相關(guān)申請的交叉引用

無。

背景技術(shù)：

親水相互作用色譜(“hilic”)分離與uplc平臺的熒光檢測聯(lián)用，可用于拆分復(fù)雜的n-連接聚糖群，這是因為其能夠在單次色譜運行中分離中性聚糖和帶電荷聚糖二者。由于聚糖的異質(zhì)性、異構(gòu)化和端基異構(gòu)性，要闡明復(fù)雜的n-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)可能是一個重大的分析挑戰(zhàn)。葡聚糖梯(dextranladder)可用于校準(zhǔn)對聚糖的親水相互作用色譜(“hilic”)分離，并將峰保留時間轉(zhuǎn)化成葡萄糖單元(“gu”)值。每個單獨的聚糖結(jié)構(gòu)具有與其鍵和其組成單糖直接相關(guān)的gu值。由于對于給定的聚糖，每個聚糖結(jié)構(gòu)組分均以特定的方式貢獻gu值，所以gu值可用于預(yù)測結(jié)構(gòu)。

因此，通過參考分離校準(zhǔn)物，例如基于葡聚糖梯的校準(zhǔn)物，聚糖的洗脫時間可用葡萄糖單元表示。葡聚糖梯可用于校準(zhǔn)液相色譜(“l(fā)c”)的運行，防止其因不同時日或不同系統(tǒng)而變化。gu值可通過將五階多項式分布曲線或三次樣條擬合曲線擬合到葡聚糖梯的保留時間來計算。然后，使用該曲線，可根據(jù)在測試樣品中觀察到的保留時間來分配gu值。只要柱間的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便為可重現(xiàn)的。這就允許與在一段時間內(nèi)從一系列儀器中收集到的數(shù)據(jù)庫值進行直接比較。有了gu值，就能夠查詢以gu值儲存的聚糖的數(shù)據(jù)庫，從而有助于闡明聚糖群中存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)。

此外，甚至在比較不同的加標(biāo)簽方法時，可以看出hilic分離將標(biāo)記的n-聚糖拆分成非常相似的特征譜。要產(chǎn)生適用于用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記的聚糖的葡聚糖梯并不是一項簡單的任務(wù)。與通過n-糖基化蛋白的酶促去糖基化釋放的n-糖基胺不同，葡聚糖是一種含還原醛末端的糖。因此，與n-糖基胺不同，葡聚糖不能用靶向胺親核試劑的快速加標(biāo)簽試劑來修飾。因為葡聚糖不包含合適的親核物質(zhì)，因此不能被快速標(biāo)記。因此，需要使用與快速標(biāo)記的n-聚糖具有相同的光學(xué)和/或其他物理化學(xué)性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物來校準(zhǔn)液相色譜過程的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文提供了制備快速標(biāo)記的葡聚糖梯和其他可用于液相色譜的校準(zhǔn)物的方法。該方法包括以下步驟：提供具有醛基的還原性聚糖，并將該還原性聚糖與具有伯胺的化合物反應(yīng)以產(chǎn)生中間化合物。用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記該中間化合物以產(chǎn)生快速標(biāo)記的葡聚糖梯，該葡聚糖梯與用快速加標(biāo)簽試劑對n-聚糖快速加標(biāo)簽所產(chǎn)生的快速標(biāo)記的n-聚糖具有基本上相同的光學(xué)性質(zhì)。本文還提供了具有以下結(jié)構(gòu)式的校準(zhǔn)物：

其中r為葡萄糖單元或單糖單元。本文提供的方法適用于對含醛基的化合物快速加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

附圖說明

圖1示出了用于制備快速標(biāo)記的n-聚糖的工作流程的實施方案。

圖2示出了用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記的快速標(biāo)記的n-聚糖的熒光發(fā)射光譜，其具有的優(yōu)化激發(fā)波長為265nm，優(yōu)化發(fā)射波長為425nm。

圖3示出了用快速加標(biāo)簽試劑的類似物僅通過還原胺化標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光發(fā)射光譜，其熒光特性發(fā)生了偏移，具有的優(yōu)化激發(fā)波長為370nm，優(yōu)化發(fā)射波長為480nm。

