專利名稱：新的過氧化氫酶、其基因及包含其的組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的過氧化氫酶及其應用，以及一種制備過氧化氫酶的方法。具體而言，本發(fā)明提供了一種克隆自耐熱性芽孢桿菌(Bacillusthermoglucosidasius)的新的過氧化氫酶，包含該過氧化氫酶的組合物，以及一種利用基因工程的方法克隆過氧化氫酶基因、構建其表達質粒、轉化細胞以獲得高產量的過氧化氫酶的方法。
過氧化氫(H2O2)，俗稱雙氧水，其具有殺菌、清潔、漂白及消毒功效，因而常用于隱形眼鏡的消毒液及織物的漂白劑中，且是合法的食品添加劑。但是過氧化氫容易產生高活性的游離氧，強烈的氧化作用會使蛋白質變性，所以不論用過氧化氫消毒隱形眼鏡或漂白織物，最后都必須分解殘留的過氧化氫，以防止過氧化氫對使用者的傷害。
為了上述目的，業(yè)界常利用過氧化氫酶來分解殘留的過氧化氫，此亦公認為最有效率的方法。例如USP4,585,488,USP5,145,644,USP5,362,647,USP5,521,091即揭示了在隱形眼鏡的消毒過程中添加過氧化氫酶以分解消毒液中殘留的過氧化氫。另外，GB2216149及JP-A-104781等專利亦曾揭示在以過氧化氫漂白布料后，須經(jīng)過氧化氫酶處理以分解殘留的過氧化氫，最后再進行染色。
過氧化氫酶[過氧化氫的氧化還原酶(EC11.11.1.6)]可將兩分子的過氧化氫(H2O2)氧化成一分子氧(O2)及還原成兩分子水(H2O)，其催化反應式如下過氧化氫酶過氧化氫酶存在于自然界的某些動、植物及微生物細胞中，為此類細胞存活于含氧環(huán)境中所必需具備的酶。目前過氧化氫酶的制備大都由此類細胞經(jīng)純化而來。尤其從牛肝純化而來的過氧化氫酶更是業(yè)界最常使用的過氧化氫酶。但因歐洲牛群于1990年暴發(fā)慢性病毒疾病，即俗稱的瘋牛病(BSE)，且已有研究顯示此病可能會傳染給人類(Dealler及Lorey 1991 Nutr.Health(Bicester)7:117-134,Dealler及Lacey 1990,Food Microbio 17:253-280)，因此產業(yè)界逐漸傾向以非哺乳動物來源的過氧化氫酶，例如微生物來源的過氧化氫酶來取代牛肝過氧化氫酶。
已知可發(fā)酵產生過氧化酶的微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)、點青霉(penicillium notatum)及藤黃微球菌(Micrococcus luteus)等。例如，USP3123539曾揭示自黑曲霉及點青霉等真菌獲得過氧化氫酶；USP2,635,069、5,360,732及WO93/17721揭示以黑曲霉生產過氧化氫酶；而USP5521091則揭示源自藤黃微球菌及黑曲霉的過氧化氫酶。上述專利的過氧化氫酶都是傳統(tǒng)方法，經(jīng)由發(fā)酵特定微生物、打破菌體，再加以純化而來。
然而，以此等發(fā)酵方式所獲得的過氧化氫酶產量皆極低，例如根據(jù)美國專利USP3,123,539報告，將95磅濕重藤黃微球菌菌體經(jīng)蛋白回收后所得1000克產物中，僅含5％的過氧化氫酶；而根據(jù)美國專利USP,2,635,069報告，由黑曲霉所獲得的粗蛋白萃取物每克僅有2.4單位活性的過氧化氫酶。為了提高過氧化氫酶的產量，USP5,360,732曾針對黑曲霉進行菌種改良，使其每毫克粗蛋白萃取物可達到14.17單位活性，然而若依WO93/1772表1所報告的黑曲霉過氧化氫酶的比活性每微克約7.5單位活性計算，此14.17單位活性是由1.9微克的過氧化氫酶所表現(xiàn)，換言之，由USP5,360,732所獲得的粗蛋白萃取物，亦僅含有少于0.2％的過氧化氫酶。
Shuichi Furuta與Hiroaki Hayashi于J.Biochem.107,708-713(1990)中揭示以基因工程技術表達重組的大鼠過氧化氫酶基因。然而其產量亦不高，在經(jīng)純化前僅有約16毫克/4升。
由上觀之，目前產業(yè)界所使用的過氧化氫酶，不論是在來源及制備方法方面皆仍有極大的改良空間。
本發(fā)明的目的即在于克隆一種新的過氧化氫酶。
本發(fā)明進一步的目的在于提供一種利用基因工程方法制造微生物來源的過氧化氫酶的方法。根據(jù)本發(fā)明方法所制得的過氧化氫酶不但產量極高，且活性亦極佳。
本發(fā)明亦提供了本發(fā)明方法中所構建的新的重組質粒及轉化細胞。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種用于分解隱形眼鏡上殘余消毒液中過氧化氫的組合物，其包含本發(fā)明的新的過氧化氫酶。


圖1pET20b/kat19表達質粒的構建。
圖2過氧化氫酶kat19基因的DNA序列。
圖3pET15b/kat19表達質粒的構建。
圖4pET20b/katTG表達質粒的構建。
