專利名稱：具有腦靶向遞藥特性的多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)多肽技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有腦靶向遞藥特性的多肽，包括所述肽的分子結(jié)構(gòu)及其在制備腦靶向遞藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類社會的老齡化，腦部疾病的發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢，正嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。通常腦部疾病包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、老年性癡呆)、腦腫瘤、腦血管病變、腦部病毒和細(xì)菌感染等疾病?，F(xiàn)有技術(shù)公開了血腦屏障(BBB)是存在于血液與腦組織間的屏障系統(tǒng)，它能將腦組織非必需或是有害的物質(zhì)隔離在外，起到保護(hù)腦組織的作用。血腦屏障上的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成了緊密連接，即是一道BBB的機(jī)械屏障。研究顯示，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上還存在一些特殊的酶系統(tǒng)，能使某些藥物降解，如多巴胺脫羧酶能使L-多巴和L-5-羥色胺酸脫羧生成不易透過BBB的L-多巴胺和L-5-羥色胺，從而構(gòu)成BBB的酶屏障；腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的P-糖蛋白等還起著外排泵的作用，它能選擇性地將腦內(nèi)有害物質(zhì)或過剩物質(zhì)泵出腦外，限制物質(zhì)的腦內(nèi)遞送。血腦屏障的上述功能維持了正常生理狀態(tài)下腦組織內(nèi)環(huán)境的恒定，但在疾病治療過程中卻限制了藥物的透過。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，目前臨床常規(guī)制劑給藥后，大約有98%的化學(xué)藥物和幾乎100%的蛋白多肽或基因藥物由于血腦屏障的作用而難以入腦，很大程度上限制了腦部疾病的治療。因此，增加藥物尤其是蛋白多肽藥物的腦內(nèi)遞釋技術(shù)研究已成為藥劑學(xué)及其交叉學(xué)科的研究熱點(diǎn)。目前，在增加藥物透過血腦屏障的策略中，受體介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)入腦的納米遞釋系統(tǒng)最受關(guān)注。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上存在多種特異性受體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體等。受體介導(dǎo)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)就是利用這些受體與相應(yīng)配體或單克隆抗體的特異性結(jié)合，使得載藥系統(tǒng)(如納米粒，脂質(zhì)體等)能夠以胞吞的方式介導(dǎo)相應(yīng)的藥物入腦。其中研究較多的介導(dǎo)入腦的靶向功能基有轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和單抗0X^5等，它們均能介導(dǎo)納米載藥系統(tǒng)跨越血腦屏障，但仍存在某些不足，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可能會被內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和；胰島素的體內(nèi)半衰期非常短，并且可能引起低血糖；0X^5的免疫原性和動物種屬選擇性較強(qiáng)，應(yīng)用到人體需采用抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單抗，制備技術(shù)較為復(fù)雜等等。因此，探尋新型的腦靶向功能基，構(gòu)建更為合理、有效的腦靶向遞釋系統(tǒng)具有很高的研究價(jià)值和臨床意義。現(xiàn)有技術(shù)公開了噬菌體展示肽庫技術(shù)是一種篩選功能性多肽的生物技術(shù)，它將隨機(jī)多肽文庫表達(dá)于絲狀噬菌體的表面，通過多輪的“親和一洗脫一擴(kuò)增”步驟，實(shí)現(xiàn)高通量親和篩選。有研究通過噬菌體展示技術(shù)篩選出與內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其中最具代表性的是可與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列， RGD結(jié)合的長循環(huán)納米載藥系統(tǒng)表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性。Pasqualini等獲得一種與肺細(xì)胞特異性結(jié)合的肽，通過與抗腺病毒抗體連接而靶向于細(xì)胞膜上二肽酶的遞藥系統(tǒng)。Wan Xiaomei等也獲得一種能經(jīng)鼻腔嗅粘膜入腦的七肽序列。研究顯示，經(jīng)噬菌體展示篩選獲得的多肽親和力高、特異性強(qiáng)、安全性好、生物降解和生物相容性優(yōu)良、合成方便，并易于在末端進(jìn)行修飾。