一種煅燒骨靶向結(jié)合多肽及其合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煅燒骨靶向結(jié)合多肽及其合成方法 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，通過對(duì)BMP作用機(jī)制的研究，選擇其中發(fā)揮作用的活性序列進(jìn)行體外合成， 并設(shè)計(jì)了具有靶向結(jié)合礦物質(zhì)支架的活性區(qū)域，獲得了能夠與煅燒牛骨支架穩(wěn)定結(jié)合、緩 釋的BMP-2功能多肽，合成成本低于BMP-2市場價(jià)格的1%。在與BMP-2蛋白的活性對(duì)比實(shí)驗(yàn) 中，BMP-2功能多肽對(duì)于成骨細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶活性等關(guān)鍵指標(biāo)的促進(jìn)作用均優(yōu)于 BMP-2蛋白。目前正在進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，1-2個(gè)月內(nèi)將獲得主要結(jié)果。該功能多肽在骨 質(zhì)疏松癥的治療中也具有潛在的應(yīng)用前景。
[0003] 目前的BMP-2存在的重要問題是不能與支架材料穩(wěn)定復(fù)合，體內(nèi)釋放流失快，因此 產(chǎn)品制作中需加大用量，增加了異位成骨和炎癥等副作用風(fēng)險(xiǎn)，且成本高。美國BMP-2產(chǎn)品 采用的真核表達(dá)系統(tǒng)費(fèi)用昂貴，活性較好。國內(nèi)的原核表達(dá)系統(tǒng)成本較低，活性差。
[0004] 之前有人將與膠原結(jié)合的基團(tuán)修飾BMP，獲得與骨的結(jié)合能力，然而膠原是體內(nèi)多 種組織所共有的成分，例如肌腱的膠原成分與骨組織完全一致，肌肉筋膜中也含有豐富的 這種膠原，另外血管和皮膚甚至軟骨、半月板各種纖維等組織內(nèi)均含有膠原成分。因此其安 全性仍然是一個(gè)未決的問題。
[0005] 如何有效的將BMP控制在骨組織局部，避免與其它組織細(xì)胞親附結(jié)合，成為一個(gè)重 要的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種煅燒骨靶向結(jié)合多肽及其合成方法與應(yīng)用。
[0007] -種煅燒骨靶向結(jié)合多肽，是下述氨基酸殘基序列之一的多肽：
[0008] 1)序列表SEQ ID N0:1(KIPKASSVPTELSAISTLYL EPRREVAEL)，所示的氨基酸殘基 序列；
[0009] 2)將序列表SEQ ID N0:1(KIPKASSVPTELSAISTLYL EPRREVAEL)所示的氨基酸殘基 序列經(jīng)過1至3個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有煅燒骨靶向結(jié)合功能的多肽。
[0010] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了編碼上述煅燒骨靶向結(jié)合多肽的基因，用于采用基因 工程的方法來生產(chǎn)上述多肽，并采取基因工程中常用的純化方法將其純化。
[0011] 上述煅燒骨靶向結(jié)合多肽的合成方法，按照如下步驟進(jìn)行：
[0012] ⑴以Rink Amide樹脂或者Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸 為單體，采用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈?zhǔn)褂帽Ｗo(hù)的巰基丙酸， 得到保護(hù)樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽；
[0013] (2)加入切肽試劑進(jìn)行切肽；
[0014] (3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集促進(jìn)骨生成的多肽粗品；
[0015] (4)將骨生成的多肽粗品溶于水中，用氨水調(diào)節(jié)pH到7.5-10.0,收集促進(jìn)骨生成的 多肽；
[0016] (5)將步驟(4)收集的促進(jìn)骨生成的多肽通過HPLC分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0017] 所述縮合劑為HBTU/HOBt，TBTU/HOBt，BOP/HOBt，TBTU/HOAt，HBTU/H0A或Β0Ρ/ H0At〇
[0018] 所述切肽試劑為 TFA/EDT/HAc/TIS/EDT。
