專利名稱：一種特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)是研究胚胎早期發(fā)生、細(xì)胞增埴與分化及基因表達(dá)調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究的良好細(xì)胞模型系統(tǒng)，是細(xì)胞治療和組織工程的理想來源(Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells:prospects for developmentalbiology and cell therapy. Physiol Rev.2005,85:635-678 ；Vats A，Bielby RC, TolleyNS，Nerem R，Polak JM. Stem cells. Lancet. 2005，366:592-602.)，并可用于藥物篩選(Pouton CW, Haynes JM. Embryonic stem cells as a source of models for drugdiscovery. Nat Rev Drug Discov. 2007，6:605-616)。近年來一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 ES細(xì)胞的高度自我更新能力和分化全能性是它區(qū)別于其它細(xì)胞的重要特征。目前對(duì)0ct4、Nanog、Sox2等胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的大量研究掲示這些ES細(xì)胞特異性標(biāo)志分子對(duì)維持ES細(xì)胞的自我更新和分化的全能性發(fā)揮著重要的作用(Nichols J, Zevnik B，Anastassiadis K， et a_L Formation of piuripotent stem cells m the mammalianembryodepends on the POU transcription factor 0ct4. Cell. 1998，95(3):379-391 ;Avilion AA，Nicolis SK,Pevny LH, et al. Multipotent cell lineages in early mousedevelopment depend on S0X2 function. Genes Dev. 2003，17 (I) : 126-140)。ES 細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)則主要包括信號(hào)通路受體、黏附分子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蛋白水解酶類(Nunomura K etal. Cell surface Labeling and Mass Spectrometry Revea丄 Diversity of Cell surfaceMarkers and Signaling Molecules Expressed in Undifferentiated Mouse EmbryonicStem Cells. Mol Cell Proteomics. 2005，4:1968-1976. )，LIF、TGFb、BMP、FGF-PI3K 信號(hào)通路對(duì)ES細(xì)胞的自我更新起到重要作用(Rebecca Stewart，Miodrag Stojkovic andMajImda Lako. Mechanisms οι self-renewal in human emoryonic stem cells. Eur jCancer. 2006，42:1257-1272)。這些研究斗表明ES細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子可通過介導(dǎo)外源信號(hào)來調(diào)節(jié)ES細(xì)胞的増殖和分化行為。由于目前發(fā)現(xiàn)的ES細(xì)胞標(biāo)志分子數(shù)量有限，而且與其他的成體干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞有共同的表達(dá)，因此更多更特異的ES細(xì)胞標(biāo)志分子仍有待發(fā)現(xiàn)。釆用有效的手段發(fā)現(xiàn)特異性的、新的細(xì)胞表面標(biāo)志物對(duì)于研究干細(xì)胞保持自我更新和分化的信號(hào)通路、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞増殖、定向誘導(dǎo)分化具有重要意義，并將有助于ES細(xì)胞的鑒定、分離純化、質(zhì)量控制，加快ES的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。目前國(guó)際上對(duì)ES細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子的研究現(xiàn)主要釆用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)打(Adewumi，0·，et al. Characterization οι numan embryonic stem cell lines bythe International Stem Cell Initiative. N at Biotechnol. 2007. 25 (7):803-816 ；Dai, B.ana Γ. P. Rasmussen, global epiproteomic signatures distinguish embryonicstem cells from differentiated cells. Stem Cells,2007. 