圖4a和圖4b示出了用本文提供的方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光特性。

圖5a、圖5b和圖5c示出了通過本文提供的方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖梯的代表性hilic熒光色譜圖。

圖6a、圖6b和圖6c示出了實施例3的每批次快速標(biāo)記的葡聚糖梯的對應(yīng)基峰離子(“bpi”)色譜圖。

圖7a和圖7b示出了采用glycanbehamide2.1×50mm色譜柱，將快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖與快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖對此獲得的熒光色譜圖。

具體實施方式

在制備生物藥物時，生物樣品的糖基化特征譜通常通過分析釋放的聚糖來進行評估。然而，這些樣品的制備技術(shù)常常都是耗時的，或可導(dǎo)致樣品對質(zhì)譜(“ms”)分析不敏感。n-聚糖的酶促釋放和快速標(biāo)記可解決許多不足之處、提供更高的n-聚糖樣品制備通量，并且能夠提高聚糖檢測的敏感度。例如，如本文所述，通過n-聚糖的酶促釋放和快速標(biāo)記，糖蛋白如今可在低至10分鐘的時間內(nèi)去糖基化產(chǎn)生n-聚糖，產(chǎn)生的n-聚糖隨后與快速加標(biāo)簽試劑快速反應(yīng)。然后，為了方便樣品分析，通過spe法從標(biāo)記的反應(yīng)副產(chǎn)物中提取所得的標(biāo)記聚糖。

生物藥物的n-聚糖特征譜是一個關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，因為它可為功效、安全性和制備條件的量度。因此，用于臨床和商業(yè)生物治療制劑的聚糖分析方法需要具備高敏感度。另外，當(dāng)進行分析時，快速的周轉(zhuǎn)時間和高通過能力可促進產(chǎn)品開發(fā)。

大多數(shù)評估來自糖蛋白的n-聚糖的分析策略都涉及經(jīng)由pngasef的去糖基化以及標(biāo)記所得的n-聚糖使其具有賦予其可檢測屬性的化學(xué)部分。在本文所述的一個方法中，標(biāo)記的聚糖通過親水相互作用色譜(“hilic”)進行分離，通過熒光(“flr”)和質(zhì)譜(“ms”)進行檢測。

此外，我們此前開發(fā)了一種樣品制備解決方案，該方案使flr和ms能夠?qū)厶菣z測敏感，同時提高了n-聚糖樣品制備的通量。我們已開發(fā)了快速加標(biāo)簽試劑，該試劑可合成產(chǎn)生，當(dāng)n-聚糖從糖蛋白釋放時能夠快速與其反應(yīng)。(brousmiche等人，2014年8月13日提交的美國公布的專利申請2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]，以引用方式并入本文)。通過利用該快速加標(biāo)簽試劑，在5分鐘的反應(yīng)時間內(nèi)，n-聚糖就能夠被標(biāo)記。本文利用的快速加標(biāo)簽試劑包含n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)氨基甲酸酯快速標(biāo)記基團、高效喹啉熒光團和用于增強電離的強堿性叔胺，并且例示于下表1中。

表1

示例性快速加標(biāo)簽試劑

在本發(fā)明的方法中，還原性糖通過還原胺化被標(biāo)記(加標(biāo)簽)，并且將所得的含仲胺的糖用快速加標(biāo)簽試劑快速加標(biāo)簽。本文提供的方法可用于對任何含醛的化合物加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

為進一步促進n-聚糖的制備，快速加標(biāo)簽試劑的使用可直接與pngasef的去糖基化工序結(jié)合，該工序還涉及表面活性劑和hilicμ洗脫固相萃取(“spe”)清理工序以提供對所釋放和標(biāo)記的聚糖的定量回收，可省去對樣品進行液相色譜(“l(fā)c”)分析前的溶劑干燥步驟，從而具有附加的益處。