圖5過氧化氫酶katTG基因的DNA序列。
圖6過氧化氫酶TG的氨基酸序列。
圖7pET20b/katHP11表達質粒的構建。
圖8過氧化氫酶HP11基因的DNA序列。
圖9各轉化菌株表達過氧化氫酶的12％聚乙酰胺凝膠電泳分析圖，由左到右依次為pET15b,pET15b/kat19,pET20b,pET20b/kat19,pET20b/katTG,pET20b/katHP11轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株后，表達過氧化氫酶的圖譜。
圖10純化的過氧化氫酶的12％聚乙酰胺凝膠電泳分析圖，由左到右分別由pET15b/kat19,pET20b/kat19,pET20b/katTG,pET20b/katHP11轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞所純化的過氧化氫酶。
本發(fā)明所提供的新的過氧化氫酶是利用Bol及Yashin,Gene109,31-37(1991)所揭示的枯草芽孢桿菌過氧化氫酶基因(kat19)的5’及3’端DNA序列合成適當?shù)?’及3’引物后，自耐熱性芽孢桿菌(Bacillusthermoglucosdasius)所克隆而得，其基因的DNA序列如圖5所示，與kat19基因的相似性為74.4％。將該基因插入適當?shù)谋磉_載體，再轉化宿主細胞令其表達后，即得本發(fā)明的新的過氧化氫酶，其氨基酸序列示于圖6。本發(fā)明的新的過氧化氫酶未曾由任何文獻揭示。
本發(fā)明亦提供了一種利用基因工程技術制備過氧化氫酶的方法，其包含(a)將編碼該過氧化氫酶的基因嵌入含適當轉錄啟動子的表達載體上以構建重組質粒；(b)將該重組質粒轉化到適當?shù)乃拗骷毎?c)于適合該轉化細胞表達過氧化氫酶基因的條件下培養(yǎng)該轉化細胞；及(d)純化所表達的過氧化氫酶蛋白質。
本發(fā)明的方法除可生產前述的新的過氧化氫酶外，亦適用于克隆其它微生物來源的過氧化氫酶。詳言之，本發(fā)明方法是以基因庫中各種微生物的過氧化氫酶基因的DNA序列為基礎設計出適當?shù)囊铮灾當U增微生物染色體中的過氧化氫酶基因、構建表達載體、轉化宿主細胞，并令其表達而制得可用于本發(fā)明方法的“微生物”是指含有過氧化氫酶基因的任何微生物，較佳為細菌，例如枯草芽孢桿菌(如CCRC910064)、大腸桿菌(如CCRC51731)、假單胞菌(如CCRC292607)、藤黃微球菌(如CCRC11034)，以及生產本發(fā)明新的過氧化氫酶的耐熱性芽孢桿菌(如CCRC14687)等，并不特定限于何者，本領域技術人員可依自身需要加以選用。
源自微生物的過化氫酶基因可藉現(xiàn)有技術方法予以擴增，例如聚合酶鏈反應(簡稱PCR)。聚合酶鏈反應是自1980年代以來常用的一種擴增特定基因序列的技術(如USP4,683,195,4,683,202等)，其實施步驟首先是自生物樣本中分離出靶核酸序列，將其雙鏈打開，再以依靶基因兩端序列所合成的引物進行雜交，利用聚合酶在適當量的脫氧核苷三磷酸(如dATP、dGTP、dCTP及dTTP等)的存在下進行擴增。所需的反應參數(shù)及試劑皆為本領域技術人員所熟知的。上述的聚合酶鏈反應可以逐步操作，然而較常見者是以商購的自動化裝置(溫度循環(huán)儀)進行。
擴增所得的過氧化氫酶基因是以公知方法插入適當?shù)谋磉_載體中，包括任何可用于細菌、酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞表達系統(tǒng)的表達載體，例如pBR、pUC、pUB或pET系列的質粒。本領域技術人員可依其慣用者或視需要選用。
構建完成的表達載體隨后轉化適當?shù)乃拗骷毎⒘钇浔磉_?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細胞包括細菌(如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等)、酵母(如釀酒酵母)、哺乳動物細胞(如小鼠纖維母細胞)，或是昆蟲細胞等。其中較佳為細菌細胞表達系統(tǒng)，特佳則為大腸桿菌。轉化的宿主細胞株于便利該外來質粒大量表達的條件下培養(yǎng)，最后將所欲蛋白質產物予以分離。根據(jù)本發(fā)明所獲得的粗蛋白萃取物中約含15～50％的具活性的過氧化氫酶。再依常法，如組氨酸親合層析法或丙酮沉淀法予以純化后，可得到約95％純度的過氧化氫酶。
由本發(fā)明方法制備過氧化氫酶，不但操作簡易且成本低廉，產量亦遠較已有發(fā)酵方法所得者為高，活性亦極佳，十分適于作為分解過氧化氫的組合物，尤其是用于清除殘留于隱形眼鏡上過氧化氫的組合物。
因此，本發(fā)明亦提供了由本發(fā)明的新的過氧化氫酶所組成的用于分解殘留于隱形眼鏡上的過氧化氫的組合物。
