一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片及其制備方法，該芯片包括捕獲單克隆抗體包被的硝酸纖維素膜、生物素標記多克隆抗體、大豆過氧化氫酶標記的鏈酶親和素以及大豆過氧化氫酶所作用的發(fā)光底物液，其中，捕獲單克隆抗體和生物素標記多克隆抗體均可以同待測抗原特異性結(jié)合。本發(fā)明使用大豆過氧化氫酶代替現(xiàn)有技術(shù)中的辣根過氧化氫酶作為標記酶制備生物芯片，可以持續(xù)較長時間的強化學(xué)發(fā)光，檢測靈敏度能夠獲得大大提高。
【專利說明】一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]生物芯片是生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、0嫩以及其他生物組分的準確、快速、高通量的檢測，它具有體積小、試劑和能量消耗少、樣品分析速度快、通量高等優(yōu)點?？梢岳蒙镄酒咄康膬?yōu)點，實現(xiàn)對多種血清學(xué)標志物的同時篩查，將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查領(lǐng)域，突破了臨床篩查唐氏綜合癥單次只能測定一項指標的界限。在產(chǎn)前血清學(xué)篩查中，利用生命分析化學(xué)新技術(shù)，結(jié)合納米科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的新技術(shù)新方法，發(fā)展產(chǎn)前篩查標志物臨床檢驗新技術(shù)，開發(fā)唐氏綜合征產(chǎn)前篩查標志物臨床檢測芯片，分析檢測結(jié)果與常用檢測方法的差異和相關(guān)性，評價各項檢測指標對胎兒出生缺陷的評估價值，對于降低產(chǎn)前篩查檢測費用、提高群體的篩查普及率，具有重要的意義。
[0003]大豆過氧化氫酶(807)362111 1)61*0X1(12186，郊？)是一類具有很高活性的酸性同功酶，是從大豆皮中提取出來的，提取原料來源充足、價廉易得。具有耐熱性能高，底物作用范圍廣，酸堿穩(wěn)定性好，邱適用范圍寬等優(yōu)點。辣根過氧化氫酶1)61*0X1(1886，
是一個陽離子酶，當(dāng)用它來催化魯米諾-過氧化氫反應(yīng)時，即使是在發(fā)光體系中加入了對碘苯酚后，僅僅是在開始的幾分鐘化學(xué)發(fā)光強度明顯增強，并且達到峰值，后來因只尺？與底物氧化自由基產(chǎn)物相互作用而使酶的失活，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光強度迅速衰減。而作為陰離子的38？，其不會因為氧化反應(yīng)產(chǎn)物作用失活，發(fā)光信號的衰退沒有?。。?？？迅速，即會產(chǎn)生一個較長時間的化學(xué)發(fā)光信號，使用該種酶代替常用的辣根過氧化氫酶作為標記酶用于生物芯片系統(tǒng)檢測，具有更高的穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是:
提供一種大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，采用大豆過氧化物酶為標記酶，解決了現(xiàn)有技術(shù)中！?。。?？催化致使魯米諾氧化反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明所提供了酶標記生物芯片可以同時檢測多種蛋白。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
提供一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，該生物芯片包括捕獲單克隆抗體包被的硝酸纖維素膜、生物素標記多克隆抗體、大豆過氧化氫酶標記的鏈酶親和素以及大豆過氧化氫酶所作用的發(fā)光底物液，其中，捕獲單克隆抗體和生物素標記多克隆抗體均可以同待測抗原特異性結(jié)合。
[0006]所述的一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片中的捕獲單克隆抗體可以是針對不同待測抗原的多種捕獲單克隆抗體；上述生物芯片中所用的發(fā)光底物液可以是1.2禮
3-(10,-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽、0.6禮4-馬琳吡啶、0.4禮魯米諾、0.4禮??！202以及50禮邱8.5的緩沖液組成的混合溶液。
[0007]優(yōu)選的，一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，其中，硝酸纖維素膜由甲胎蛋白(他？?、人絨毛膜促性腺激素 13 亞基(13
四種蛋白抗原所對應(yīng)的捕獲單克隆抗體包被，生物素標記多克隆抗體為生物素標記的八?？多克隆抗體、￠---多克隆抗體、沾3多克隆抗體、1池11311^多克隆抗體，該生物芯片用于檢測孕中期唐氏綜合癥篩查中的四項血清學(xué)標志物。
[0008]一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片的制備方法，包括以下步驟:
采用大豆過氧化氫酶標記鏈酶親和素；
匕使用捕獲抗體包被硝酸纖維素膜；
0.封閉硝酸纖維素膜上的非特異性活性位點；
(1.生物素標記可與待測抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體；
6.配制大豆過氧化氫酶所作用的發(fā)光底物液。
[0009]上述制備大豆過氧化氫酶標記鏈酶親和素的步驟3采用改良過碘酸鈉法制備，其具體步驟如下:
步驟一、取1呢大豆過氧化氫酶溶于100 111 ？88中，加入12呢/此恥104溶液1009 [，混勻，置室溫避光反應(yīng)15 111111 ；
步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入100 ^ 1, 1%乙二醇室溫反應(yīng)300111 ；
步驟三、向步驟二得到的溶液中加入100111，5呢加1鏈酶親和素，混勻，裝入透析袋，于50禮9.6碳酸鹽緩沖液41透析24匕使大豆過氧化氫酶和鏈酶親和素結(jié)合；步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5呢加1版1朋4溶液80 混勻，置41還原反應(yīng) 2 11 ；
步驟五、加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，鹽析0.5卜，132000 ^離心15 0111，去上清，沉淀以？83溶解，裝入透析袋，于？83中41透析過夜，重復(fù)步驟五操作兩次；
步驟六、次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化氫酶-鏈酶親和素結(jié)合物，加？83 500 “復(fù)溶；
步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶保存。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下:
本發(fā)明使用大豆過氧化氫酶代替現(xiàn)有技術(shù)中的辣根過氧化氫酶⑶即)作為標記酶制備生物芯片，一方面此酶的熱穩(wěn)定性比高，發(fā)光信號比強，可以持續(xù)較長時間的強化學(xué)發(fā)光，檢測靈敏度能夠獲得大大提高。其次，本發(fā)明酶標記生物芯片可實現(xiàn)高通量，可同時快速檢測多項蛋白，突破了現(xiàn)有的單次只能篩查一項指標的瓶頸，減少了檢測次數(shù)，同時對樣品的需求量減少了，其操作步驟簡單，檢測儀器使用冗0即可，因此其產(chǎn)業(yè)化研究具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的意義。
[0011]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明中生物芯片的實施過程示意圖。

【具體實施方式】
[0013]下面將結(jié)合說明書附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。
[0014]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做更進一步的解釋。
[0015]本發(fā)明提供一種酶標記的生物芯片，包括經(jīng)過捕獲抗體預(yù)包被的％膜、生物素標記抗體、大豆過氧化氫酶標記的鏈酶親和素和發(fā)光底物液，冗膜同時包被多種捕獲抗體，用于同時檢測多種待測抗原。
實施例
[0016]采用本發(fā)明所提供的生物芯片檢測孕中期唐氏綜合癥篩查中的四項血清學(xué)標志物，其實施過程如圖1所示。
[0017]本實施例涉及的？88為 10 禮邱 7.4，1^661120/188 溶液(1^661120/188, 1188),為含有100禮邱7.5 11*1配制的0.3% 1冊61120 ；使用的大豆過氧化氫酶購自美國810~1？68681~011 公司；生物素標記抗體購自上海瑞齊生物科技有限公司；鏈酶親和素購自生工生物。
[0018]第一步，酶標記鏈酶親和素的制備
采用改良過碘酸鈉法:1、取1 1118大豆過氧化氫酶溶于100 111 ？83中，加入新配制的12呢/此版1104溶液100 ^匕混勻，置室溫避光反應(yīng)15 111111 ；2、在1得到的溶液中加入100 9 1, 1%乙二醇室溫反應(yīng)30-11 ；3、在2得到的溶液中加入1001x1，5呢加1鏈酶親和素，混勻，裝入透析袋，于50禮9.6碳酸鹽緩沖液41透析24匕使大豆過氧化氫酶和鏈酶親和素結(jié)合；4、在上述步驟3得到的溶液中加入5呢加1版?zhèn)?溶液80 ^ 1,混勻，置41還原反應(yīng)2 1！ ；5、緩慢加入和上述步驟4得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，輕搖鹽析0.5 11,132000 8離心15 -11,去上清，沉淀以少許？83溶解，裝入透析袋，于大量？83中41透析過夜，重復(fù)次步操作兩次；6、次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化氫酶-鏈酶親和素結(jié)合物，加？83 500 復(fù)溶；7、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶，低溫保存；
第二步，冗膜上捕獲單克隆抗體的修飾
選用孔徑為0.4511111白色的冗膜，捕獲單克隆抗體點樣緩沖液為0.1禮？88與6%蔗糖的混合液，將80^1濃度為0.108/1111的四種捕獲單克隆抗體(即:甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素、游離雌三醇、抑制素八)分別加入至96孔板中，采用810(101八06000點樣儀控制溫度22-241，濕度50%進行點樣，41包被過夜后，置于恒溫恒濕箱中干燥1-26 ；
第三步，封閉非特異性活性位點
用150 111 5% 8“加入到步驟二制備得到的固定有四種捕獲抗體的從:膜上，室溫封閉2匕。
[0019]第四步，血清中四種蛋白標志物的檢測