實施例1

使用快速加標(biāo)簽試劑快速制備釋放的n-聚糖用于hilic分析

在這個實施例中，我們描述了制備加標(biāo)簽(本文也稱為“標(biāo)記”)的n-聚糖的方法，從糖蛋白到分析就緒樣品，在30分鐘內(nèi)完全去糖基化。我們的方法是一種改進的方案，可通過稱為glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒的試劑盒來促進實施。相比于此前的熒光和ms檢測，對標(biāo)記的n-聚糖的敏感度可增加至少2倍至100倍，并且可基于用于中和四唾液酸化n-聚糖的穩(wěn)固的固相萃取(“spe”)提供準(zhǔn)確的特征譜分析。lauber，m.etal.，rapidpreparationofreleasedn-glyansforhilicanalysisusingalabelingreagentthatfacilitatessensitivefluorescenceandesi-msdetection，anal.chem.2015，97，5401-5409(lauber，m.等人，“使用促進敏感熒光和esi-ms檢測的標(biāo)記試劑快速制備釋放的n-聚糖以供hilic分析”，《分析化學(xué)》，2015年，第97卷，第5401-5409頁)，以引用方式并入本文。

基于對提供快速標(biāo)記動力學(xué)、高熒光量子產(chǎn)率和顯著提高的ms可檢測性的合理設(shè)計考慮，來合成促進我們的n-聚糖分析的快速加標(biāo)簽試劑。n-聚糖樣品制備可取決于醛封端糖的還原胺化。在這個過程中，聚糖在無水條件下被還原胺化以最小化去唾液酸作用。樣品制備從水性條件轉(zhuǎn)變?yōu)闊o水條件。另一方面，通過利用快速加標(biāo)簽試劑，還原胺化可通過水性快速加標(biāo)簽反應(yīng)被消除。

如果聚糖通過快速加標(biāo)簽反應(yīng)沒有被標(biāo)記，則可使用還原胺化使聚糖在其還原端被標(biāo)記。在這個反應(yīng)中，含伯胺的加標(biāo)簽試劑與聚糖的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，得到亞胺或席夫堿，其被還原劑還原產(chǎn)生仲胺。該反應(yīng)通常在含乙酸的二甲基亞砜中進行，但是已經(jīng)描述了使用四氫呋喃和甲醇的替代方法。胺(本文也稱為伯胺或具有伯胺的化合物)的示例包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游離氨基末端的肽(如本文實施例5所示)、n，n-二甲基乙二胺、氨基蒽和氨基生物素。這種標(biāo)記方法的優(yōu)點在于每個聚糖都化學(xué)計量連接一個標(biāo)記，允許基于熒光或uv吸光強度直接進行定量。

作為另外一種選擇，使用本文描述的glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒，能夠在實驗室中容易地采用聚糖的快速加標(biāo)簽，該試劑盒的設(shè)計目的就是消除n-聚糖樣品制備各個方面的瓶頸。如下圖1中所示，優(yōu)化的n-聚糖樣品制備工作流程需要三個步驟：(1)去糖基化，從糖蛋白釋放聚糖；(2)標(biāo)記，賦予聚糖可檢測的化學(xué)實體；以及(3)清理步驟，消除樣品中潛在的干擾。然后將這些聚糖與一種或多種快速加標(biāo)簽試劑快速反應(yīng)，用由高效熒光團和強堿性叔胺組成的標(biāo)簽對其進行標(biāo)記，從而對熒光和ms檢測產(chǎn)生增強的敏感度。下文緊接著示出了快速標(biāo)記的聚糖的結(jié)構(gòu)描述。值得注意的是，快速標(biāo)記的聚糖具有一個非常獨特的鍵部分，其不同于來自還原胺化反應(yīng)的仲胺鍵?？焖贅?biāo)記的n-聚糖將包含中性(非酸性)的脲鍵。這種結(jié)構(gòu)可影響快速標(biāo)記的聚糖的物理化學(xué)特性和/或性質(zhì)，包括它們的色譜保留及其熒光性質(zhì)和其他物理化學(xué)性質(zhì)諸如等電點(“pi”)、酸性、堿性、疏水性、親水性、螯合金屬的能力、uv吸光度、熒光度、在可見光譜中的吸光度、比色變化、分子大小、與結(jié)合伴侶相互作用的親和力(即生物素?；瘹埢c親和素或鏈霉親和素之間，表位與對位之間)、還原/氧化電位、交聯(lián)傾向、可裂解性(化學(xué)和熱)，以及不同長度的聚合取代基(即4個重復(fù)的聚乙二醇(peg)，40個重復(fù)的peg)。