制備包含本發(fā)明過氧化氫酶產物的組合物的方法，其組成及使用方法皆是本領域技術人員所熟知的，例如可參考諸多文件的記載，如USP5,521,091,5,362,647,5,145,644,4,585,488等。這種組合物可制成溶液的形式，或是呈固體組合物的形式，如錠劑、膠囊等。
在本發(fā)明組合物的一實施方案中，其是包含一水性等張液體基質，內含本發(fā)明的過氧化氫酶。此等水性等張液體基質較佳包含可有效控制pH值的量的常規(guī)緩沖成分，更佳可控制液體基質的pH值的量的常規(guī)的緩沖成分，更佳可控制液體基質的pH于3至10左右的范圍內，例如約6至8。
過氧化氫酶的量優(yōu)選是足以分解所有存在于消毒隱形眼鏡的含過氧化氫基質中的過氧化氫，且需不損壞隱形眼鏡本身且不影響配戴的安全與舒適性。一般而言，其量可在10至1000，較佳為20至800過氧化氫酶活性國際單位/毫升液體基質的范圍內。
本發(fā)明組合物的另一實施方案是固體組合物，其可呈錠劑、膠囊、一或多個固體顆粒等形式。此等固體組合物包括一經(jīng)涂層的部分(如核心體)，以及一障壁物質或延遲釋放成分。本發(fā)明的過氧化氫酶即內含于該經(jīng)涂層部分(或核心體)中。而該障壁物質(包括水溶性的乙烯系聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等、水溶性蛋白質、多糖類及纖維素衍生物，如甲基纖維素等)可使本發(fā)明組合物在與含過氧化氫基質接觸時能延緩其過氧化氫酶的釋出，令過氧化氫有充分時間消毒隱形眼鏡。其詳細的組成皆在上文提及的參考文獻中詳述。
為使本發(fā)明的內容更為明確，茲以下列非限制性實施例進一步詳細說明。
實施例1 pET20b/kat19表達質粒的構建枯草芽孢桿菌染色體DNA的提取首先將10克Bacto-胰蛋白胨、5克Bacto-酵母萃取物及10克NaCl溶于1公斤的去離子水中，以1N NaOH溶液調整酸堿度至pH7.5，高壓滅菌待其冷卻制得Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)液若添加50毫克/毫升的氨芐青霉素溶液2毫升即為LB/Amp培養(yǎng)液。
將3毫升配制所得的LB培養(yǎng)液于攝氏37度震蕩培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus,CCRC 910064),24小時后以5000rpm離心15分鐘，以水清洗菌體一次，再次離心后倒掉上清液，加入0.75毫升水并加入0.75毫升苯酚萃取30分鐘，以12000rpm離心15分鐘，取出上層液后再加入0.75毫升苯酚萃取30分鐘，12000rpm離心15分鐘后取出上層液再以0.75毫升氯仿萃取15分鐘，12000rpm離心，取出上清液后加入2倍體積乙醇，離心15分鐘(12000rpm)，沉淀DNA，以75％乙醇洗一次，再用TE緩沖液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA)溶解染色體DNA。
枯草芽孢桿菌過氧化氫酶基因(kat-19)的擴增5’端及3’端引物的合成根據(jù)Bol及Yashin,Gene 109,31-37(1991)所揭示的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,YB2003)過氧化氫酶基因序列(kat-19，示于圖2)的5’端及3’端DNA序列，合成5’端引物NdeⅠ-kat19(+)，其DNA序列如下T T C A T A T G A G T T C A A A T A A A C T G A C A A C T此序列含NdeⅠ限制酶序列；以及3’端引物kat19-XhoⅠ(-)，其DNA序列如下T T C T C G A G T T A A G A A T C T T T T T T A A T C G G C A A此序列含XhoⅠ限制酶序列。
聚合酶鏈反應(PCR)取0.5微克枯草芽孢桿菌染色體DNA，加入10微升2.5mM dNTPs,10微升10×PC2緩沖液(50μM Tris-HCl,pH9.1,16mM硫酸銨，3.5mM MgCl2及150微克/毫升BSA),10微升的0.2微克/毫升5’端引物，1.0微升的0.2微克/毫升3’端引物，78微升水及1.0微升的5U/微升klentaq(AB peptides公司)后，再加入50微升礦物油于上層。設定溫度循環(huán)儀(Robocycle,STRATAGENE公司)的反應參數(shù)如下攝氏94度1分鐘，1個循環(huán)；攝氏94度×30秒，攝氏54度×1分鐘，攝氏72度×1.5分鐘等為一個循環(huán)，共反應30個循環(huán)。聚合酶鏈反應后，以QI A quick Spm PCR純化試劑盒(QI AGEN公司)純化聚合酶鏈反應的產物，以100微升水沖提出產物，用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳分析和溴化乙錠染色觀察，確定擴增所得DNA片段的大小如同預期，亦即約1.5kb。pE T20b/kat19表達質粒的構建(圖1)