25(10):2567-2574 ；Shin,S.,et al. Whole genome analysis of human neural stem cells derived from embryonicstem cells and stem and progenitor cells isolated from fetal tissue. StemCells. 2007. 25(5) :1298-1306 ；3.Wang, D. and L. Gao. Proteomic analysis of neuraldifferentiation of mouse embryonic stem cells.Proteomics. 2005. 5(17):4414-4426.)。由于ES細(xì)胞膜表面標(biāo)志分子豐度低，其細(xì)胞免疫原性差，難于采用傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)來獲得特異抗體。蛋白組學(xué)采用ニ維電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)雖可高通量篩選ES細(xì)胞標(biāo)志分子，但其結(jié)果還需要進(jìn)ー步驗(yàn)證，其方法本身也較為費(fèi)時(shí)費(fèi)カ和價(jià)格昂貴。2007年國(guó)際干細(xì)胞研究所對(duì)全球17個(gè)實(shí)驗(yàn)室的59株人ES細(xì)胞的基因表達(dá)研究表明這些細(xì)胞株之間存在31 弁(Aaewumi, 0. , et al. Cnaracterization of human embryonic stem ceil linesby the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007. 25(7):803-816)，很多研究均表明ES細(xì)胞具有群體異質(zhì)性，不同的培養(yǎng)條件會(huì)有不同的特異性標(biāo)志分子的異質(zhì)表達(dá)，加之ES細(xì)胞膜蛋白的提取相對(duì)困難，豐度低及疏水性使得不易用質(zhì)譜分析這些蛋白；這些因素使得目前發(fā)現(xiàn)的ES細(xì)胞表面標(biāo)志分子數(shù)量及其功能研究較為有限。
噬菌體展示技術(shù)是ー項(xiàng)簡(jiǎn)單、成熟的，能夠?qū)⑺栊再|(zhì)的多肽從具有大量變異體的集落中提取出來的高效篩選技術(shù)。自從Smith首次闡述該方法以來(Smith,Ir. P. Filamentous fusion phage:novel expression vectors tnat display clonedantigens on the virion surface. Science. 1985. 228 (4705) : 1315-1317.)，嗷菌體展示技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為了ー種發(fā)現(xiàn)新特性多肽以及改變已有多肽性質(zhì)的強(qiáng)大工具(15.Barry, M. A.，W. J. Dower, and S. A. Johnston. Toward cell-targeting gene therapyvectors:selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phagelibraries. Nature Medicine. 1996. 2(3) :299-305 ；16. Paschke，M. Phage display systemsand their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. 70(1):2-11 ；17. Petty, N. K.，et al. Biotechnological exploitation of bacteriophage research.Trends in Biotechnology. 2007. 25(1) :7-15. )□傳統(tǒng)的篩選方法多釆用純化抗原或重組抗原進(jìn)行固相篩選，而篩選未知分子卻是許多研究工作所需要的，因此近年來使用噬菌體展示技術(shù)直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選發(fā)展非常迅速。釆用細(xì)胞篩選不需要預(yù)先知道細(xì)胞表面相關(guān)分子信息，直接用細(xì)胞進(jìn)行篩選可保留其膜表面分子的原初信息，并更為真實(shí)地模擬配體和受體間的結(jié)合狀態(tài)。但由于細(xì)胞膜表面成分及其復(fù)雜，而所需要篩選的膜表面抗原往往又豐度低、免疫原性差，容易導(dǎo)致噬菌體的非特異結(jié)合，使得用細(xì)胞進(jìn)行篩選難度較大。近年來發(fā)展的扣除篩選法，即用陰性細(xì)胞先行進(jìn)行篩選，以去除非特異結(jié)合的噬菌體，再用陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行多輪富集篩選即可較好地解決這類問題。在噬菌體展示技術(shù)用于篩選干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子方面，已經(jīng)有報(bào)道將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用到對(duì)單ー的成體干細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得了許多特異性的，功能性的多肽(Nowakowski, u S.，et al. A specmc heptapeptide from a phage display peptidelibrary homes to bone marrow and binds to primitive hematopoietic stem cells.Stem Cells.2004.22 (6):1030-1038 ； 19.Letchford, J.