[0019] 上述煅燒骨靶向結(jié)合多肽在制備促進(jìn)骨合成的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的煅燒骨靶向結(jié)合多肽，能夠有效的將BMP-2蛋白控制 在骨組織局部，避免與其它組織細(xì)胞親附結(jié)合，靶向促進(jìn)骨細(xì)胞的生成，特別適用于骨質(zhì)疏 松癥的治療。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0022] 下述實(shí)施例中所用的BMP-2蛋白序列為：SEQ ID NO: 3QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPK ACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR。其基因序列為：SEQ ID NO： 4 (CGCGGATCCCAGGCGAAACATAAACAACGTAAACGCCTGAAAAGTTCCTGCAAACGTCATCCGCTGTATGTTGATT TTAGCGACGTCGGCTGGAACGATTGGATTGTTGCTCCGCCGGGCTATCATGCGTTCTACTGCCACGGTGAATGTCCG TTTCCGCTGGCCGACCATCTGAACTCTACCAATCACGCAATTGTTCAGACGCTGGTTAACAGTGTCAATTCCAAAAT CCCGAAAGCGTGCTGTGTCCCGACCGAACTGTCAGCGATCTCGATGCTGTACCTGGATGAAAATGAAAAAGTGGTCC TGAAAAACTATCAAGACATGGTGGTGGAAGGCTGTGGCTGCCGCTGACTCGAGCGG)〇
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 1.本實(shí)施例誘導(dǎo)成骨多肽的合成
[0025] SEQ ID N0:1(KIPKASSVPTELSAISTLYL EPRREVAEL)。
[0026] 上述促進(jìn)骨生成的多肽的合成方法，按照如下步驟進(jìn)行：
[0027] (1)以Rink Amide樹脂或者Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸 為單體，采用縮合劑(TBTU/HOAt)進(jìn)行接肽反應(yīng)，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈?zhǔn)褂帽Ｗo(hù) 的巰基丙酸，得到保護(hù)樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽；
[0028] (2)加入切肽試劑(TFA/EDT/HAc/TIS/EDT)進(jìn)行切肽；
[0029] (3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集促進(jìn)骨生成的多肽粗品；
[0030] (4)將骨生成的多肽粗品溶于水中，用氨水調(diào)節(jié)pH到7.5-10.0,收集促進(jìn)骨生成的 多肽；
[0031] (5)將步驟(4)收集的促進(jìn)骨生成的多肽通過HPLC分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0032] 2.細(xì)胞試驗(yàn)
[0033] (1)試驗(yàn)相關(guān)儀器設(shè)備
[0034] 儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家
[0035] 潔凈工作臺(tái)NU-126-006 Nuaire
[0036] 研究級(jí)倒置顯微鏡1X41 OLYMPUS
[0037] 冷凍離心機(jī)5810R EPPEND0RF
[0038] 二氧化碳孵箱NU4750E Nuaire
[0039] (2)試驗(yàn)相關(guān)材料
[0040] SD MSC-株(RASMX-01001)，來源：Cyagen
[0041] 細(xì)胞狀態(tài):細(xì)胞狀態(tài)好，形態(tài)均一。
[0042]細(xì)胞無菌檢測結(jié)果:陰性
[0043] (3)試驗(yàn)相關(guān)試劑
[0044] 人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基 mTeSRl(加拿大 Stemcell 公司）、1XPBS(PBS-10001_100)，
[0045] 人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基CP1202(深圳市偉通生物公司），0.25% Trypsin-0.0,4%EDTA(TEDTA-10001-100)、BMP-2(北京義翹神舟生物技術(shù)有限公司）
[0046]本發(fā)明的誘導(dǎo)成骨多肽堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成科技有限公司）。
[0047] (4)試驗(yàn)步驟
[0048] I、細(xì)胞準(zhǔn)備：在SD MSC細(xì)胞融合達(dá)80 %時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，接種于經(jīng)0.1 %明膠 包被過的24孔板中，用于成骨誘導(dǎo)。