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)還有Ito，et al. The effect of RGD peptide-conjugated magnetite cationic liposomes on cell growth and cell sheet harvesting. Biomaterials, 2005,26: 6185 ；Trepel Μ, et al. Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery. Hum Gene Ther, 2000,11:1971 ； Xiao-Mei Wan et al. Identification of nose-to-brain homing peptide through phage display. Peptides, 2009,30:343。但目前為止，尚未見通過噬菌體展示技術(shù)篩選經(jīng)靜脈注射入腦的靶向功能基的相關(guān)研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供與血腦屏障具有親和性的相關(guān)多肽，并提供該相關(guān)多肽的分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的另一目的是提供上述相關(guān)多肽在構(gòu)建腦靶向遞藥系統(tǒng)中的用途。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
首先，采用噬菌體展示肽庫逐輪篩選出具有血腦屏障親和性的多肽，其包括步驟采用大鼠體內(nèi)篩選方法，將紐英倫生物技術(shù)有限公司(NEW ENGLAND Biolabs)的兩種肽庫噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽庫(Ph. D-C7C Phage Display Peptide Library Kit)，噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(Ph. D-12 Phage Display Peptide Library Kit)進(jìn)行多輪體內(nèi)篩選，并逐輪增加淘選力度，獲得對腦部具有特異親和性的噬菌體單克??；測序后獲得SEQ ID N0:1 20的多肽的氨基酸序列；經(jīng)脫氧核苷酸(DNA)測序證實(shí)該些噬菌體展示多肽包含有共同序列，所述多肽的25%或更多是由堿性氨基酸殘基(K、H或R)組成；
本發(fā)明中，SEQ ID NO: 1 10的序列由噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽庫篩選獲得，所述多肽由 9個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)環(huán)狀肽區(qū)域；該環(huán)肽區(qū)域由多肽兩端的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵而被環(huán)化；所述的10條環(huán)肽的氨基酸序列分別為CPMKSHTNC，CSTPNLMLC，CTSTSAPYC， CVCCLAGLC, CNKffNLLNC, CTHDYPLVC, CPFGSPALC, CMTRHHLDC, CffANQPATC, CMRTHHMQC ；
本發(fā)明中，SEQ ID NO: 11 20的序列由噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫篩選獲得；所述的多肽為由12個(gè)氨基酸組成的直鏈肽，其中包含至少一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸殘基(K、H或R)， 所述的10條直鏈肽的氨基酸序列分別為AHSLKSITNHGL，HHERMRLPQPPV, TGNPHATNILFR, AHSCPMKSHTNC, TPQLPKDRNADR, SISTRFHAYKLK, TGNYKALHPHNG, TGffARSTFYPHP, GPSYLHRLVPAF, DYGRDffLRYRLH ；
其次，在上述任何一多肽其氨基酸序列上增加、缺失或取代1 4個(gè)氨基酸后，獲得22 條衍生肽，它們的基本性質(zhì)與原始肽相似，分別編號為SEQ ID N0: 21 44;
然后，將上述44條噬菌體展示肽及衍生肽隨機(jī)分為四組，分別連接至四種納米納米載體(納米粒、脂質(zhì)體、泡囊和膠束)表面，構(gòu)建成噬菌體展示多肽或衍生肽修飾的納米載體。經(jīng)體內(nèi)外親和性及靶向性評價(jià)，結(jié)果證實(shí)，所述的多肽及其衍生肽具有與血腦屏障中的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異親和的特性；所述的多肽及其衍生肽用于修飾載藥納米粒、脂質(zhì)體、泡囊或膠束，構(gòu)建成腦靶向遞藥系統(tǒng)，該類系統(tǒng)能夠提高藥物的腦內(nèi)遞送，增強(qiáng)對于腦部疾病的治療效果，降低全身性的毒副作用。本發(fā)明經(jīng)篩選獲得的對腦部具有特異靶向性的SEQ ID N0:1 44多肽，經(jīng)過生物信息學(xué)分析比對顯示，與美國國立生物技術(shù)住處中心(NCBI)GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫和 Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫中的已知基因和蛋白無同源性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1、本發(fā)明篩選得到的多肽，分子量小，與血腦屏障的親和力高，特異性強(qiáng)，生物相容性好，合成方便，成本低廉。2、本發(fā)明篩選得到的多肽具有良好的腦靶向作用，可以用作腦部疾病靶向治療載體的構(gòu)建。


