專利名稱：以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種微生物利用農(nóng)業(yè)廢棄物(農(nóng)作物秸稈、蔗渣和 玉米芯)半纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是一種以動(dòng)植物油脂為原料生產(chǎn)的能夠替代化石柴油的綠色可再生能源，在石 油能源替代戰(zhàn)略中具有十分重要的地位。目前生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)主要以大豆油、菜籽油 以及廢油脂為原料。我國人多地少，以食用油為原料生產(chǎn)生物柴油不符合國情，而廢油脂的 數(shù)量有限，無法滿足現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)社會(huì)對(duì)能源的巨大需求。微生物油脂，又稱單細(xì)胞油脂，是微 生物生命活動(dòng)中的一種代謝產(chǎn)物。某些微生物如酵母、霉菌、微藻、細(xì)菌能夠積累大量油脂， 有的菌體中油脂含量甚至達(dá)到干菌絲體的70°/。以上。這些油脂與一般植物油脂有類似的脂肪 酸組成，因此是一種具有巨大潛力的新型生物柴油生產(chǎn)原料。與動(dòng)植物油脂相比，用微生物 生產(chǎn)油脂具有如下優(yōu)點(diǎn)生長周期短，占地面積小，不受場地、氣候和季節(jié)限制，能連續(xù)大 規(guī)模生產(chǎn)。但傳統(tǒng)的油脂發(fā)酵以葡萄糖等為碳源，成本過高，限制了其在生物柴油生產(chǎn)中的 應(yīng)用。利用各種工農(nóng)業(yè)廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、食品工業(yè)和造紙行業(yè)廢水等發(fā)酵生產(chǎn)油脂， 既可大大降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，又有利于環(huán)境保護(hù)。
木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。 目前，纖維素和木質(zhì)素均可找到有效利用的途徑，而半纖維素尚未得以有效利用。我國是一
個(gè)農(nóng)業(yè)大國，各種農(nóng)業(yè)廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、蔗渣等數(shù)量巨大，僅農(nóng)作物秸稈每年就達(dá)7
億噸以上。過去，這部分木質(zhì)纖維素資源經(jīng)常被廢棄或低值化利用，如農(nóng)作物秸稈經(jīng)焚燒后 用于農(nóng)田堆肥，但焚燒過程中產(chǎn)生的黑煙會(huì)污染環(huán)境。近年來，雖然眾多研究表明可利用秸 稈或庶渣來生產(chǎn)燃料乙醇等，但實(shí)際上被利用的主要是纖維素成分。相似的，不少利用木質(zhì) 纖維素為原料產(chǎn)油脂的研究也是主要利用其纖維素成分，而對(duì)于半纖維素成分，卻往往不能 高效利用。半纖維素的主要組分是木聚糖，水解后可得到木糖、葡萄糖和阿拉伯糖等，且以 木糖為主，而自然界中很少微生物能夠利用木糖。利用一些特殊的微生物能夠以木糖為碳源
和能源積累油脂的特性，如發(fā)酵性絲孢酵母(7Wc/w^ora" /er附e"tora)，以農(nóng)業(yè)廢棄物半纖維 素水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)油脂，可大大降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物中半纖維素資源的高值化利用，并有利于改善目前能源短缺和環(huán)境惡化的狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，高效利 用半纖維素發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。
本發(fā)明以廉價(jià)的農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，用稀酸將其水解，水解液經(jīng)解毒預(yù)處理并濃縮后， 添加少量的氮源與微量元素，經(jīng)產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化獲取油脂。本方法將顯著降低微生物油脂的 生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物半纖維素資源的高值化利用。
本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)-
以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，包括如下步驟和工藝條件 (O半纖維素的水解將農(nóng)業(yè)廢棄物粉碎至20—100目，按照農(nóng)業(yè)廢棄物與水解酸溶液 的固液比為1 g: 10—20mL加入水解酸溶液，于110_140 。C下水解1—3h得到半纖維素水 解液；