以NdeⅠ及XhoⅠ限制性酶于攝氏37度下反應3小時，酶切PCR產物，利用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，切出約1.5kb片段，再以電泳沖提出DNA片段，續(xù)以QI A quick Spm PCR純化試劑盒純化DNA。純化后的DNA用T4DNA連接酶于攝氏16度下反應16小時，將其連接到已用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶切開的pET-20b表達載體(Novogen公司)上，將連接反應后的混合物轉化DH5α菌株，經(jīng)篩選得到較pET20b為大的質粒，再經(jīng)由限制性酶分析并利用Sanger’s方法與Sequence Version 2.0 DNA測序試劑試盒(購自United States Biochemical公司)，以T7啟動子序列(ATTAATACGACTCACTATAGG)為引物，測定DNA序列，確定克隆到的1.5kb DNA片段為kat-19基因，而完成pET20b/kat1 9表達質粒的構建，并于1997年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC209467。實施例2 pET15b/kat1 9表達質粒的構建(圖3)利用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶自pET20b/kat1 9表達質粒上切下kat-19基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下1.5kb的DNA片段，以電泳沖提并用QI A quick Spin PCR純化試劑盒來純化DNA。經(jīng)純化的DNA用T4DNA連接酶于攝氏16度下反應16小時，連接到已用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶切開的pET-15b表達載粒上，構建成pET15b/kat1 9表達質粒。利用T7啟動子序列為引物，測定5’端DNA序列，確定已克隆完成pET15b/kat1 9表達質粒。該質粒已于1997年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC 209469。實施例3 pET20b/katT G表達質粒的構建(圖4)于攝氏55度下培養(yǎng)耐熱性芽孢桿菌(B acillus thermoglucosdasius,CCRC 14687)，依實施例1的方法由培養(yǎng)菌體中抽取耐熱性枯草芽孢桿菌的染色體DNA。為了擴增其過氧化氫酶基因，首先合成其3’端引物(kat TG-XhoⅠ(-))，其DNA序列如下
T T C T C G A G T T A A G A A T C T T T T T T A A T C G G C A A除此之外，其余材料與方法皆與實施例1所述擴增kat1 9基因的步驟相同。經(jīng)聚合酶鏈反應后，得到1.5kb大小的DNA片段。將此DNA片段予以純化后，與XhoⅠ限制酶于攝氏37度下反應2小時，再次純化后，于4℃下保存。
于攝氏37度下以NdeⅠ限制酶酶切pET20b表達載體，反應2小時并純化后，以klenow酶補平，再次純化后以XhoⅠ限制酶于攝氏37度反應2小時，用0.8％瓊脂糖凝膠分離DNA，切下3.7kbDNA片段再以電泳法將之沖提出后，續(xù)用QLA quick Spin PCR純化試劑盒純化該DNA片段，得到NdeⅠ位置被補平且XhoⅠ位置被切開的pET20b載體。將此載體與前述的1.5kb片段于攝氏16度下用T4DNA連接酶進行連接反應16小時后，轉化DH5α細胞。經(jīng)篩選后抽取質粒，得到pET20b/katTG表達質粒，利用Sanger′s方法并以Sequence version2.0測序試劑盒測定所克隆的DNA片段的序列(其DNA序列如圖5所示)，其與kat1 9相似性為74.4％。經(jīng)轉譯所得蛋白質的氨基酸序列如圖6所示，其與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的植物性過氧化氫酶(vegetative catalase)相似性則為81.0％。