如本文所用，商標(biāo)glycoworks^tm和rapifluor-ms^tm為其申請者沃特世科技公司(waterstechnologiescorporation)所有。商標(biāo)glycoworks^tm與用于實驗室用途的樣品制備試劑盒結(jié)合使用，所述樣品制備試劑盒包括生物標(biāo)準(zhǔn)品、樣品制備裝置和一次性刀片架以及用于制備色譜和質(zhì)譜樣品的化學(xué)試劑。相似地，商標(biāo)rapifluor-ms^tm與用于制備色譜和質(zhì)譜樣品的化學(xué)試劑結(jié)合使用，也與用于實驗室用途的樣品制備試劑盒結(jié)合使用，所述樣品制備試劑盒包括生物標(biāo)準(zhǔn)品、樣品制備裝置和一次性刀片架。

因此glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒可用于n-聚糖的快速酶促釋放和快速標(biāo)記。這種方案已經(jīng)用單克隆抗體進行了驗證，并且也已經(jīng)進行了大范圍的其他n-連接糖蛋白的測試。這種樣品制備試劑盒使用優(yōu)化的去糖基化條件和試劑來進行快速釋放。該試劑盒可包括在2014年8月13日提交的美國公布的專利申請2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]中描述的快速標(biāo)記試劑，該專利申請以引用的方式并入本文，并且該試劑盒被設(shè)計成提供敏感熒光檢測的同時對質(zhì)量檢測也具有適當(dāng)?shù)男盘枏姸鹊碾p重益處。

如本文所述，蛋白質(zhì)的n-糖基化的表征和監(jiān)測對于疾病狀態(tài)的檢測和生物藥物的制備意義重大。糖基化特征譜通常主要通過分析釋放的聚糖來評估，其中常用于制備樣品的技術(shù)眾所周知的非常耗時，或?qū)е聵悠穼s分析不敏感。隨著本文所述的glycoworksrapifluor-msn-聚糖試劑盒的開發(fā)，實現(xiàn)了聚糖檢測的前所未有的敏感度，同時還提高了n-聚糖樣品制備的通量，這些不足之處就都得到了解決。

與通過這種新的樣品制備方法提供的效率和敏感度增益以及相關(guān)方法同等重要的是，其穩(wěn)健性以及其產(chǎn)生與歷史n-聚糖特征譜分析一致的結(jié)果的能力。此外，生成的聚糖數(shù)據(jù)可用于查詢聚糖數(shù)據(jù)庫，但首先需要轉(zhuǎn)化成被稱為葡萄糖單元(“gu”)值的標(biāo)準(zhǔn)化值。從而，實施校準(zhǔn)基準(zhǔn)的另一個益處就是能夠?qū)F(xiàn)有聚糖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成搜索可能的聚糖數(shù)據(jù)庫的格式。轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)可用于正在研究未知聚糖組成的樣品的發(fā)現(xiàn)過程。一旦聚糖被轉(zhuǎn)換成gu值，用戶就能夠查詢在線數(shù)據(jù)庫以深入了解樣品中可能存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)，潛在地減少了進行典型表征所需的時間。在液相色譜中，校準(zhǔn)進行的非常頻繁，有時頻繁到在聚糖混合物每次分離之后都要進行一次。

為了檢測熒光(“flr”)標(biāo)記的聚糖，可將親水相互作用液相色譜(“hilic”)與熒光檢測聯(lián)用。對于分離處理和與某些常規(guī)的高效液相色譜(“hplc”)方法相比，在hilic模式下操作的乙烯橋連聚糖色譜柱(后文稱為“beh聚糖色譜柱”或”beh色譜柱”)通過其分離中性和酸性聚糖兩者的能力可提高峰值分辨率。beh聚糖色譜柱實現(xiàn)并產(chǎn)生可重現(xiàn)的聚糖分離數(shù)據(jù)，并在更少的時間內(nèi)優(yōu)化方法。