(2)解毒預(yù)處理包括Ca(0H)2處理和吸附處理； Ca(0H)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至10.0—12.0，保持1 — 1.5 h 后，過濾，用酸將濾液pH調(diào)節(jié)為5.5—6.0，靜置l一2h，離心10—20min除去沉淀； 吸附處理選自步驟a、 b和c吸附中的一種
a. 活性炭吸附按照活性炭與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1 g : 5—10 mL加入活性炭， 在30—40 'C下攪拌處理1 一2 h后過濾除去活性炭；
b. 離子交換樹脂吸附按照離子交換樹脂與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1 g : 5—10 mL加入離子交換樹脂，在30—40 'C下攪拌處理1 一2 h后過濾除去離子交換樹脂；
c. 大孔樹脂吸附按照大孔樹脂與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1 g : 5 — 10mL加入大 孔樹脂，在30—40 'C下攪拌處理l一2h后過濾除去大孔樹脂；
G)發(fā)酵培養(yǎng)基制備解毒預(yù)處理后的水解液在減壓條件下，于60— 70'C下濃縮至還原 糖濃度為80—120 g/L,然后按照其在混合物中的濃度添加如下物質(zhì)1.2_2.4 g/L蛋白胨、 0.25—0.75 g/L酵母粉、0.4—0.6 g/L MgS04'7H20、 1.5—2.5 g/L KH2P04、 0.003 — 0.005 g/L MnSCU.H20和0.0001—0.0002 g/L CuS04'5H20,用酸調(diào)節(jié)pH至6,0_6.5，經(jīng)滅菌后作為發(fā) 酵培養(yǎng)基；
(4)按體積比5 —15 : 100于發(fā)酵培養(yǎng)基中接入發(fā)酵性絲孢酵母(7Hc/zo^pora"/en^"tom) 種子液，在25—28。C培養(yǎng)7—9天，離心收集菌體，經(jīng)有機(jī)溶劑提取方法獲得微生物油脂。 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，所述有機(jī)溶劑提取方法為按每克干菌體加入10mL濃度為3.5—4.5mol/LHCl,于80-100 。C處理30—60 min;冷卻后按體積比為2:1加入的氯仿和甲醇 混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微生物油脂。 所述HC1的濃度優(yōu)選為4mol/L。
所述農(nóng)業(yè)廢棄物優(yōu)選為水稻稈、小麥稈、高粱稈、玉米秸稈、蔗渣或玉米芯。 所述水解酸優(yōu)選為硫酸、鹽酸或磷酸。 所述步驟(2) Ca(OH)2處理中酸優(yōu)選為硫酸、鹽酸或磷酸。 所述步驟(3)發(fā)酵培養(yǎng)基制備中調(diào)節(jié)pH所用的酸優(yōu)選為硫酸、鹽酸或磷酸。 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的以農(nóng)業(yè)廢棄物半纖維素水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的 方法，具有下述優(yōu)點(diǎn)-
(1) 本發(fā)明能夠有效地利用農(nóng)業(yè)廢棄物中的半纖維素成分來發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，為解 決木質(zhì)纖維素資源中半纖維素難以利用的難題提供了新方法和新途徑；
(2) 所利用的農(nóng)作物廢棄物均為可再生資源，且來源廣泛、價(jià)格低廉，以其為原料生產(chǎn) 油脂不僅可變廢為寶，降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，并且有利于環(huán)境保護(hù)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，本發(fā)明的實(shí)施例不限如此。 實(shí)施例l
1) 水稻秸稈半纖維素水解液制備
將水稻秸稈粉碎至20目，稱取40 g，按照水稻秸稈(固體)與2% (重量)稀硫酸(液 體)的固液比為1 g : 20mL加入稀硫酸溶液，于121 °C下水解1 h，過濾后得水解液。
2) 水解液的解毒處理
a, Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至10.0，保持1 h后，過 濾。用HC1調(diào)節(jié)濾液pH到5.5，靜置1h，再離心10min除去沉淀。
b. 活性炭吸附按固液比1 g :10 mL，將活性炭(粒徑為2.5 mm，德國Merck公司生產(chǎn)) 加入步驟a所得的水解液中，在40 'C下攪拌處理1 h后過濾除去活性炭。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于60。C下濃縮至還原糖濃度為100 g/L，然后按照其在 該步驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)1.8 g/L的蛋白胨、0.5 g/L的酵母粉、0.4 g/L的 MgSO4-7H2O、2.0 g/L的KH2PO4、0.003 g/L的MnS04.H20和0.0001g/LCuSO4'5H2O，用H2S04 調(diào)節(jié)pH至6.5， 121'C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