上述的pET20b/kat TG質粒已于1997年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC209468。實施例4 pET20b/katH P11表達質粒的構建(圖7)依實施例1的方法抽取大腸桿菌DH5α(CCRC 51731)的染色體DNA。然后根據(jù)J.B acteriol 173,514-520所揭示大腸桿菌HP11基因的DNA序列(如圖8)合成5’端引物(NdeⅠ HP11(+))，其序列如下T C C C A T A T G T C G C A A C A T A A C G A A A A G A A C此引物中含NdeⅠ限制酶序列。另合成3’端引物(HP11-XhoⅠ-(-))，其序列如下T T T C T C G A G G G C A G G A A T T T T G T C A A T C T T A G G此引物中含XhoⅠ限制酶序列。以大腸桿菌DH5α(CCRC 51731)染色體DNA為樣本，按照實施例1的聚合酶反應條件擴增HP11基因(其中除將引物的延伸時間改為2分鐘外，其余條件皆與實施例1相同)，得到如預期的2.0kb大小的DNA片段。
依照實施例1的方法，構建pET20b/katHP11表達質粒，經(jīng)限制酶切及DNA測序，確定所克隆到的2.0kbDNA片段為HP11基因。該質粒已于197年11月18日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC209470。實施例5過氧化氫酶的表達將pET20b、pET15b、pET20b/kat1 9、pET20b/katTG及pET20b/katHP11表達質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，然后以20毫升LB/Amp培養(yǎng)液于攝氏37度下震蕩培養(yǎng)至O.D.600=2.0時，加入0.1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導過氧化氫酶表達，24小時后收集菌體。取1.5毫升菌液，離心并倒掉上清液，加入150微升之50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)于菌體中，再加入150微升的2倍電泳蛋白染料(其配方為0.1M二硫蘇糖醇、20％SDS、0.08M Tris-Cl,(pH6.8)、15％甘油及0.06％溴酚藍)，混合后于攝氏95度下加熱5分鐘再以12000rpm離心5分鐘，取上層液20微升以12％聚乙酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析菌體總蛋白。分析結果如圖9所示，由左至右分別為pET15b,pET15b/kat19,pET20b,pET20b/kat19,pET20b/kat TG,pET20b/HP11轉化BL2.1(DE3)菌株后所表達過氧化氫酶的情形。由圖9結果可知過氧化氫酶之量約占菌體總蛋白的15～50％，亦即這些含過氧化氫酶基因表達載體的宿主細胞皆可生產大量的過氧化氫酶。實施例6枯草芽孢桿菌過氧化氫酶之純化將pET20b/kat19表達質粒轉化的BL21(DE3)菌株接種于100毫升LB/Amp培養(yǎng)液中，于攝氏37度下震蕩培養(yǎng)至O.D.600=2.0。加入0.1mM IPTG誘導24小時，離心后倒掉培養(yǎng)液，以10毫升，pH6.4的50mM磷酸鈉緩沖液懸浮菌體。再以超聲波震蕩破碎菌體，以12000rpm離心15分鐘，沉淀菌體碎片再取出上清液后，于攝氏4度下加入等量丙酮于菌胞液中，混合30分鐘，再倒掉上清液，以10毫升的pH6.4的50mM磷酸鈉緩沖液溶解沉淀物，靜置于攝氏4度中12小時，再以5000rpm離心5分鐘，取出上層液而完成純化。
另外，將含pET15b/kat1 9,pET20b/katTG,pET20b/katHP11表達質粒的BL(DE3)菌體，接種子100毫升LB/A mp培養(yǎng)液中，于攝氏37度下震蕩培養(yǎng)到O.D.600=2.0時，加入0.1mMIPTG后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，離心，倒掉培養(yǎng)液，加入20毫升I MAC-5(20mM Tris HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10％甘油及5mM咪唑)懸浮菌體后，再以超聲波震蕩破碎菌體，離心，沉淀菌體碎片，取出上層液，以2.5毫升的組氨酸結合親合層析劑(His-Bind resin,Novogen公司)純化過氧化氫酶，其純化步驟完全依據(jù)Novogen公司所建議步驟(pE T His T ogTMSystemProtocols,Novogen公司)。
蛋白質及活性測量方法如下蛋白質量的測定是以牛血清白蛋白(Bovineserum albumin)為標準品，用Bio-RAD公司出品的蛋白質定量試劑及方法測定。過氧化氫酶活性測定是在攝氏25度pH7.0的50mM磷酸鈉緩沖液中，以UV240nm測量溶液中過氧化氫被過氧化氫酶分解的速率，緩沖液中過氧化氫的起始濃度為20mM，測量時距則為20秒。每單位活性(U)定義為每分鐘分解1微摩爾的過氧化氫。