beh色譜柱利用混合二氧化硅beh、橋連技術(shù)顆粒，所述顆粒用穩(wěn)定的含酰胺的物質(zhì)官能化。beh技術(shù)產(chǎn)生了直徑范圍為1.7至5μm的多種粒度的固定相，為hplc和超高效液相色譜(“uplc”)技術(shù)平臺搭建了橋梁。beh顆粒提供堿性分析物的峰形和效率、合理的一系列色譜選擇性，以及在流動相極限下(特別是在升高的ph下)化學(xué)穩(wěn)定性的改善。這些色譜柱的拆分能力部分是由于具有用于相關(guān)應(yīng)用的最佳酰胺配體濃度的多孔顆粒。該色譜柱可經(jīng)優(yōu)化用于具有熒光(“flr”)檢測的uplc或hplc系統(tǒng)，用于從各種生物治療劑分離釋放的和標(biāo)記的n-連接聚糖，并實現(xiàn)中性和帶電荷的標(biāo)記聚糖物質(zhì)二者的基于hilic的分離。

為了充分利用beh聚糖色譜柱，或簡單地使用聚糖的任何基于hilic的特征譜分析，可使用葡聚糖校準(zhǔn)梯(在下文中有時稱為“葡聚糖梯”或“葡聚糖梯標(biāo)準(zhǔn)物”)。從hilic/flr系統(tǒng)獲得的聚糖特征譜可針對葡聚糖梯進行校準(zhǔn)，并分配葡萄糖單元(gu)值。例如，一個已知的此類梯，即2ab標(biāo)記的葡聚糖校準(zhǔn)梯，不同于其他市售產(chǎn)品。該葡萄糖均聚物的平均分子量較高(約4，500道爾頓)，因此“可用”的gu值范圍是其他葡聚糖梯標(biāo)準(zhǔn)物的兩倍，觀察到的gu為2到30。因此，大分子量聚糖的保留時間分配得到提高。葡聚糖梯的純度和結(jié)構(gòu)完整性可通過hilic和質(zhì)譜(“ms”)進行評估。

聚糖的洗脫時間可以參照葡聚糖梯，用葡萄糖單元(“gu”)表示。每個單獨的聚糖結(jié)構(gòu)具有與其鍵和組成單糖直接相關(guān)的gu值。由于對于給定的聚糖，特定鍵中的每個單糖均以特定的方式貢獻gu值，所以gu值可用于預(yù)測結(jié)構(gòu)。因此，本文提供的葡聚糖梯可用于校準(zhǔn)lc的運行，防止其因不同時日或不同系統(tǒng)而變化。gu值可通過將五階多項式分布曲線或三次樣條擬合曲線擬合到葡聚糖梯來計算，然后用該曲線根據(jù)保留時間來分配gu值。只要柱間的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便可具有很高的可重現(xiàn)性。這就允許與在一段時間內(nèi)從一系列儀器中收集到的數(shù)據(jù)庫值進行直接比較。

有了gu值，就能夠查詢以gu值儲存的聚糖的數(shù)據(jù)庫，從而有助于闡明聚糖群中存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)。葡聚糖梯也提供經(jīng)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物，其可用于校準(zhǔn)在不同實驗室用不同儀器獲得的色譜圖。用hilic-flr儀采集的聚糖保留時間將因儀器和實驗室而異。通過將保留時間轉(zhuǎn)化為gu值，所得的數(shù)據(jù)可用于現(xiàn)場和非現(xiàn)場比較不同地方之間的信息。雖然gu值的使用在此只是作為一個示例，但其他色譜方法可以從使用通過本發(fā)明方法制備的葡聚糖校準(zhǔn)物中獲益，所述方法包括但不限于反相色譜法以及反相與hilic的復(fù)合型迭代。

n-聚糖的快速標(biāo)記簡化了分析用聚糖樣品的制備。但是，要產(chǎn)生適用于用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記的聚糖的葡聚糖梯并不是一項簡單的任務(wù)。本文提供了用于標(biāo)記還原性聚糖的兩步法，其允許調(diào)節(jié)色譜響應(yīng)和化學(xué)性質(zhì)諸如熒光和ms活性，以及調(diào)節(jié)具有不同檢測性質(zhì)的多個標(biāo)簽。每個步驟在與還原性聚糖連接的性質(zhì)上有所不同。術(shù)語“還原性聚糖”是指還原糖、還原性糖、還原性多糖(雜多糖不同的糖單元，或不同的單糖，或均多糖)，并且包括任何醛封端的糖如殼三糖、殼二糖、半乳糖-β-(1-3)-galnac-聚糖、甘露糖-二-(n-乙?；?d-葡糖胺)和麥芽糖。還原性聚糖或還原糖是能夠充當(dāng)還原劑的任何糖，因為其具有游離的醛基。因此本文提供的方法可用于任何含醛(有時也稱為醛基)的化合物(包括o-聚糖)加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