圖1是噬菌體展示肽腦靶向性免疫熒光鑒定結(jié)果，
圖中顯示了噬菌體單克隆大鼠尾靜脈注射后在腦中的分布，其中A T分別對應(yīng)展示肽序列編號為 1、5、8、11、14、16、19、20、21、24、25、28、30、31、33、36、37、40、41、44 的噬菌體。圖2為PLGA納米粒的平均粒徑及其粒徑分布。圖3為PLGA納米粒的kta電位測定結(jié)果。圖4是大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC細(xì)胞)攝取多肽修飾納米載體的定性觀察，
圖B-J中用于細(xì)胞攝取的樣品分別是P印3-NP、P印6-LS、Pepll-PO, P印14-LS、 P印21-LS、P印26-NP、P印29-MC、P印31-MC、P印33-MC ； 圖A中為表面未連接多肽的納米粒(NP)。圖5為普通納米載體、噬菌體展示多肽修飾納米載體經(jīng)裸鼠尾靜脈注射1 h后的活體分布結(jié)果，
圖A為對照裸鼠，尾靜脈注射的是表面未接多肽的脂質(zhì)體(LS) ；B-J圖中的裸鼠分別尾靜脈給入P印4-P0、P印8-NP、P印 13-P0、P印 16-P0、P印27-MC、P印28-LS、P印30-MC、 P印38-P0、P印43-NPo
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但不作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例1噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽庫的體內(nèi)篩選
本發(fā)明采用噬菌體展示隨機(jī)肽庫篩選具有血腦屏障親和性的多肽，其包括步驟如
下
將NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-C7C 肽庫稀釋至1 X 101° pfu滴度，稀釋液為 TBS緩沖液(三羥甲基胺基甲烷，Tris) (50 mM Tris, 150 mM氯化鈉)，通過尾靜脈注射給入大鼠體內(nèi)，60 min后處死大鼠，生理鹽水心臟灌流以除去體循環(huán)內(nèi)非特異性的噬菌體。超凈臺內(nèi)取出大鼠腦組織，無菌條件下勻漿，同時(shí)加入含1 mM苯基磺酰氟(PMSF)，20 μ g/mL 蛋白酶抑制劑(Aprotin)和1 μ g/mL亮抑酶肽(Leup印tin)的TBS ；用洗滌液TBST (0. 1% 吐溫-20)沖洗三次；加入甘氨酸洗脫緩沖液(0.2M Glycine-HCl,pH 2.2)將入腦的特異性噬菌體洗脫回收，加入150 UL TBSCpH 9.1)中和，收集上清，即為第一輪篩選獲得的噬菌體。取適量所得噬菌體，用處于對數(shù)生長期的ER2738大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的滴度，其余的噬菌體擴(kuò)增后用于下一輪篩選。第二輪篩選時(shí)，洗滌液TBST中的吐溫-20濃度提高至0. 5%，洗滌次數(shù)增加至 5次，其余條件、步驟與第一輪相同。第三輪篩選時(shí)，洗滌液TBST中的吐溫-20濃度提高至1%，洗滌次數(shù)增加至8 次，其余條件、步驟與第一輪相同。第四輪篩選時(shí)，條件、步驟與第三輪相同。測定每一輪篩選獲得的噬菌體滴度，并從最后一輪結(jié)果中隨機(jī)挑取出噬菌體單克隆備用。實(shí)施例2噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫的體內(nèi)篩選
選用NEW ENGLAND Biolabs的Wi. D-12 肽庫。第一輪篩選方法如下將NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-C7C 肽庫稀釋至1 X 101° pfu滴度，稀釋液為TBS緩沖液(三羥甲基胺基甲烷，Tris ;50 mM Tris, 150 mM氯化鈉)，大鼠尾靜脈注射。60min后將大鼠麻醉， 無菌條件下抽取腦脊液100 μ L0取適量腦脊液用處于對數(shù)生長期的ER2738大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的滴度，其余的擴(kuò)增后用于下一輪篩選。以此進(jìn)行四輪篩選，測定每一輪篩選獲得的噬菌體滴度，并從最后一輪結(jié)果中隨機(jī)挑取出噬菌體單克隆備用。實(shí)施例1和實(shí)施例2中所用LB培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域通用培養(yǎng)基，均為OXOID的
女口
廣 PFt ο實(shí)施例3噬菌體滴度的測定
