本發(fā)明涉及沉積物中腐殖質(zhì)的提取、純化及分級，屬于腐殖物質(zhì)提取領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腐殖物質(zhì)(humicsubstance，hs)是自然環(huán)境中廣泛存在的一類高分子、含有多種官能團的聚電解質(zhì)，廣泛存在于土壤、河流、湖泊以及海洋中，地球表面的腐殖物質(zhì)的總量已達1.5×10⁶kg，在水環(huán)境中，河水中腐殖質(zhì)的平均含量為10-50mg/l，底泥腐殖質(zhì)含量更為豐富，約占底泥1％-3％。

在水環(huán)境中，腐殖物質(zhì)與金屬離子、礦物膠和非腐殖化有機物相互作用形成一個復(fù)雜的體系，只有從水和沉積物中分離出游離態(tài)的腐殖質(zhì)，才能對其結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)和功能進行詳細的研究。

沉積物中腐殖質(zhì)的定量提取、分離與純化是對腐殖質(zhì)進行研究的前提，而目前，據(jù)報道提取土壤及沉積物中腐殖質(zhì)的方法有很多，包括有機溶劑提取、無機溶劑提取和有機/無機溶劑混合提取法。傳統(tǒng)焦磷酸鈉法最大問題在于，僅利用硫酸分離腐殖酸和富里酸，另外分離過程需在溫度為80的條件下進行，該方法提取出來的腐殖質(zhì)純度不夠，腐殖酸和富里酸分離不完全，丙酮、dmso、pyridine、二氧雜環(huán)己烷等有機溶劑提取的腐殖質(zhì)提取產(chǎn)率低，提取的多為分子量小的有機質(zhì)，且部分有機提取劑最終很難與有機質(zhì)分離(hayes、eloff等)，由于缺少標(biāo)準方法，在以往的研究中，沉積物腐殖質(zhì)的提取方法各有不同，提取劑，提取液劑量，提取次數(shù)，純化方法的選擇各有特點，使得研究的數(shù)據(jù)可比性較低。

腐殖質(zhì)作為自行組裝的超分子聚合體，其中相對分子量小的分子通過氫鍵和疏水鍵與聚合體相結(jié)合。分子量大小不同的組成對環(huán)境中的生物化學(xué)作用各自不同，特別是小分子量的腐殖質(zhì)可以通過土壤空隙與化合物接觸，進而發(fā)生各種反應(yīng)。因此，通過分子量不同將純化后的腐殖酸和富里酸進行分級，得到不同的亞組分對進一步研究腐殖質(zhì)的性質(zhì)特征尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種沉積物中腐殖質(zhì)的提取、純化和分級方法，以解決現(xiàn)有腐殖質(zhì)提取缺少標(biāo)準方法，各種方法間研究的數(shù)據(jù)可比性較低，而國際腐殖質(zhì)推薦的方法無法將沉積物中活性有機質(zhì)(在植物根系和微生物作用下可以釋放的有機質(zhì))完全提取出來的問題，進而對提取純化后的腐殖質(zhì)進行分級以更好的研究腐殖質(zhì)的化學(xué)特性。

為解決上述問題，擬采用這樣一種沉積物中腐殖質(zhì)的提取、純化和分級方法，包括：

首先將底泥離心，冷凍干燥，對底泥進行前處理，去除樹根和石子，向土壤樣品中加入超純水，使固液比為1：5，用酸(1mhcl)調(diào)ph值到1，然后向固液混合物中加入0.1mhcl，使固液比為1：10，連續(xù)攪拌6h，靜置24h后離心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉積物樣品；

向酸洗沉積物樣品中加入超純水，使其固液比為1:5，向固液混合物中通入氮氣15min以排除溶解氧，腐殖酸在中性和堿性條件下易被溶解氧氧化改變其本身性質(zhì)，向混合物中持續(xù)通入氮氣，在氮氣保護下，加入1mnaoh，使其ph為7，然后在氮氣保護下，冷卻至20℃，加入焦磷酸鈉溶液，并用超純水稀釋，使焦磷酸鈉濃度為0.2m且固液比為1:10，將加入焦磷酸鈉的土壤固液混合物隔絕空氣持續(xù)攪拌8h，在此期間通氮氣3次，每次15min，以排除溶解氧的影響，然后靜置24h后，離心得上清液ii和殘渣，丟棄殘渣；