待測血清的檢測:將100 ^ I待測血清加入上述封閉好的％膜上，同時設(shè)置陰性對照(加入的血清種不含待測物)，陽性對照(血清中同時含有已知濃度的四種待測物),室溫孵育30111111, 1X88震蕩洗滌四次，每次8111111，轉(zhuǎn)速設(shè)置250印111，最后拍干。
[0020]第五步，生物素標記多克隆抗體的捕獲
生物素標記抗體的捕獲:加入100 9 I —定稀釋度(2500^ )的生物素標記多克隆抗體(該抗體可與待測抗原特異性結(jié)合)于上述％膜上，室溫孵育30-11X88震蕩洗滌四次，每次8111111，轉(zhuǎn)速設(shè)置250印111，最后拍干。
[0021]第六步，酶標記鏈酶親和素的捕獲
加入100 ^ I 一定稀釋度(2000^ )的大豆過氧化氫酶標記的鏈酶親和素于上述％膜上，室溫孵育30111111，1X88震蕩洗滌四次，每次8111111，轉(zhuǎn)速設(shè)置250印111。
[0022]第七步，發(fā)光底物液加入，發(fā)光信號檢測
在％膜上加入發(fā)光底物液:1.2禮3-(10,-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽、0.6禮
4-馬琳吡啶、0.4禮魯米諾和0.4禮??！202于50禮邱8.5的緩沖液，利用1X0成像立即采集各孔的化學(xué)發(fā)光信號。因每個點對應(yīng)的是血清檢驗中的各個指標，因而，同時可以檢測出同一血清中四項指標含量。且測定四種標志物的濃度為:抑制素八0.3叩/“、雌三醇1.4叩/“、甲胎蛋白50、人絨毛膜促性腺激素42.84呢加1。
[0023]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，其特征在于該生物芯片包括捕獲單克隆抗體包被的硝酸纖維素膜、生物素標記多克隆抗體、大豆過氧化氫酶標記的鏈酶親和素以及大豆過氧化氫酶所作用的發(fā)光底物液，其中，捕獲單克隆抗體和生物素標記多克隆抗體均可以同待測抗原特異性結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，其特征在于所述捕獲單克隆抗體的種類為兩種或兩種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，其特征在于上述生物芯片中所用的發(fā)光底物液為1.2 mM 3- ClO1 -吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽、0.6 mM4-馬琳吡啶、0.4 mM魯米諾、0.4 mM H2O2以及50 mM pH 8.5的Tris-HCl緩沖液組成的混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片，其特征在于該生物芯片的硝酸纖維素膜由甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素β亞基、游離雌三醇、抑制素A四種蛋白抗原所對應(yīng)的捕獲單克隆抗體包被，生物素標記抗體為生物素標記的甲胎蛋白多克隆抗體、人絨毛膜促性腺激素多克隆抗體、游離雌三醇多克隆抗體、抑制素A多克隆抗體。
5.一種如權(quán)利要求1所述采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 采用大豆過氧化氫酶標記鏈酶親和素； 使用捕獲單克隆抗體包被硝酸纖維素膜； 封閉硝酸纖維素膜上的非特異性活性位點； 生物素標記可與待測抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體； 配制大豆過氧化氫酶所作用的發(fā)光底物液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種采用大豆過氧化氫酶標記的生物芯片的制備方法，其特征在于:所述制備大豆過氧化氫酶標記鏈酶親和素的步驟a采用改良過碘酸鈉法制備，其具體步驟如下: 步驟一、取I mg大豆過氧化氫酶溶于100 μ L PBS中，加入12 mg/mL Na14溶液100μ L，混勻，置室溫避光反應(yīng)15 min ； 步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入100 μ L, 1%乙二醇室溫反應(yīng)30min ； 步驟三、向步驟二得到的溶液中加入lOOul，5mg/ml鏈酶親和素，混勻，裝入透析袋，于50 mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析24 h，使大豆過氧化氫酶和鏈酶親和素結(jié)合；步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5 mg/ml NaBH4溶液80 μ L，混勻，置4°C還原反應(yīng)2 h ; 步驟五、加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，鹽析0.5 h, 132000 g離心15 min，去上清，沉淀以PBS溶解，裝入透析袋，于PBS中4°C透析過夜，重復(fù)步驟五操作兩次； 步驟六、次日取出離心，除去不溶物，上層清液為大豆過氧化氫酶-鏈酶親和素結(jié)合物，加PBS 500 μ L復(fù)溶； 步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶保存。
【文檔編號】G01N33/68GK104316704SQ201410620671
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】趙芳, 劉松琴, 趙岳五, 米利, 盧菊生, 俞佳超 申請人:東南大學(xué)