6發(fā)酵性絲孢酵母(rr/c/205porafz/mMe"toraCICC 1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28'C、 160r/min培養(yǎng)24h，制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵
以10% (體積)接種量將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25'C、 160 r/min培養(yǎng)8天，停 止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min，收集菌體，用水洗滌后于105'C干燥至恒重，得 干菌體18.2g/L。
6) 微生物油脂提取
按每克干菌體加入10mL4mol/LHCl，于80'C處理60 min;冷卻后加入體積比為2:1的 氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微生物 油脂，菌體油脂含量為35.6%。
實(shí)施例2
1) 玉米芯半纖維素水解液制備
將玉米芯粉碎至40目，稱取40 g，按照玉米芯(固體)與3% (重量)稀鹽酸溶液(液 體)的固液比為1 g : 10mL加入稀鹽酸溶液，于140°C下水解3 h，過濾后獲得水解液。
2) 水解液的解毒處理
a. Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至10.0，保持1.5 h后， 過濾。用H2S04調(diào)節(jié)濾液pH到6.0,靜置2h，再離心15min除去沉淀。
b. 離子交換樹脂吸附將離子交換樹脂Bio-Rad AG l-X8按固液比1 g : 5mL加入水解液 中，在3(TC下攪拌處理2h后過濾除去離子交換樹脂。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于60'C下濃縮至還原糖濃度為80 g/L，然后按照其在該 步驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)蛋白胨1.2g/L;酵母粉0.75g/L; MgS04'7H20 0.6 g/L; KH2P042.5 g/L; MnS04'H20 0.004 g/L; CuS04.5H20 0.0001 g/L，用HC1調(diào)節(jié)pH至6.0， 121 'C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
發(fā)酵性絲孢酵母(7Wc/205pora /^we tara CICC 1368 ，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28。C、 160r/min培養(yǎng)24h，制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵以5°/。接種量(體積)將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28'C、 160 r/min培養(yǎng)9天，停 止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10min,收集菌體，用水洗滌后于105 'C干燥至恒重，得 干菌體21.6g/L。
6)微生物油脂提取
按每克干菌體加入10mL4.5mol/LHCl，于90 。C水浴處理40min;冷卻后加入體積比為 2:1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微 生物油脂，菌體油脂含量為34.3%。
實(shí)施例3
1) 蔗渣半纖維素水解液制備
將蔗渣粉碎至IOO目，稱取40 g，按照蔗渣(固體)與4% (重量)稀硫酸(液體)的固 液比為1 g : 15 mL加入稀硫酸溶液，于140 。C下水解1.5 h，過濾后獲得水解液。
2) 水解液的解毒處理
a, Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至11.0，保持1 h后，過 濾。用H3PCU調(diào)節(jié)濾液pH到5.5，靜置1.5h，再離心20min除去沉淀。
b. 大孔樹脂吸附將大孔樹脂AmberliteXAD-4按固液比1 g:5mL加入水解液中，在40 'C下攪拌處理1 h后過濾除去大孔樹脂。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于70 'C下濃縮至還原糖濃度為120 g/L，然后按照其在 該步驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)蛋白胨2.4g/L;酵母粉0.25g/L; MgSCV7H20 0.5 g/L; KH2P041.5 g/L; MnS04-H20 0駕g/L; CuS04'5H20 0.0002 g/L，用H3P04調(diào)節(jié)pH至 6.0， 121 。C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
