專利名稱：一種制備高純度鄰氯對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于α-L-巖藻糖苷水解酶底物的制備方法。
α-L-巖藻糖苷水解酶(α-L-fucohydrolase，AFU；EC 3.2.1.51)，是一種存在于生物體內(nèi)的酸性水解酶。近年來的醫(yī)學研究表明，血清α-L-巖藻糖苷酶在診斷肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)方面有重要價值。目前，用于α-L-巖藻糖苷水解酶測定的方法主要有(1)4-甲基傘形酮-α-L-巖藻糖苷(4Mu-α-L-Fuc)為底物的熒光法。(2)對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷(PNP-α-L-Fuc)為底物的比色法。(3)鄰氯對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷(CNP-α-L-Fuc)為底物的熒光法。方法一檢測靈敏度高，適用于微量生物樣品(如活檢組織、分離細胞、脊液和淚液等)以及極低AFU活性的樣品的分。但此法需要凝膠過濾除去干擾物質(zhì)及使用熒光分光光度計，使常規(guī)應用受到限制。后兩者為臨床上主要采用的方法，它系以巖藻糖苷為底物，在pH 5.0經(jīng)AFU水解產(chǎn)生相應的酚(PNP或CNP)。此pH下在可見光區(qū)吸收并顯色來判定α-L-巖藻糖苷水解酶的存在(PNP需經(jīng)堿性緩沖液處理后顯色)。
Koichi等于1992年(Jpn.Kokai Tokkyo koho Jp 06,179,690)首次公開了鄰氯對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷(CNP-α-L-Fuc)的合成。我們發(fā)現(xiàn)其合成方法有許多弊端難重復、易制得β-構(gòu)型、產(chǎn)品純度不高。本發(fā)明報道了一種簡便制備高純度鄰氯對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷的方法(如圖所示)。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
旋光度在25℃用自動旋光儀測得。1HNMR用Bruker ARX-400在CDCl3中測。化學位移以Me4Si為內(nèi)標，以ppm為單位表示。質(zhì)譜用時間飛行質(zhì)譜(MALTI-TOF-MS)測定。薄層色譜(TLC)由HF254硅膠板上用30％(v/v)的硫酸甲醇溶液活紫外檢測器檢測。柱色譜采用100-200目的硅膠，以乙酸乙酯-石油醚為淋洗液。
(1)乙基3，4-二-氧-叔丁基二甲基硅烷基-1-巰-β-L-巖藻糖苷(2)的制備乙基1-巰-β-L-巖藻糖苷1(1.04克，5毫摩爾)溶在5毫升N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在0℃下，依次加入咪唑(2.04克，30毫摩爾)和叔丁基二甲基氯硅烷(2.26克，15毫摩爾)。室溫下攪拌30分鐘后，加熱至40℃，繼續(xù)攪拌12小時。往反應體系中加50毫升水，用乙酸乙酯(3×50毫升)萃?。惠腿∫河脽o水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為25/1石油醚/乙酸乙酯，得到漿狀物2(2.08克，78％)。旋光[α]D25+25(c2，CHCl3)；核磁δH(CDCl3)0.09，0.14，0.17(4s，12H，(CH3)2Si)，0.92，0.94(2s，18H，(CH3)3CSi)，1.23(d，3H，J 6.4Hz，H-6)，1.28(t，3H，J 7.4Hz，CH3CH2S)，2.60-2.75(m，2H，CH3CH2S)，3.44(dd，1H，J 9.1，2.7Hz，H-3)，3.56(q，1H，J 6.4，13.1Hz，H-5)，3.64(t，1H，J 9.0Hz，H-2)，3.78(d，1H，J 2.7Hz，H-4)，4.22(d，1H，J 9.1Hz，H-1)。
(2)鄰氯對硝基苯基3，4-二-氧-叔丁基二甲基硅烷基-α-L-巖藻糖苷(3)的制備化合物2(2.0克，3.73毫摩爾)和鄰氯對硝基苯酚(712毫克，4.1毫摩爾)混合，在油泵上減壓抽干。在氮氣氛圍，-40℃下，此混合物溶于干燥的二氯甲烷(8毫升)，依次加入N-碘代琥珀酰亞胺(840毫克，3.73毫摩爾)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(13微升，0.075毫摩爾)。上述反應條件下，攪拌約20分鐘，加入三乙胺中和反應至中性。減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為30/1石油醚/乙酸乙酯，得到漿狀物3(1.57克，65％)。旋光[α]D25-131(c 0.5，CHCl3)；核磁δH(CDCl3)0.02，0.11，0.12，0.17(4s，12H，(CH3)2Si)，0.85，0.96(2s，18H，(CH3)3CSi)，1.18(d，3H，J 6.5Hz，H-6)，3.92(br s，1H，H-4)，3.97(q，1H，J 6.5，13.1Hz，H-5)，4.11-4.13(m，2H，H-2，H-3)，5.52(d，1H，J 2.6Hz，H-1)，7.30(d，1H，J 9.2Hz，Ph)，8.13(dd，1H，J 9.2，2.7Hz，Ph)，8.30(d，1H，J 2.7Hz，Ph).
(3)鄰氯對硝基苯基-α-L-巖藻糖苷(4)的制備化合物3(1.0克，1.54毫摩爾)溶于2毫升吡啶和15毫升乙腈，在0℃下，加入15毫升氟化氫/吡啶混合溶液(70％，質(zhì)量比)，攪拌1小時。然后，室溫攪拌約20小時，反應完全。減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為純乙酸乙酯，得到漿狀物4(334毫克，67.8％)。旋光[α]D25-153(c1，CHCl3)；核磁δH(CDCl3)1.31(d，3H，J 6.6Hz，H-6)，3.94(br s，1H，H-4)，4.01-4.10(m，3H，H-2，H-3，H-5)，5.71(d，1H，J 3.1Hz，H-1)，7.40(d，1H，J 9.2Hz，Ph)，8.18(dd，1H，J 9.2，2.7Hz，Ph)，8.32(d，1H，J 2.7Hz，Ph)；時間飛行質(zhì)譜(MALTI-TOF-MS)計算值319.51[M]；測量值342.63[M+Na]。
權(quán)利要求
1.以硅烷基保護的巖藻糖硫代苷為供體，以三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)和N-碘代琥珀酰亞胺(NIS)為催化劑，在二氯甲烷中制備高純度的鄰氯對硝基苯基α-L-巖藻糖苷的方法。特別是巖藻糖硫代苷為乙基3，4-二-氧-叔丁基二甲基硅烷基-1-巰基-β-L-巖藻糖苷。
2.權(quán)力要求1中的催化劑也可為單質(zhì)碘。
3.權(quán)力要求1中的溶劑也可為乙腈、硝基甲烷等。
4.權(quán)力要求1中的反應溫度為-40℃-10℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了以硅烷基保護的巖藻糖硫代苷為供體，以三甲基硅基三氟甲磺酸酯和N－碘代琥珀酰亞胺為催化劑、或以單質(zhì)碘為催化劑，在二氯甲烷中制備高純度的鄰氯對硝基苯基－α－L－巖藻糖苷的方法。
文檔編號C07H15/203GK1521177SQ0310255
公開日2004年8月18日 申請日期2003年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者杜宇國, 顧國鋒 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心