如下文緊接著所示，第一步利用還原胺化方法，所述還原胺化方法包括將還原性聚糖(醛封端的糖)與具有伯胺的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生諸如乙醇氨基葡聚糖梯、丙基氨基葡聚糖梯的中間化合物，或具有已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為仲胺的醛的其他化合物，或被轉(zhuǎn)化成用仲胺封端的還原性聚糖(還原性糖)的步驟。為了產(chǎn)生中間化合物或其醛被轉(zhuǎn)化成仲胺的化合物，可顯示所需特性的伯胺(本文也稱為“具有伯胺的化合物”或胺)包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游離氨基末端的肽(如本文實施例5所示)、n，n-二甲基乙二胺/氨基蒽和氨基生物素。第二步是與可賦予不同性質(zhì)的快速加標(biāo)簽試劑反應(yīng)。換句話講，中間化合物的特性與快速加標(biāo)簽化合物(即快速加標(biāo)簽聚糖)的特性不同。

其中r-nh2為乙醇胺或具有伯胺的類似類型的化合物。

這種方法最初是出于如下需要：用快速加標(biāo)簽試劑(圖2)加標(biāo)簽的n-連接聚糖之間的光學(xué)性質(zhì)與用如下文緊接著所示的前體僅通過還原胺化加標(biāo)簽的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)物(本文也稱為還原糖)(圖3)的性質(zhì)相匹配。

據(jù)發(fā)現(xiàn)，這兩類物質(zhì)的熒光性質(zhì)(即激發(fā)峰和發(fā)射峰)是不利地不同的。因此，這種葡聚糖梯不適合作為用于分析液相色譜中快速標(biāo)記的聚糖的校準(zhǔn)物。

本文提供的方法利用快速加標(biāo)簽/胺反應(yīng)性標(biāo)記對還原性聚糖(或任何醛封端的聚糖)加標(biāo)簽的反應(yīng)途徑，提供通過n-聚糖的熒光和/或ms活性性質(zhì)對n-聚糖的檢測。傳統(tǒng)的對還原性聚糖加標(biāo)簽涉及使用特定加標(biāo)簽試劑的還原胺化(漫長的過程，即反應(yīng)1至4小時并且可能長達8小時以獲得高產(chǎn)率)。然而，本發(fā)明的方法則利用還原胺化，一旦產(chǎn)生胺中間體，就馬上進行第二步驟(快速，約5分鐘)以引入具有熒光/ms活性性質(zhì)的標(biāo)簽(或標(biāo)記)并提供具有如下結(jié)構(gòu)式i的糖分子。如本實施方案中所提供的，末端單糖殘基顯示為通過其4-oh位置連接到剩下的糖結(jié)構(gòu)的n-乙酰化葡糖胺(glcnac)。然而末端單糖殘基不一定非得是glcnac；葡聚糖梯可用通過其6-oh位置與結(jié)構(gòu)連接的葡萄糖單糖封端。另外，末端單糖殘基可通過4-oh位置連接。葡聚糖梯可用通過其6-oh位置連接到剩下的糖結(jié)構(gòu)的如下式ii例示的任何葡萄糖單糖進行封端。

其中r可為單糖單元或葡萄糖殘基，r1為-ch2ch2oh，r2為在結(jié)構(gòu)中加入flr-ms官能團的快速加標(biāo)簽試劑的部分并通過以下結(jié)構(gòu)例示：

本文提供的方法允許用與其他已經(jīng)用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記的分子具有相同光學(xué)性質(zhì)和ms性質(zhì)的快速加標(biāo)簽試劑來對還原性聚糖加標(biāo)簽。換句話講，用快速加標(biāo)簽試劑的伯胺進行還原胺化可產(chǎn)生與用快速加標(biāo)簽試劑(n-連接分子)標(biāo)記的對此分子具有不同吸光性質(zhì)和發(fā)射性質(zhì)的分子。連接基可不同(胺與尿素)，導(dǎo)致發(fā)色團性質(zhì)改變。通過用具有伯胺的化合物進行還原胺化，然后用快速加標(biāo)簽試劑對所述胺加標(biāo)簽來保持光學(xué)性質(zhì)。

