牛血清、1%非必需氨基酸、50IU/mL的青霉素和50yg/mL的鏈霉素(所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑均 得自加利福尼亞州卡爾斯班的英杰公司（Invitrogen,Carlsbad，CA))。接種后24小時(shí)，將培 養(yǎng)基更換為不含10%胎牛血清的1〇〇μ1的DMEM，加入每種化合物的Ι.?μL儲(chǔ)備溶液并溫育6 小時(shí)。所有化合物均以1〇〇μΜ的最終化合物濃度測試。移除上清液并在55J含有蛋白酶抑制 劑的MSD裂解緩沖液中裂解細(xì)胞。然后將50μ1細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到封閉的MSD人HIF-la檢測板 (馬里蘭州蓋瑟斯堡MSD公司（Meso-Scale Discovery，Gaithersburg，MD)，根據(jù)制造商方 案），并在軌道式振蕩器上在室溫下溫育2小時(shí)。在PBS中洗滌3次后，加入25μ1的20nM抗HIF1 α檢測抗體，并在軌道式振蕩器上在室溫下溫育1小時(shí)。在roS中洗滌3次后，加入150μ1的IX 讀板緩沖液，然后在MSDSECT0R儀器上進(jìn)行讀板。通過確定在存在100μΜ化合物的情況下相 對(duì)于測定對(duì)照化合物7-[(4_氯-苯基）-(5-甲基-異噁唑-3-基氨基）-甲基]-喹啉-8-醇的 HIF刺激的百分比，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析?；衔?1)的葡甲胺鹽的該生物學(xué)數(shù)據(jù)示于圖5中。
[0150] 化合物(1)的葡甲胺鹽的制劑的附加生物學(xué)數(shù)據(jù)示于圖6至8中。
[0151] 盡管上述說明書教導(dǎo)了本發(fā)明的原理，以示例為目的提供了實(shí)例，但應(yīng)該理解本 發(fā)明的實(shí)施涵蓋落入所附的權(quán)利要求及它們的等同形式的范圍內(nèi)的所有通常的變型形式、 改變形式和/或修改形式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制劑，包含1-(5,6_二氯-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-lH-吡唑-4-羧酸的葡甲胺鹽。2. -種下式的化合物，其為葡甲胺鹽的形式。3. -種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物和可藥用賦形劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述葡甲胺鹽為二水合物的形式。5. -種局部用膏劑，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述葡甲胺鹽為二水合物。
【文檔編號(hào)】A61K31/4184GK106038556SQ201610488118
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2012年10月25日
【發(fā)明人】K.塞帕斯, M.C.里茲佐里奧
【申請(qǐng)人】詹森藥業(yè)有限公司