，et al. Isolation of C15: Anovel antibody generated against mesenchymal stem cell-enriched adult humanmarrow. Journal of Immunological Methods. 2006. 308(1-2):124-137 ；20. Morita, Y. , etal.Selection and properties for the recognition of P19 embryonic carcinoma stemcells. Biotechnology Progress. 2006. 22(4) : 974-978)，但將嗷菌體庫(kù)篩選技術(shù)應(yīng)用到人類胚胎干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞分化的研究中尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段。本發(fā)明所提供的特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列I所示的氨基酸殘基序列。上述特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段的編碼核苷酸片段。所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過對(duì)噬菌體庫(kù)的篩選，獲得攜帶特異性靶向胚胎干細(xì)胞的肽段的噬菌體，實(shí)驗(yàn)證明，該肽段可以與胚胎干細(xì)胞特異性結(jié)合，本發(fā)明的肽段或其編碼基因以及特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的量子點(diǎn)與噬菌體的復(fù)合物可以用于制備人類胚胎干細(xì)胞的識(shí)別，標(biāo)記，和分選和藥物祀向的產(chǎn)品。


圖I為特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的氨基酸肽段的篩選流程2為人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及AP (堿性磷酸酶)鑒定圖3為本發(fā)明肽段的特異性結(jié)合ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖4為本發(fā)明肽段的特異性結(jié)合免疫熒光檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例I、特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的氨基酸序列的篩選特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的氨基酸肽段的篩選流程圖如圖I所示，為了除去非特異性的多肽，本實(shí)驗(yàn)采用了減數(shù)雜交篩選法，即用自由分化的人類胚胎干細(xì)胞作為負(fù)篩材料，除去那些非特異性的噬菌體多肽，然后再用未分化的胚胎干細(xì)胞作為正篩材料，得到能與其特異性結(jié)合的多肽。具體步驟如下所述I、細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備正向篩選細(xì)胞懸浮液的制備人類胚胎干細(xì)胞系X-Ol公眾可以以合法的方式從中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)(Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)申請(qǐng)獲得)培養(yǎng)于P3輻照處理過的小鼠成纖維細(xì)胞(PMEFsCF-Ι)(上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)0303-200)上。培養(yǎng)用培養(yǎng)基為含體積百分含量為79%DMEM(Hycl0ne，Logan,新西蘭)，體積百分含量為 1%非必需氨基酸(nonessential amino acid, Gibco BRL, USA美國(guó))，ImM L-谷氨酰胺(Gibco BRL,美國(guó))，4ng/L bFGF (Invitrogen,廣州)，0. ImM b-mercaptoethanol (Amresco, Solon, Ohio美國(guó))，和體積百分含量為20%血清替代物(KSR) (Gibco BRL，美國(guó))，培養(yǎng)時(shí)間為14天(復(fù)蘇后第一代)，傳代后培養(yǎng)8天。在使用噬菌體展示肽庫(kù)篩選之前，胚胎干細(xì)胞用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化，用磷酸緩沖液(PBS，pH7. 4)洗兩次，然后懸浮于封 閉液中(含終質(zhì)量百分含量為3%FBS于pH7. 4的PBS中)，得到的細(xì)胞懸浮液用于做正向篩選。AP (喊性憐酸酶)檢測(cè)米用 Alkaline Phosphatase Detection Kit (milipore, German德國(guó))。AP (堿性磷酸酶)檢測(cè)的結(jié)果如圖2所示，兩個(gè)孔均為胚胎干細(xì)胞克隆，紅色的顯示結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞AP結(jié)果為陽(yáng)性，干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況正常，圖2中，ES為復(fù)蘇后第7天的胚胎干細(xì)胞，平鋪細(xì)胞為滋養(yǎng)層CF-I細(xì)胞，聚團(tuán)克隆為胚胎干細(xì)胞，由形態(tài)學(xué)可以看出，胚胎干細(xì)胞克隆緊湊生長(zhǎng)，有清晰的邊緣，生長(zhǎng)情況正常。