依上述方法測定所純化各種過氧化氫酶的量及活性，并各取5微克以12％聚乙酰胺凝膠電泳分析其純度，結果如圖10所示，由左而右依次為蛋白質標準品，pET15b/kat19,pET20b/kat19,pET20b/kat TG,pET20b/kat HP11表達質粒所表達的過氧化氫酶，其純度皆達95％。這些過氧化氫酶之比活性如下表達質粒比活性(U/微克)pET15b/kat19 18-22pET20b/kat19 18-22pET20b/katTG 30-40pET20b/katHP1110-14由上表可知，本發(fā)明所制備的各種過氧化氫酶皆具有良好活性，且其比活性皆較市售之黑曲霉過氧化氫酶為佳(依Merck公司之目錄，黑曲霉過氧化氫酶約為5U/微克；而依SIGMA公司之目錄，黑曲霉過氧化氫酶則約為4-8U/微克。)實施例7分解隱形眼鏡消毒水中所含過氧化氫之功效一般市售的隱形眼鏡消毒液成分含有3％(w/v)過氧化氫溶液，其消毒步驟是先將隱形眼鏡浸置于10毫升3％(w/v)過氧化氫水溶液中消毒約20分鐘后，將隱形眼鏡由過氧化氫水溶液中取出并放置于10毫升含過氧化氫酶的水溶液中，或將過氧化氫酶加入過氧化氫水溶液中，約10至20分鐘后取出隱形眼鏡并以生理鹽水溶液潤洗后就可配戴。為測試本發(fā)明過氧化氫酶分解隱形眼鏡消毒水中過氧化氫之效力，將本發(fā)明方法所制備的各種枯草芽孢桿菌過氧化氫酶各50微克加入3％(w/v)過氧化氫水溶液中，發(fā)現(xiàn)僅需5分鐘就可有效分解其過氧化氫至低于0.02％(w/v)。其功效顯較市售者為佳。實施例8本發(fā)明的固體組合物制備-層狀錠劑，其具有一核心體，外覆以-延遲釋放層。該層狀錠劑的組成如下核心體氯化鈉89.4毫克磷酸氫二鈉(無水) 12.5毫克磷酸(無水)二氫鈉單水合物 0.87毫克聚乙二醇(分子量約3350)1.05毫克凍干的本發(fā)明過氧化氫酶7020國際單位涂覆層羥丙基甲基纖維素 8毫克實施例9本發(fā)明的溶液組合物制備二單位劑量(10毫升)的本發(fā)明組合物，其組成如下氯化鈉0.85％磷酸氫二鈉(七水合物) 0.402％磷酸二氫鈉單水合物0.091％伸乙二胺四乙酸二鈉0.100％液體的本發(fā)明過氧化氫酶(1)260國際單位/毫升純水 適量(1)液體過氧化氫酶中含35-40％(重量比)的甘油及10％乙醇。
權利要求
1．一種過氧化氫酶基因，其具有如下的核苷酸序列10 20 30 40 50 60ATGAGTTCAA ATAAACTGAC AACTAGCTGG GGAGCACCTG TTGGCGATAA CCAAAACTCG70 80 90100110120ATAACGGCCG GCAATCCTGG CCCGACATTA ATCCAAGACG TACATCTTAT CGAAAAATTA130140150160170180GCACACTTCA ATAGAGAACG TGTCCCAGAA CGTGTTGTCC ATGCGAAAGG CGCTGGTGCG190200210220230240CACGGCTATT TCGAAGTAAC AAACGATATG TCGAAATACA CAAAAGCGAA AGTGTTTAAC250260270280290300GGTGTTGGCA AACGCACGCC TGTATTCGTC CGCTTCTCTA CTGTCGCCGG TGAATTGGGA310320330340350360TCTGCGGATA CAGTCCGCGA CCCGCGCGGT TTTGCCGTCA AATTTTATAC CGAAGAAGGA370380390400410420AACTATGACA TCGTTGGCAA CAACACACCG ATTTTCTTCA TTCGTGATGC GATTAAATTC430440450460470480TCGGATTTTA TCCATACACA AAAACGCGAC CCGCGCACCC ATTTGATTTA TCCGACAGCA490500510520530540ATGTGGGATT TCTTGTCTTT ATCTCCGGAA TCTTTGCACC AAGTCACTTA TTTATTCGGG550560570580590600GATCGCGGCA TCCCATTGAC ATACCGCCAT ATGAACGGAT ACGGAAGCCA TACATTCAAA610620630640650660TGGGTGAATG AAAAAGGCGA AGCGGTATGG GTAAAATACC ACTTTAAAAC AAACCAAGGC670680690700710720GTGAAAAACA TGGATCCGGA ACTAGCGGTT AAAATCGCCG GAGAAAATCC GGATTACCAT730740750760770780ACGGAAGATT TATATAACGC CATCGAAAAA GGCGACTATC CATCTTGGAC ATTATATGTG790800810820830840CAAATTATGC CGTTAGAAGA CGCAAAAACA TACCGTTTCA ATCCATTTGA TGTCACAAAA850860870880890900GTTTGGTCAC ATAAAGATTA TCCGTTAATT