本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)廢棄物處理與生物質(zhì)產(chǎn)品生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

農(nóng)業(yè)秸稈是一類產(chǎn)量巨大、處理困難的固體廢棄物，農(nóng)業(yè)秸稈的回收利用能夠減少秸稈對(duì)環(huán)境的污染、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的效益。纖維包括纖維素和半纖維素，是秸稈的主要成分，占秸稈總重的60％～80％。纖維經(jīng)水解后制得的高濃度糖溶液，可用于微生物的異養(yǎng)培養(yǎng)。

微藻生物質(zhì)富含蛋白、多不飽和脂肪酸、色素等物質(zhì)，在水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖和高價(jià)值生物產(chǎn)品生產(chǎn)等方面有廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的微藻培養(yǎng)技術(shù)主要是在光照條件下，在跑道式淺塘中，利用人工培養(yǎng)基自養(yǎng)培養(yǎng)微藻。受限于光合作用效率和光的傳遞損失，光自養(yǎng)條件下，藻液的生物質(zhì)濃度低、藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，導(dǎo)致微藻生物質(zhì)生產(chǎn)成本過高，制約微藻生物質(zhì)產(chǎn)品的大規(guī)模應(yīng)用。開發(fā)一種利用秸稈水解液的微藻培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)秸稈的資源化利用和高價(jià)值微藻生物質(zhì)產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻的方法及其應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下：

一種利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻的方法，以農(nóng)業(yè)秸稈為原料制備纖維水解液，將具備異養(yǎng)生長(zhǎng)能力的藻種接種到以纖維水解液為基質(zhì)配置的培養(yǎng)基中，黑暗條件下異養(yǎng)培養(yǎng)。具體步驟為：

1)采用機(jī)械法、堿法或亞硫酸銨法處理農(nóng)業(yè)秸稈，去除木質(zhì)素，將纖維浸泡在緩沖液中，投加纖維素酶，得到纖維水解液；

2)采用離心或壓濾的方式分離水解液與剩余殘?jiān)?，在水解液中添加必需無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素，調(diào)節(jié)水解液pH至6.5-7.5，高溫高壓滅菌，條件為溫度115℃，時(shí)間15min，得到以纖維水解液為基質(zhì)的培養(yǎng)基；

3)在培養(yǎng)基中接種微藻，異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中可進(jìn)一步投加濃縮水解液，以補(bǔ)充糖分，初始葡萄糖濃度和補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)的殘?zhí)菨舛瓤刂圃?～50g/L，待葡萄糖充分利用后，離心收獲藻細(xì)胞。

步驟2)中所述無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素為Na2CO3、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、檸檬酸、K2HPO4·3H2O、NaNO3、EDTA、檸檬酸鐵銨，其中糖與總氮的比值為(5:1)～(250:1)，氮磷比為(5:1)～(40:1)，其他營(yíng)養(yǎng)元素物質(zhì)含量同BG11培養(yǎng)基(見表1)。

步驟3)中所述微藻為具備異養(yǎng)生長(zhǎng)能力的單細(xì)胞光合微生物，如小球藻、螺旋藻、雨生紅球藻、柵藻。

步驟3)中所述微藻為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)ZTY1325，菌種保藏號(hào)分別為CGMCC NO.12521和CGMCC NO.12522。

所述的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；所述的普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)ZTY1325的18S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。

所述的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304為單細(xì)胞微生物，細(xì)胞呈球形，細(xì)胞壁平滑，直徑3～8μm；所述的普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)ZTY1325為單細(xì)胞微生物，細(xì)胞呈球形，細(xì)胞壁平滑，直徑8～15μm。

步驟3)中所述異養(yǎng)培養(yǎng)的條件為：溫度25℃，振蕩速率150rpm/min，時(shí)間3～10天。

步驟3)中所收獲微藻的生物質(zhì)組成隨培養(yǎng)基的糖與總氮投加量的比值而變化，其中蛋白含量為20％～60％，脂肪酸含量為10％～35％，培養(yǎng)基的糖氮比越低，微藻生物質(zhì)的蛋白含量越高，脂肪酸含量越低。