發(fā)酵性絲孢酵母(7Hc/zo^xjTO"/er附e"tora CICC 1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28'C、 160r/min培養(yǎng)24h，制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵
以15%接種量(體積)將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25'C、 160 r/min培養(yǎng)7天，停 止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10min，收集菌體，用水洗滌后于105 'C干燥至恒重，得 干菌體25.2 g/L。
6) 微生物油脂提取按每克干菌體加入10 mL 3。5 mol/L HC1，于100 'C水浴處理30 min;冷卻后加入體積比 為2:1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得 到微生物油脂，菌體油脂含量為38.4%。
實(shí)施例4
1) 玉米秸稈半纖維素水解液制備
將玉米秸稈粉碎至60目，稱取40 g，按照玉米秸稈(固體)與2% (重量)稀磷酸(液 體)的固液比為1 g : 10 mL加入稀磷酸溶液，于110 。C下水解3 h，過濾后獲得水解液。
2) 水解液的解毒處理
a, Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至12.0，保持1 h后，過 濾。用H2S04調(diào)節(jié)濾液pH到5.5，靜置lh,再離心20min除去沉淀。
b. 活性炭吸附將活性炭(粒徑為2.5 mm，德國Merck公司生產(chǎn))按固液比1 g : 5 mL 加入水解液中，在30 'C下攪拌處理2h后過濾除去活性炭。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于65 'C下濃縮至還原糖濃度為110 g/L，然后按照其在 該步驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)蛋白胨1.6g/L;酵母粉0.75g/L; MgS04，7H20, 0.4g/L; KH2PO42.0 g/L; MnSO4'H2O0.004 g/L; CuSO4'5H2O0,0002 g/L，用H2S04調(diào)節(jié)pH至 6.5， 121'C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
發(fā)酵性絲孢酵母(7h'c/KW/7oraw/m^"toraCICC 1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28。C、 160 r/min培養(yǎng)24 h，制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵
以12.5%接種量(體積)將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 °C、 160 r/min培養(yǎng)7天， 停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min，收集菌體，用水洗滌后于105 'C干燥至恒重， 得干菌體19.2g/L。
6) 微生物油脂提取
按每克千菌體加入10 mL 4 mol/L HC1，于80 t:水浴處理60 min;冷卻后加入體積比為 2:1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微 生物油脂，菌體油脂含量為28.0%。
實(shí)施例5
91) 高粱秸稈半纖維素水解液制備
將高粱秸稈粉碎至80目，稱取40 g，按照高粱秸稈(固體)與6% (重量)稀鹽酸(液 體)的固液比為lg: lOmL加入稀鹽酸溶液，于130。C下水解2.5 h，過濾后獲得水解液。
2) 水解液的解毒處理
a. Ca(0H)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至10.0，保持1.5 h后， 過濾。用H2S04調(diào)節(jié)濾液pH到5.5，靜置lh，再離心10min除去沉淀。
b. 離子交換樹脂吸附將離子交換樹脂Purolite MN-150按固液比1 g : lOmL加入水解液 中，在4(TC下攪拌處理lh后過濾除去離子交換樹脂。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于60 t:下濃縮至還原糖濃度為90，然后按照其在該步 驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)蛋白胨1.8g/L;酵母粉0.5g/L; MgS04*7H20 0.4 g/L; KH2PO42.0 g/L; MnS04'H20 0.003 g/L; CuS04.5H20 0.0001 g/L，用113 04調(diào)節(jié)pH至6.5， 121 。C滅菌20min,制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