[0049] A.細(xì)胞消化、接種：
[0050] a ·棄去上清，用 1 X PBS清洗細(xì)胞2次，加入lmlPBS和lml 0 · 25 % Trypsin-0 · 04 % EDTA消化細(xì)胞；
[0051 ] b.消化1-2分鐘，顯微鏡下可見細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，用手輕拍培養(yǎng)器皿的壁， 立即加入2mL的SDMSC完全培養(yǎng)基終止消化。
[0052] c.用吸管吸取液體，輕輕吹打培養(yǎng)器皿表面，反復(fù)3-5次，使細(xì)胞徹底脫離瓶皿底 壁，將細(xì)胞移入離心管中，再向培養(yǎng)瓶中加入1 XPBS洗1-2次，并將洗液一并轉(zhuǎn)移至離心管 中。
[0053] d.llOOrpm進(jìn)行離心4分鐘；
[0054] e .棄去上清加入完全培養(yǎng)液，充分混勻，平均接種于3個(gè)包被過明膠的12孔板中， 搖勻，放置于37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0055] II、誘導(dǎo)成骨多肽的準(zhǔn)備:將誘導(dǎo)成骨多肽稱量分裝成3份（lmg/份），取其中一份 進(jìn)行溶解，其他保存于_20°C冰箱以供備用。加入lml無菌用水溶解lmg成骨素于離心管中， 過濾，分裝于EP管中，保存于-80°C冰柜中以供使用。
[0056] III、誘導(dǎo)成骨：
[0057] A.初誘導(dǎo):待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。每組兩個(gè)復(fù)孔，其中2孔陰性 對(duì)照:使用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng);2孔陽性對(duì)照:使用間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完 全培養(yǎng)液培養(yǎng);2孔含10ug/ml的BMP-2間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng);2孔含30ug/ml的 [0058] BMP-2間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng);2孔含10ug/ml的本發(fā)明的誘導(dǎo)成骨多肽間 充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng);2孔含30ug/ml的本發(fā)明的誘導(dǎo)成骨多肽間充質(zhì)干細(xì)胞完全培 養(yǎng)液培養(yǎng)。2板重復(fù)。
[0059] B.每3天進(jìn)行誘導(dǎo)換液。
[0060] IV.堿性磷酸酶檢測：
[0061 ]取不同檢測時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，根據(jù)堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(南京建成)對(duì)各組AKP 含量進(jìn)行檢測。具體操作如下：
[0062] A.消化各孔細(xì)胞，離心后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，保證50ul細(xì)胞重懸液含 有大于5X105的細(xì)胞。用0.05ml緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入相應(yīng)溶液:測定管中加入0.05mL 細(xì)胞懸液，〇. 〇5mL緩沖液，0.05mL基質(zhì)液;標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.05mL Ο . lmg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液， 0.05mL緩沖液，0.05mL基質(zhì)液;空白管中加入0.05mL雙蒸水，0.05mL緩沖液，0.05mL基質(zhì)液。 充分混勻37°C水浴15分鐘，加入1.5mL顯色液，混勻，520nm，0.5cm或者lcm光徑比色，空白管 調(diào)零，測各管吸光度。
[0063] V.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0064] A.兩周堿性磷酸酶測定： 「00651
[0066] B.三周堿性磷酸酶測定：
[0067]
[0069]上述的小薊提取物中含有純天然促進(jìn)骨質(zhì)細(xì)胞生長的物質(zhì)，采用如下方法提?。?取過20目篩的干小薊葉粉加入石油醚脫脂后收集殘?jiān)?，將殘?jiān)娓珊蟀匆毫腺|(zhì)量比為5~ 35:1加入體積分?jǐn)?shù)為40~90%的乙醇溶液