將實(shí)施例1和實(shí)施例2中每輪篩選獲得的噬菌體用LB培養(yǎng)基進(jìn)行10倍比的稀釋，取10 yL稀釋后的噬菌體與200 PL對數(shù)生長期的大腸桿菌ER2738菌液混勻，加入到 50°C預(yù)熱的LB頂層瓊脂(頂層瓊脂每升含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g氯化鈉，1 g氯化鎂和7 g瓊脂粉，高壓滅菌后備用)后迅速倒入含有異丙基-β -D-硫代半乳糖苷和 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(IPTG/Xgal)的LB板，過夜，通過噬菌體藍(lán)斑數(shù)來計(jì)數(shù)。滴度計(jì)算公式噬菌體滴度(Pfu)=IOOX噬菌斑數(shù)X稀釋倍數(shù)，即每1 mL中噬菌體形成單位。展示腦靶向性多肽噬菌體的富集如表1、表2所示，經(jīng)過四輪篩選后，由環(huán)七肽庫和十二肽庫四輪篩選得到的噬菌體的腦回收率均比第一輪提高了 200多倍，表明從腦中回收的噬菌體得到了明顯的富集，目標(biāo)噬菌體具有腦親和性。表1為噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫經(jīng)四輪體內(nèi)篩選，每一輪的腦內(nèi)噬菌體回收率，通過從腦中回收噬菌體的量與給入量可以計(jì)算得到腦攝取率(％ID/g)。表2為噬菌體隨機(jī)十二肽庫經(jīng)四輪體內(nèi)篩選，每一輪的腦內(nèi)噬菌體回收率， 通過從腦中回收噬菌體的量與給入量可以計(jì)算得到攝取率(％ID/g)。表 權(quán)利要求
1.具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQID N0:1 10的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 11 20的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 21 44的氨基酸序列。
2.按權(quán)利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述多肽的25%或更多是由堿性氨基酸殘基K、H或R組成。
3.按權(quán)利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述SEQID N0:1 10的氨基酸序列的多肽由噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽庫篩選獲得，所述多肽由9個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)環(huán)狀肽區(qū)域；該環(huán)肽區(qū)域由多肽兩端的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵而被環(huán)化。
4.按權(quán)利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述SEQID NO: 11 20的氨基酸序列的多肽由噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫篩選獲得；所述多肽為由12 個(gè)氨基酸組成的直鏈肽，其中包含至少一個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸殘基K、H或R。
5.按權(quán)利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述的SEQID NO: 21 44的氨基酸序列的多肽是在SEQ ID NO: 1 10的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 11 20的氨基酸序列中任何一多肽其氨基酸序列上增加、缺失或取代1 4個(gè)氨基酸后，獲得的衍生肽，它們的基本性質(zhì)與原始肽相似。
6.權(quán)利要求1的具有腦靶向遞藥特性的多肽在制備與血腦屏障中的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異親和特性制劑中的用途。
7.權(quán)利要求1的具有腦靶向遞藥特性的多肽在制備腦靶向遞藥系統(tǒng)中的用途。
8.按權(quán)利要求7的用途，其中所述的腦靶向遞藥系統(tǒng)是SEQID NO: 1 10或SEQ ID NO: 11 20或SEQ ID N0: 21 44的氨基酸序列的多肽修飾載藥納米粒、脂質(zhì)體、泡囊或膠束制成。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)多肽技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有腦靶向遞藥特性的多肽，包括所述肽的分子結(jié)構(gòu)及其在制備腦靶向遞藥中的應(yīng)用。本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)SpragueDawley遠(yuǎn)交群大鼠(SD大鼠)體內(nèi)多輪篩選，獲得具有穿透血腦屏障功能并能在腦內(nèi)富集的噬菌體單克?。唤?jīng)脫氧核苷酸(DNA)測序證實(shí)該些噬菌體展示多肽包含有共同序列。同時(shí)，經(jīng)免疫組織化學(xué)方法及體內(nèi)回收率比較，證實(shí)所獲得的多肽具有腦靶向遞藥特性。所述的多肽及其衍生肽可用于修飾載藥納米粒、脂質(zhì)體、泡囊或膠束，構(gòu)建成腦靶向遞藥系統(tǒng)。能夠提高藥物的腦內(nèi)遞送，增強(qiáng)對于腦部疾病的治療效果，降低全身性的毒副作用。
文檔編號C07K7/06GK102174080SQ20111002980
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者馮亮, 李婧煒, 蔣新國 申請人:復(fù)旦大學(xué)