GAAGTCGGCC GTATGGTATT AAACCGCAAT910920930940950960CCAGAAAATT ATTTTGCCGA AGTCGAACAA GCGACATTCT CTCCTGGAAA CCTTGTTCCT970980990 1000 1010 1020GGCGTTGAAC CATCGCCGGA TAAAATCTTG CAAGCCCGTT TGTTCGCTTA TGCGGATGCG1030 1040 1050 1060 1070 1080CACCGTTACC GCGTCGGCGT GAACCATAAC TTGCTTCCGA TCAACCGCCC GCGCGTGGAA1090 1100 1110 1120 1130 1140GTAAACAATT ATCAACGTGA CGGCTTCATG CGCTTTGACA ATAATGGCGG CGGTTCGGTC1150 1160 1170 1180 1190 1200AACTACGAAC CAAACAGCTT CGGCGGACCG ACAGAAGTGC CAGAACATAA AACGACCCCA1210 1220 1230 1240 1250 1260TTCCCGGTAT CCGGCGTGGC AGAAAGCGTG CCATATGACG ACGATGATCA TTATACGCAA1270 1290 1290 1300 1310 1320GCAGGCGACT TATACCGTCT CATGAGCGAA GAAGAAAAAG CGCGCCTTGT GAAAAACATT1330 1340 1350 1360 1370 1380GTCGAATCAT TGAAACAAGT AACAAAAGAA GAAATTAAAC TTCGCCAAAT CCGCCACTTC1390 1400 1410 1420 1430 1440TACAAAGCAG ACCCTGACTA CGGCCGCCGC GTTGCCGAAG GTCTTGGATT GCCGATTAAA1450 1460 1470 1480 1490 1500AAAGATTCT. .......... .......... .......... .......... ..........及其簡并序列。
2．一種過氧化氫酶，其具有如下的氨基酸序列10 20 30 40 50 60MSSNKLTTSW GAPVGDNQNS ITAGNPGPTL IQDVHLIEKL AHFNRERVPE RVVHAKGAGA70 80 90100110120HGYFEVTNDM SKYTKAKVFN GVGKRTPVFV RFSTVAGELG SADTVRDPRG FAVKFYTEEG130140150160170180NYDIVGNNTP IFFIRDAIKF SDFIHTQKRD PRTHLIYPTA MWDFLSLSPE SLHQVTYLFG190200210220230240DRGIPLTYRH MNGYGSHTFK WVNEKGEAVW VKYHFKTNQG VKNMDPELAV KIAGENPKYH250250270280290300TEDLYNAIEK GDYPSWTLYV QIMRLEDAKT YRFNPFDVTK VWSHKDYPLI EVGRMVLNRN310320330340350360PENYFAEVEQ ATFSPGNLVP GVEPSPDKIL QARLFAYADA HRYRVGVNHN LLPLNRPRVE370380390400410420VNNYQRDGFM RFDNNGGGSV NYEPNSFGGP TEVPEHKTTP FPVSGVAESV PYDDDDHYTQ430440450460470480AGDLYRLMSE EEKARLVKNI VESLKQVTKE EIKLRQIRHF YKADPDYGRR VAEGLGLPIK490500510520530540KDS....... .......... .......... .......... .......... ..........及其功能性片段。
3．一種利用基因工程技術制備微生物來源的過氧化氫酶的方法，其包含(a)將可編碼微生物過氧化氫酶的基因嵌入含適當轉錄啟動子的表達載體中以構建重組質粒；(b)將該重組質粒轉化到適當?shù)乃拗骷毎校?c)于適合該轉化細胞表達過氧化氫酶基因的條件下培養(yǎng)該轉化細胞；及(d)純化所表達的過氧化氫酶蛋白質。
4．根據(jù)權利要求3所述的方法，其中該微生物是細菌。
5．根據(jù)權利要求4所述的方法，其中該細菌為枯草芽孢桿菌。
6．根據(jù)權利要求5所述的方法，其中該枯草芽孢桿菌為CCRC910064。
7．根據(jù)權利要求4所述的方法，其中該細菌為耐熱性芽孢桿菌(Bacillus thermoglucosdasius)。
8．根據(jù)權利要求7所述的方法，其中該耐熱性芽孢桿菌為CCRC14687。
9．根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所用的耐熱性芽孢桿菌基因為根據(jù)權利要求1所述的基因。