圖4a示出了用本文所述方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的葡聚糖梯的光學(xué)性質(zhì)，其中所述快速加標(biāo)簽試劑為：

圖4b顯示，葡聚糖梯與用相同快速加標(biāo)簽試劑產(chǎn)生的快速標(biāo)記的聚糖具有基本上相同的熒光性質(zhì)，所述快速標(biāo)記的聚糖例示如下：

本發(fā)明的方法允許通過改變整體極性來調(diào)整葡萄糖均聚物(本文稱為“葡聚糖梯”)的相對保留。例如，通過用a)乙醇胺或b)丙胺進行還原胺化，然后與快速加標(biāo)簽試劑反應(yīng)來對葡聚糖梯加標(biāo)簽，會產(chǎn)生不同的保留特性。因此，可調(diào)整葡聚糖梯的除其他特性以外的色譜保留特性作為校準(zhǔn)基準(zhǔn)。

因此，本發(fā)明的方法可產(chǎn)生與用快速加標(biāo)簽標(biāo)記試劑標(biāo)記的n-聚糖具有高度類似的化學(xué)性質(zhì)的葡聚糖梯。

如實施例3中列出的所推薦工序中提供的那樣，此類葡萄糖均聚物的一個實施方案包括用乙醇胺還原胺化，然后用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記以產(chǎn)生如下文緊接著所示的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖梯(快速標(biāo)記的葡聚糖梯的實施方案)：

在另一個實施方案中，實施例3所列工序中的乙醇胺可以用丙胺代替。與圖7b所示的相比，當(dāng)用圖7a所示的behamide固定相分離時，所得的快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖(如下所示)顯示具有改變的色譜保留。

快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖，一種快速標(biāo)記的葡聚糖梯

實施例2

制備快速標(biāo)記的葡聚糖梯

葡聚糖的還原胺化，偶聯(lián)工序

準(zhǔn)確稱量100mg的葡聚糖5000(dextran5000)并置于8ml的小瓶中。然后用吸管向該8ml小瓶中滴入2800μl的dmso，并攪拌直到葡聚糖溶解。然后記錄實際重量。

向該8ml小瓶中依次加入1200μl的冰乙酸、90.0mg(91.0ml)的重蒸餾乙醇胺(mw＝61.08，d＝1.012)以及128mg的氰基硼氫化鈉。輕輕混合漿液，并在磁力攪拌下在70℃的加熱塊中溫育3小時。溫育3小時后，將所得反應(yīng)液從加熱塊中取出，并冷卻至40℃以下。將反應(yīng)內(nèi)容物從8ml小瓶轉(zhuǎn)移至配衡的50ml離心機中，并添加40ml的acn溶液。測量并記錄皮重，并將小瓶置于冰箱中30分鐘。然后，在4000prm下離心混合物5分鐘，并潷析上層清液。將所得顆粒重懸在40mlacn溶液中并劇烈渦旋。重復(fù)離心、潷析、重懸步驟，總共清洗三次。不需要靜置30分鐘。將顆粒在氮氣流下干燥20分鐘，然后在室溫下于真空中過夜。稱量顆粒重量以測定最終回收量。記錄最終重量、皮重和回收重量。

產(chǎn)生乙醇胺標(biāo)記的葡聚糖梯的快速標(biāo)記工序

該工序旨在以超過快速加標(biāo)簽試劑100-200倍的摩爾量進行快速加標(biāo)簽反應(yīng)。將4.0±0.3mg乙醇胺葡聚糖溶解于500μl的50mmhepes溶液中，ph7.9(用氫氧化鈉滴定游離酸而得)。加入300μl無水dmf。用此葡聚糖溶液溶解100±0.5mg快速加標(biāo)簽試劑。使反應(yīng)在室溫下進行10分鐘。周期性地(每20至30秒一次)攪拌/搖動反應(yīng)混合物。在室溫下完成溫育后，用7.6mlacn稀釋反應(yīng)物。最佳做法是剛好在加載到spe柱之前稀釋反應(yīng)液。