微藻在飼料添加劑、色素、化工產(chǎn)品、生物柴油生物質(zhì)產(chǎn)品生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明以農(nóng)業(yè)秸稈纖維水解液為基質(zhì)，用于培養(yǎng)具備異養(yǎng)能力的經(jīng)濟(jì)型微藻。該方法培養(yǎng)微藻無需光照、所得藻液濃度高、藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，可為微藻生物質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供廉價(jià)的生物質(zhì)原料，降低生產(chǎn)成本；通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件，可以方便地調(diào)控微藻生物質(zhì)的組成，產(chǎn)出的微藻生物質(zhì)的總蛋白含量為20％～60％，脂肪酸含量為10％～35％，可滿足不同用途的使用要求；并且本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)秸稈資源的有效回收利用。

生物材料保藏說明

分類命名：蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)菌株編號(hào)：THUZTY1304

保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心

保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC

地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2016年06月022日

保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.12521

分類命名：普通小球藻(Chlorella vulgaris)菌株編號(hào)：THUZTY1325

保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心

保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC

地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2016年06月022日

保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.12522

附圖說明

圖1為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)THUZTY1325在秸稈纖維水解液和合成培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長(zhǎng)的生長(zhǎng)曲線圖。

圖2為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgarissp.)THUZTY1325在秸稈纖維水解液和合成培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長(zhǎng)的糖濃度變化圖。

圖3為在不同初始總氮條件下，利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304時(shí)，藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中總氮的利用情況。

圖4為利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304時(shí)，藻生物質(zhì)的蛋白含量隨氮投加量的變化圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提出了一種利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻的方法及其應(yīng)用，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻ZTY1325的分離與鑒定

兩株藻種分離自北京市某污水廠的生活污水。取少量污水，以BG11培養(yǎng)基(見表1)稀釋后，置于光照條件下擴(kuò)大培養(yǎng)20～30天；在BG11+2％瓊脂的固體平板上劃線，繼續(xù)培養(yǎng)30天左右；挑取平板上的單一藻落，再溶于BG11中擴(kuò)大培養(yǎng)。重復(fù)以上分離步驟2～3次，直至分離出潔凈而不受污染的藻落。

以提取的微藻DNA為模版，PCR擴(kuò)增18S rDNA基因，采用以下2對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增：

①上游引物EK82f(5’-GAAACTGCGAATGGCTC-3’)，和下游引物Proto5r(5’-GACGGGCGGTGTGTAC-3’)，

②上游引物16S1N(5’-TCCTGCCAGTAGTCATATGC-3’)，和下游引物16S2N(5’-TGATCCTCTCGCAGGTTCAC-3’)。

擴(kuò)增序列在Genbank中進(jìn)行同源比對(duì)，兩個(gè)藻落鑒定為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)THUZTY1325。其中蛋白核小球藻THUZTY1304的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；普通小球藻ZTY1325的18S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。

蛋白核小球藻THUZTY1304為單細(xì)胞微生物，細(xì)胞呈球形，細(xì)胞壁平滑，直徑3～8μm；普通小球藻ZTY1325為單細(xì)胞微生物，細(xì)胞呈球形，細(xì)胞壁平滑，直徑8～15μm。

表1BG11培養(yǎng)基配方

實(shí)施例2：利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻

1)將小麥秸稈洗凈切碎，用堿溶液蒸煮，充分去除木質(zhì)素后，收獲纖維漿，脫水并充分洗去殘留堿液；將纖維浸泡在乙酸-乙酸鈉緩沖液中，固液比(1:5)～(1:30)，單位質(zhì)量纖維的纖維素酶投加量為5-500FPU，pH4-6，反應(yīng)溫度35–55℃，振蕩速率200rpm/min，反應(yīng)時(shí)間12-48h，將纖維水解為高濃度糖溶液；水解后，水解液中的葡萄糖濃度約為45～60g/L，可采用減壓蒸餾法(如多級(jí)閃蒸等)進(jìn)一步濃縮糖液至300g/L以上，蒸餾溫度50～60℃，降低蒸餾室氣壓至低于水溫所對(duì)應(yīng)的飽和蒸汽壓，蒸餾時(shí)間為20～40min；