10．根據(jù)權利要求4所述的方法，其中該細菌是大腸桿菌。
11．根據(jù)權利要求10所述的方法，其中該大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。
12．根據(jù)權利要求11所述的方法，其中該大腸桿菌DH5α為CCRC51731。
13．根據(jù)權利要求3所述的方法，其中該宿主細胞選自細菌、酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞。
14．根據(jù)權利要求13所述的方法，其中該宿主細胞為細菌。
15．根據(jù)權利要求14所述的方法，其中該宿主細胞為大腸桿菌。
16．根據(jù)權利要求3所述的方法，其中是以組氨酸親合層析法或丙酮沉淀法將所表達的過氧化氫酶蛋白質予以純化。
17．一種表達微生物來源的過氧化氫酶的重組質粒，此重組質粒是利用基因工程技術將微生物來源的過氧化氫酶基因嵌入表達載體中。
18．根據(jù)權利要求17所述的重組質粒，其中該微生物是細菌。
19．根據(jù)權利要求18所述的重組質粒，其中該細菌是枯草芽孢桿菌。
20．根據(jù)權利要求19所述的重組質粒，其中該枯草芽孢桿菌為CCRC910064。
21．根據(jù)權利要求18所述的重組質粒，其中該細菌是耐熱性芽孢桿菌。
22．根據(jù)權利要求21所述的重組質粒，其中該耐熱性芽孢桿菌為CCRC14687。
23．根據(jù)權利要求18所述的重組質粒，其中該細菌是大腸桿菌。
24．根據(jù)權利要求23所述的重組質粒，其中該大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。
25．根據(jù)權利要求24所述的重組質粒，其中該大腸桿菌DH5α為CCRC51731。
26．根據(jù)權利要求17所述的重組質粒，其中該過氧化氫酶基因為根據(jù)權利要求1的基因。
27．根據(jù)權利要求17所述的重組質粒，其中表達載體是選自細菌、酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞表達系統(tǒng)的表達載體。
28．根據(jù)權利要求27所述的重組質粒，其中表達載體為細菌表達系統(tǒng)的表達載體。
29．根據(jù)權利要求28所述的重組質粒，其中表達載體為大腸桿菌表達系統(tǒng)的表達載體。
30．根據(jù)權利要求17所述的重組質粒，其是選自pET20b/kat19(ATCC209467)、pET15b/kat19(ATCC209469)、pET20b/katTG(ATCC209468)及pET20b/katHP11(ATCC209470)。
31．一種表達微生物來源過氧化氫酶的轉化細胞，其是經(jīng)根據(jù)權利要求17-30項中任一項的重組質粒所轉化的宿主細胞。
32．根據(jù)權利要求31的轉化細胞，其中該宿主細胞選自細菌、酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞。
33．根據(jù)權利要求32的轉化細胞，其中該宿主細胞是細菌。
34．根據(jù)權利要求33的轉化細胞，其中該宿主細胞是為大腸桿菌。
35．根據(jù)權利要求34的轉化細胞，其中該大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
36．根據(jù)權利要求35的轉化細胞，其中該大腸桿菌35BL21(DE3)經(jīng)選自pET20b/kat19(ATCC209467)、pET15b/kat19(ATCC209469)、pET20b/katTG(ATCC209468)及pET20b/katHP11(ATCC209470)重組質粒所轉化。
37．一種用于分解隱形眼鏡上殘余消毒液中過氧化氫的組合物，其包含有效量的根據(jù)權利要求2的過氧化氫酶。
38．根據(jù)權利要求37的組合物，其是呈溶液或固體狀。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的過氧化氫酶,其克隆自耐熱性芽孢桿菌(Bacillus thermoglucosidasius)。本發(fā)明還提供了一種制備高產量過氧化氫酶的方法,其是利用基因工程技術用克隆自微生物的過氧化氫酶基因構建出其表達質粒及轉化細胞而獲得其表達產物。本發(fā)明亦包括此方法中所構建的新的重組質料及轉化細胞。此外,本發(fā)明亦提供一種用于分解隱形眼鏡上殘余消毒藥水中過氧化氫的組合物,其包含本發(fā)明的新的過氧化氫酶。
文檔編號G02C7/04GK1219588SQ9712038
公開日1999年6月16日 申請日期1997年12月11日 優(yōu)先權日1997年12月11日
發(fā)明者張立言, 黃清龍, 駱正凱 申請人:財團法人生物技術開發(fā)中心