發(fā)酵性絲孢酵母(rric/Kw;wra"/erwe"toraCICC 1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28'C、 160 r/min培養(yǎng)24 h,制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵
以10%接種量(體積)將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28。C、 160 r/min培養(yǎng)9天，停 止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min,收集菌體，用水洗滌后于105 'C干燥至恒重，得 干菌體21.8g/L。
6) 微生物油脂提取
按每克干菌體加入10 mL 4 mol/L HC1，于100 'C水浴處理30 min;冷卻后加入體積比為 2:1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微 生物油脂，菌體油脂含量為33.1%。
實(shí)施例6
1) 小麥秸稈半纖維素水解液制備
將小麥秸稈粉碎至100目，稱取40 g，按照小麥秸稈(固體)與4% (重量)稀硫酸(液 體)的固液比為1 g: lOmL加入稀硫酸溶液，于140 °C下水解1 h,過濾后獲得水解液。
2) 水解液的解毒處理
10a, Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至12.0，保持1 h后，過 濾。用HC1調(diào)節(jié)濾液pH至J 5.5，靜置1h，再離心15min除去沉淀。
b. 離子交換樹脂吸附將離子交換樹脂Bio-Rad AG50W-X8按固液比1 g : lOtnL加入水解 液中，在4(TC下攪拌處理lh后過濾除去離子交換樹脂。
3) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制
解毒后的水解液在減壓條件下，于60'C下濃縮至還原糖濃度為90g/L，然后按照其在該 步驟最終混合物中的濃度添加如下物質(zhì)蛋白胨1.8g/L;酵母粉0.25g/L; MgSCV7H20 0.5 g/L; KH2PO42.0g/L; MnS04'H20 0.004 g/L; CuS04'5H20 0,0002 g/L，用HC1調(diào)節(jié)pH至6.5, 121 'C滅菌20min，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。
4) 液體種子培養(yǎng)
發(fā)酵性絲孢酵母(7Wc/^/wo"/ementomCICC 1368，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L， pH為6.0)中于28。C、 160r/min培養(yǎng)24h，制得發(fā)酵種子液。
5) 微生物油脂發(fā)酵
以10%接種量(體積比)將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28。C、 160r/min培養(yǎng)9天， 停止發(fā)酵；將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min，收集菌體，用水洗滌后于105 'C干燥至恒重， 得干菌體24.8 g/L。
6) 微生物油脂提取
按每克干菌體加入10 mL 4 mol/L HC1，于80 。C水浴處理60 min;冷卻后加入體積比為 2:1的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微 生物油脂，菌體油脂含量為35.5%。
實(shí)施例7
與實(shí)施例3的不同之處在于步驟1)中原料為水稻秸稈，粉碎至40目，水解溫度和時(shí)間分 別為130'C和2h;步驟2)中所用大孔樹脂為Amberiite XAD-8，固液比為1 g :10 mL，攪 拌處理溫度和時(shí)間分別為30'C和2h;步驟5)中微生物油脂發(fā)酵時(shí)間為8天。實(shí)施結(jié)果得到千 菌體28.0g/L，菌體油脂含量為40.1%。
實(shí)施例8
與實(shí)施例2的不同之處在于步驟1)中原料為玉米秸稈，所用的稀酸為3%的稀硫酸，步驟 2)中所用離子交換樹脂為Purolite MN-150。實(shí)施結(jié)果得到干菌體21.2 g/L，菌體油脂含量為 29.6%。實(shí)施例9
與實(shí)施例2的不同之處在于步驟1)中原料為高粱秸稈，所用的稀酸為2%的稀硫酸，步驟 2)中所用離子交換樹脂為Purolite A-860S。實(shí)施結(jié)果得到干菌體20.1 g/L，菌體油脂含量為 34.4% 。
實(shí)施例IO
與實(shí)施例3的不同之處在于步驟1)中原料為水稻秸稈，粉碎至60目，所用的稀酸為2%的 稀硫酸，步驟2)中所用大孔樹脂為AmberliteXAD-8。實(shí)施結(jié)果得到干菌體25.8 g/L，菌體油 脂含量為38.5%。