2)采用離心或壓濾的形式，將水解液與剩余殘?jiān)珠_，依據(jù)所培養(yǎng)微藻的種類，按期標(biāo)準(zhǔn)自養(yǎng)培養(yǎng)基配方，在水解液中添加必需無機(jī)營(yíng)養(yǎng)20mg/L Na2CO3、75mg/L MgSO4·7H2O、36mg/L CaCl2·2H2O、6mg/L檸檬酸、40mg/L K2HPO4·3H2O、1500mg/L NaNO3、1mg/L EDTA、6mg/L檸檬酸鐵銨，其中初始糖濃度控制在10g/L，調(diào)節(jié)水解液pH至6.5-7.5，溫度115℃，時(shí)間15min條件下高溫高壓滅菌，得到以纖維水解液為基質(zhì)的培養(yǎng)基；

3)在培養(yǎng)基中分別接種蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻ZTY1325，接種密度為1.0×10⁷個(gè)·mL^-1，異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25℃，振蕩速率150rpm/min，時(shí)間3～10天；培養(yǎng)過程中可進(jìn)一步投加濃縮水解液和營(yíng)養(yǎng)鹽，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，初始葡萄糖濃度和補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)的殘?zhí)菨舛瓤刂圃?～50g/L，待葡萄糖充分利用后，離心收獲藻細(xì)胞；

4)藻細(xì)胞脫水干化，經(jīng)進(jìn)一步處理后用于生產(chǎn)各類微藻生物質(zhì)產(chǎn)品，也可保留部分藻種繼續(xù)用于培養(yǎng)。

另按小球藻培養(yǎng)領(lǐng)域一般采用的BG11培養(yǎng)基的配方(見表1)，以分析純化學(xué)品和高純水為原料配置營(yíng)養(yǎng)水平相同的合成培養(yǎng)基，在同樣條件下培養(yǎng)上述藻種，作為對(duì)照。

蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻THUZTY1325在秸稈纖維水解液和合成培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長(zhǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖1，糖濃度變化圖如圖2。

在初始接種密度為1.0×10⁷個(gè)·mL^-1條件下，蛋白核小球藻THUZTY1304在水解液培養(yǎng)基中僅生長(zhǎng)5天，藻密度即可增長(zhǎng)到2.6×10⁸個(gè)·mL^-1，藻細(xì)胞倍增時(shí)間可縮短至9.2小時(shí)，遠(yuǎn)快于該藻在自養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率；收獲時(shí)干重濃度為4.9克/升，蛋白含量為20.3％，總?cè)~綠素含量為51.1ug/mg；產(chǎn)出的蛋白核小球藻生物質(zhì)富含多不飽和脂肪酸，其中亞麻酸和亞油酸的含量占總脂肪酸含量的42.6％，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。普通小球藻在水解液培養(yǎng)基中也表現(xiàn)出了遠(yuǎn)快于自配培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速率，收獲時(shí)干重濃度為6.1克/升，蛋白含量為21.7％，總?cè)~綠素含量為44.6ug/mg，不飽和脂肪酸含量為占總脂肪酸含量的70.2％。

實(shí)施例3：氮投加量對(duì)微藻生物質(zhì)的蛋白含量的影響

步驟同實(shí)施例2，不同之處在于，水解液中葡萄糖濃度為10克/升，控制培養(yǎng)基中的總氮含量分別為180mg/L，360mg/L和900mg/L，氮磷比控制在10:1，置于25℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，振蕩速率為150rpm/min。

蛋白核小球藻THUZTY1304對(duì)培養(yǎng)基中總氮的利用情況如圖3，藻生物質(zhì)的蛋白含量隨氮投加量的變化圖如圖4。

在初始接種密度為1.0×10⁷個(gè)·mL^-1條件下，培養(yǎng)5天后，蛋白核小球藻THUZTY1304即可充分同化培養(yǎng)基中的糖分，蛋白含量隨總氮投加量的增加而明顯上升，總蛋白含量為20％～60％，脂肪酸含量隨蛋白含量的升高而降低，變化范圍為10％～35％。通過該方式調(diào)節(jié)微藻生物質(zhì)的組成，可充分滿足不同用途對(duì)微藻產(chǎn)品的要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 清華大學(xué)

<120> 一種利用秸稈纖維水解液培養(yǎng)微藻的方法及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1592