dES為分化后的人類胚胎干細(xì)胞，細(xì)胞為鋪散狀態(tài)，失去清晰邊緣。負(fù)向篩選細(xì)胞懸浮液的制備負(fù)向篩選使用自有分化的胚胎干細(xì)胞X-Ol和P3輻照處理過的小鼠成纖維細(xì)胞PMEFsCF-Ι。這兩種細(xì)胞懸浮液的制備方法如下所述自有分化的胚胎干細(xì)胞將上述培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞X-Ol形成克隆的核心挑除，留存周圍胚胎干細(xì)胞，用胎牛血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清(Gibco BRL，美國(guó))和體積百分含量為90%DMEM(Hyclone，Logan，新西蘭)組成的培養(yǎng)基)，連續(xù)培養(yǎng)20天直至細(xì)胞失去胚胎干細(xì)胞特征，用于做負(fù)向篩選的分化后胚胎干細(xì)胞，將分 化后胚胎干細(xì)胞也用O. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并懸浮于封閉液中。小鼠成纖維細(xì)胞(PMEFsCF-Ι)用用胎牛血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清(Gibco BRL，美國(guó))和體積百分含量為90%DMEM(Hyclone，Logan，新西蘭)組成的培養(yǎng)基)培養(yǎng)后，用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并懸浮于封閉液中。2、噬菌體肽庫(kù)篩選本實(shí)施例所用的噬菌體庫(kù)是Ph. D. -12噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒中的Ph. D. -12噬菌體展示肽庫(kù)，該試劑盒購(gòu)自NEW ENGLAND BI0-LABS,美國(guó)，該試劑盒中Ph. D.-12噬菌體展示肽庫(kù)使用的噬菌體載體為M13單鏈?zhǔn)删w，肽庫(kù)表達(dá)的隨機(jī)肽均在噬菌體次要包膜蛋白PlII的N端。M13噬菌體是絲狀噬菌體，是ー種溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。采用負(fù)篩/正篩的方法來進(jìn)行篩選，具體包括下述步驟I)負(fù)篩接近I. 56 X IO11的噬菌體(Ph. D. -12噬菌體肽庫(kù)，NEW ENGLANDBI0-LABS,美國(guó))被加入到Iml的懸浮的上述用作負(fù)向篩選的分化人類胚胎干細(xì)胞懸浮液中，在室溫中輕微晃動(dòng)I小吋，3000rpm離心3分鐘。上清液中含有沒有結(jié)合分化細(xì)胞的噬菌體，將上清液轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細(xì)胞(上述P3輻照處理過的小鼠成纖維細(xì)胞PMEFsCF-Ι)懸浮液中，室溫輕微晃動(dòng)I小吋，3000rpm離心3分鐘，收集上清液。2)正篩將步驟I)獲得的上清轉(zhuǎn)入步驟I制備的人類胚胎干細(xì)胞系X-Ol懸浮液中，室溫輕微晃動(dòng)I. 5小時(shí)，棄上清，所獲細(xì)胞與噬菌體的混合物用洗脫液I (含終質(zhì)量百分濃度為3%的BSA和終質(zhì)量百分濃度為0. 1%的Tween-20的pH7. 4的PBS)洗5次。接下來用I. 6ml洗脫液2 (含0. IM glycine-HCl，終質(zhì)量百分濃度為0. 1%的BSA，pH 2. 2的溶液)洗脫與細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，然后加入0. 3ml中和液(pH 9. I, IM Tris-HCl溶液)，目標(biāo)噬菌體即在液體中。3)將上述所獲噬菌體于宿主細(xì)菌大腸桿菌ER2738 (Ph. D. -12噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒中提供)中擴(kuò)增后并進(jìn)行滴定計(jì)數(shù)。通過2輪與上述步驟I)和步驟2)同樣的篩選，計(jì)算每ー輪的噬菌體得率。
噬菌體得率(Phage yield rate)=篩選后噬菌體量/加入噬菌體量表I.兩輪篩選后噬菌體的得率
權(quán)利要求
1.ー種特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列I所示的氨基酸殘基序列。
2.權(quán)利要求I所述特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段的編碼核苷酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼序列，其特征在于所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求I所述的肽段或其編碼基因在制備用于人類胚胎干細(xì)胞的識(shí)別和/或標(biāo)記和/或分選和/或藥物靶向的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段。該肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列。本發(fā)明的特異性靶向人類胚胎干細(xì)胞的肽段可用于制備人類胚胎干細(xì)胞的識(shí)別和/或標(biāo)記和/或分選和/或靶向的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102731620SQ20121018590
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者趙文秀, 金磊, 馬嵐 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院