hilicspe清理

用6ml水進行清洗并用6ml85％的acn溶液進行平衡。將acn稀釋的反應(yīng)混合物分成兩(2)份4.5ml體積(近似體積)并加載到柱上。用6ml體積的1∶9∶90甲酸/水/acn清洗三次。用三(3)份4ml體積的未調(diào)節(jié)ph的200mm乙酸銨和5％的acn進行洗脫。分配600μl體積并通過離心式真空蒸發(fā)進行干燥。

上述工序可使由乙醇胺葡聚糖中間體制備的標(biāo)記的葡聚糖梯的每批次產(chǎn)量高達約80個標(biāo)準(zhǔn)品。

實施例3

快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖(快速標(biāo)記的葡聚糖)的實驗條件和代表性數(shù)據(jù)

1至3批次的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖的實驗條件，使用快速標(biāo)記的葡聚糖液相色譜分析如實施例2中所制備的標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光和ms性質(zhì)。用70％hplc級乙腈(acn)/30％hplc級水(v/v)沖洗色譜柱。然后用流動相條件平衡柱，之后進行第一次進樣。下表2和表3提供了分析中使用的hilicuplc/flr/ms條件。

表2

表3

質(zhì)譜分析

圖5a、圖5b和圖5c示出了制備的三批次標(biāo)記的(乙醇胺)葡聚糖梯中每批次的熒光色譜圖。圖6a、圖6b和圖6c示出了每批次快速標(biāo)記的葡聚糖梯的對應(yīng)基峰離子(“bpi”)色譜圖。標(biāo)記的葡萄糖單元(gu)物質(zhì)的質(zhì)量示于表4中。

表4

實施例4

通過還原胺化用具有伯胺的化合物調(diào)節(jié)色譜保留

通過用丙胺替換實施例2中所列的乙醇胺制備第二快速標(biāo)記的葡聚糖。根據(jù)如下概述的實驗條件，將所得的快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖的色譜保留與前述快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖的色譜保留進行比較：

用70％hplc級乙腈(acn)/30％hplc級水(v/v)沖洗色譜柱。然后用流動相條件平衡柱，之后進行第一次進樣。表5提供了分析中使用的hilicuplc/flr條件。

表5

圖7a和圖7b示出了當(dāng)使用behamide2.1×50mm色譜柱時，將快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖與快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖對此獲得的熒光色譜圖。

預(yù)示實施例5

將多種功能引入還原性糖

更廣泛地講，所提出的方法可通過引入單獨的標(biāo)記部分(或者在本文中也稱為“標(biāo)簽”或“標(biāo)記”)賦予還原性聚糖和還原糖某些化學(xué)性質(zhì)，一種通過還原胺化，另一種通過快速加標(biāo)簽處理。

在本發(fā)明方法的一個實施方案中，可通過鏈霉親和素下拉(pull-down)從樣品基質(zhì)純化被兩次標(biāo)記的n-聚糖，隨后經(jīng)由快速加標(biāo)簽試劑檢測以賦予熒光和/或增強的電離效率。下文所示的這種“兩次標(biāo)記”的糖可同時具有生物素標(biāo)記和高度熒光、ms活性標(biāo)記。在如下所示的一個實施方案中，可使用氨基生物素分子進行還原胺化，被還原胺化的糖可通過快速加標(biāo)簽反應(yīng)被標(biāo)記。

在一個實施方案中，如果將本方法應(yīng)用于用氨基苯甲酰胺還原胺化聚糖并且隨后用快速加標(biāo)簽試劑進行標(biāo)記，將可能可使用不止一種熒光團/發(fā)色團來實現(xiàn)對單一糖類物質(zhì)的多波長檢測。

本發(fā)明的方法也可允許使用表位標(biāo)簽標(biāo)記糖/聚糖，從而實現(xiàn)免疫親和富集或基于免疫的檢測。在一個具體實施方案中，可用血凝素(ha)表位標(biāo)簽(一種序列為ypydvpdya的肽)還原胺化糖，然后用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記。