權(quán)利要求
1、以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件(1)半纖維素的水解將農(nóng)業(yè)廢棄物粉碎至20-100目，按照農(nóng)業(yè)廢棄物與水解酸溶液的固液比為1g∶10-20mL加入水解酸溶液，于110-140℃下水解1-3h得到半纖維素水解液；(2)解毒預(yù)處理包括Ca(OH)2處理和吸附處理；Ca(OH)2處理向水解液中加入Ca(OH)2粉末，調(diào)節(jié)其pH至10.0-12.0，保持1-1.5h后，過濾，用酸將濾液pH調(diào)節(jié)為5.5-6.0，靜置1-2h，離心10-20min除去沉淀；吸附處理選自步驟a、b和c吸附中的一種a.活性炭吸附按照活性炭與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1g∶5-10mL加入活性炭，在30-40℃下攪拌處理1-2h后過濾除去活性炭；b.離子交換樹脂吸附按照離子交換樹脂與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1g∶5-10mL加入離子交換樹脂，在30-40℃下攪拌處理1-2h后過濾除去離子交換樹脂；c.大孔樹脂吸附按照大孔樹脂與Ca(OH)2處理所得水解液固液比1g∶5-10mL加入大孔樹脂，在30-40℃下攪拌處理1-2h后過濾除去大孔樹脂；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基制備解毒預(yù)處理后的水解液在減壓條件下，于60-70℃下濃縮至還原糖濃度為80-120g/L，然后按照其在混合物中的濃度添加如下物質(zhì)1.2-2.4g/L蛋白胨、0.25-0.75g/L酵母粉、0.4-0.6g/L MgSO4·7H2O、1.5-2.5g/L KH2PO4、0.003-0.005g/LMnSO4·H2O和0.0001-0.0002g/L CuSO4·5H2O，用酸調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，經(jīng)滅菌后作為發(fā)酵培養(yǎng)基；(4)按體積比5-15∶100于發(fā)酵培養(yǎng)基中接入發(fā)酵性絲孢酵母種子液，在25-28℃培養(yǎng)7-9天，離心收集菌體，經(jīng)有機(jī)溶劑提取方法獲得微生物油脂。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述有機(jī)溶劑提取方法為按每克干菌體加入10mL濃度為3,5—4.5mol/LHCl，于80—100 'C處理30—60min;冷卻后按體積比為2 : 1加入的氯仿和甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，收集氯仿 層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除有機(jī)溶劑，得到微生物油脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述HC1的濃度為4mol/L。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述農(nóng)業(yè)廢棄物為水稻稈、小麥稈、高粱稈、玉米秸稈、蔗渣或玉米芯。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述水解酸為硫酸、鹽酸或磷酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述步驟(2) Ca(OH)2處理中酸為硫酸、鹽酸或磷酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于 所述步驟(3)發(fā)酵培養(yǎng)基制備中調(diào)節(jié)pH所用的酸為硫酸、鹽酸或磷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。該方法將農(nóng)業(yè)廢棄物用稀酸水解，水解液經(jīng)解毒預(yù)處理后制備發(fā)酵培養(yǎng)基，濃縮至還原糖濃度為80-120g/L，然后按照其在混合物中的濃度添加1.2-2.4g/L蛋白胨、0.25-0.75g/L酵母粉等，滅菌后按體積比為5-15％接入微生物種子液，培養(yǎng)7-9天，離心收集菌體，按有機(jī)溶劑提取方法獲得微生物油脂。解毒預(yù)處理為Ca(OH)₂處理和吸附處理。本發(fā)明原料來源廣泛、價(jià)格低廉，工藝簡單易行，可實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物中半纖維素資源的高值化利用，降低微生物油脂的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C11B1/00GK101580856SQ200910040550
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者虹 吳, 宗敏華, 超 黃 申請人:華南理工大學(xué)