<212> DNA

<213> 蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）

<400> 1

aatctagagc taatacgtgc gtaaatcccg acttctggaa gggacgtatt tattagataa 60

aaggccgacc gggctctgcc cgactcgcgg tgaatcatga taacttcacg aatcgcatgg 120

ccttgtgccg gcgatgtttc attcaaattt ctgccctatc aactttcgat ggtaggatag 180

aggcctacca tggtggtaac gggtgacgga ggattagggt tcgattccgg agagggagcc 240

tgagaaacgg ctaccacatc caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca 300

cagggaggta gtgacaataa ataacaatac tgggcctttt caggtctggt aattggaatg 360

agtacaatct aaacccctta acgaggatca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg 420

cggtaattcc agctccaata gcgtatattt aagttgctgc agttaaaaag ctcgtagttg 480

gatttcgggt ggggcctgcc ggtccgccgt ttcggtgtgc actggcaggg cccaccttgt 540

tgccggggac gggctcctgg gctttactgt ccgggactcg gagtcggcgc tgttactttg 600

agtaaattag agtgttcaaa gcaggcctac gctctgaata cattagcatg gaataacacg 660

ataggactct ggcctatcct gttggtctgt aggaccggag taatgattaa gagggacagt 720

cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa agacgaacta 780

ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg ggggctcgaa 840

gacgattaga taccgtccta gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga tcggcggatg 900

tttcttcgat gactccgccg gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga 960

gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc 1020

ctgcggctta atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata gtgaggattg 1080

acagattgag agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt 1140

gggttgcctt gtcaggttga ttccggtaac gaacgagacc tcagcctgct aaatagtcac 1200

ggttggttcg ccagccggcg gacttcttag agggactatt ggcgactagc caatggaagc 1260

atgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact 1320

gatgcattca acgagcttag ccttggccga gaggcccggg taatctttga aactgcatcg 1380

tgatggggat agattattgc aattattaat cttcaacgag gaatgcctag taagcgcaat 1440

tcatcagatt gcgttgatta cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gctcctaccg 1500

attgggtgtg ctggtgaagt gttcggattg gcgaccgggg gcggtctccg ctctcggccg 1560

ccgagaagtt cattaaaccc tcccacctag ag 1592

<210> 2

<211> 1585

<212> DNA

<213> 普通小球藻（Chlorella vulgaris）

<400> 2

agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac gtatatatta gataaaaggc 60

cgaccgggct ttgcccgacc cgcggtgaat catgatatct tcacgaagcg catggccttg 120

tgccggcgct gttccattca aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagaggcc 180

taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga 240

aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc tgatacgggg 300

aggtagtgac aataaataac aataccgggc atttaatgtc tggtaattgg aatgagtaca 360

atctaaatcc cttaacgagg atccattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa 420

ttccagctcc aatagcgtat atttaagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttggatttc 480

gggtgggttc tagcggtccg cctatggtga gtactgctat ggcctatctt tctgtccggg 540

acgggcttct gggcttaact gtccgggact cggagtcgac gtggttactt tgagtaaatt 600

agagtgttca aagcaggctt acgccctgaa tactttagca tggaataaca cgataggact 660

ctggcctatc ttgttggtct gtaggactgg agtaatgatt aagagggaca gtcgggggca 720

ttcgtatttc attgtcagag gtgaaattct tggatttatg aaagacgaac tactgcgaaa 780

gcatttgcca aggatgtttt cattaatcaa gaacgaaagt tgggggctcg aagacgatta 840

gataccgtcg tagtctcaac cataaacgat gccgactagg gattggcgaa tgttttttta 900

atgacttcgc cagcacctta tgagaaatca aagtttttgg gttccggggg gagtatggtc 960

gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct 1020

taatttgact caacacggga aaacttacca ggtccagaca tagtgaggat tgacagattg 1080

agagctcttt cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg gtgggttgcc 1140

ttgtcaggtt gattccggta acgaacgaga cctcagcctg ctaaatagtc ctagttgctt 1200

tttgcagcta gctgacttct tagagggact attggcgttt agtcaatgga agtatgaggc 1260

aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac actgatgcat 1320

tcaacaagcc tatccttgac cgaaaggtcc gggtaatctt tgaaactgca tcgtgatggg 1380

gatagattat tgcaattatt agtcttcaac gaggaatgcc tagtaagcgc aagtcatcag 1440

cttgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctccta ccgattgggt 1500

gtgctggtga agtgttcgga ttggcagctt agggtggcaa cacctcaggt ctgccgagaa 1560

gttcattaaa ccctcccacc tagag 1585