在氮氣保護下，向上清液ii加1mhcl使溶液ph值為1，磁力攪拌30min后，靜置28h，使富里酸和腐殖酸充分分離，隨后離心分離，即得上清液為富里酸2，沉淀為腐殖酸；

純化腐殖酸：

在氮氣保護下，向腐殖酸沉淀中加入0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，記錄所消耗naoh的體積，而后加入nacl固體，使溶液中na⁺為0.3m，高速(10000rpm)離心，快速將上清液iii和沉淀分離，丟棄沉淀，向上清液iii中迅速加入6mhcl，使其酸化至ph＝1，攪拌30min，靜置24h，離心后去除上清液，沉淀即為無雜酸的腐殖酸；

向沉淀中加入0.1mhcl/0.3mhf溶液中，使固液比為1:10，振蕩過夜，離心分離，得沉淀。重復(fù)此步驟2‐3次，即得無硅腐殖酸；

向無硅腐殖質(zhì)中加入超純水，使之為泥狀后轉(zhuǎn)至透析袋中，透析48‐72h，期間換2‐3次透析溶液，對透析袋外的溶液進行鉬氨酸分光光度法和硝酸銀檢測透析袋外溶液中磷含量和氯離子含量,如果磷含量>0.01mg/l或者有氯化銀沉淀出現(xiàn)，則繼續(xù)更換透析袋外超純水，攪拌24h后，再次測定，直至磷含量<0.01mg/l且檢測不出氯離子；

將透析袋中泥狀腐殖酸轉(zhuǎn)至燒杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固體粉末即為純化后的腐殖酸；

腐殖酸的分級：

將純化后的富里酸固體用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后轉(zhuǎn)至截留分子量為3500的透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露，將裝有腐殖酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的ph7的naoh溶液中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，每隔24h更換naoh溶液并將其收集，放置于冰箱，72h后將收集三次的naoh溶液混合，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分1。

將截留分子量為3500透析袋中的腐殖酸溶液轉(zhuǎn)至截留分子量為15000透析袋中，按處理腐殖酸亞組分1的步驟來進行分級，得到腐殖酸亞組分2。

將透析72h后的截留分子量為14000透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分3。

純化富里酸：

將上清液i以每小時15倍床的速度通過xad‐8大孔吸附樹脂，每1g沉積物樣品對0.15ml樹脂，丟棄出水，用0.65倍柱體積的超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用1倍體積的0.1mnaoh沖洗柱子，再用2‐3倍柱體積的超純水沖洗柱子，接液，立即用6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中務(wù)必使富里酸全部溶解，得富里酸a；

將富里酸2通過xad‐8大孔吸附樹脂，每克沉積物樣品對2.0ml‐3.0ml樹脂，沖洗速度為每小時15床，出水是否接液依其顏色而定，若基本無色則無需接液，若出水顏色較深則需接液，待富里酸2溶液全部通過樹脂后，用0.65倍柱體積的超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8樹脂，然后用1倍體積的0.1mnaoh沖洗柱子，然后用3‐4倍柱體積的超純水沖洗柱子，接液，立即用6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中富里酸全部溶解，得富里酸b；

富里酸2的出水再次通過xad‐8吸附樹脂，每1g沉積物樣品對1.0‐2.0ml樹脂，按處理富里酸1的步驟來進行洗滌和酸化，得富里酸c，將富里酸a,b和c洗滌液收集起來，混合，將其通過xad‐8吸附樹脂，吸附柱體積為樣品體積的1/5，用體積為0.65倍柱體積的蒸餾水漂洗樹脂，等于柱體積的0.1mnaoh溶液洗滌吸附樹脂，再用2倍柱體積的蒸餾水漂洗，將洗滌液通過2‐3倍溶液中na+摩爾量的飽和的732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂，接液，冷凍干燥提取物即可得到純化后的富里酸。

富里酸的分級：

將純化后的富里酸固體用少量的超純水溶解完全后轉(zhuǎn)至截留分子量為3500的透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露。將裝有富里酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的燒杯中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。每隔24h更換超純水并將其收集，放置于冰箱。72h后將收集三次的超純水混合，冷凍干燥，得到富里酸亞組分1。

將截留分子量為3500透析袋中的富里酸溶液轉(zhuǎn)至截留分子量為14000透析袋中，按處理富里酸亞組分1的步驟來進行分級，得到富里酸亞組分2。

將透析72h后的截留分子量為14000透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷凍干燥，得到富里酸亞組分3。

與現(xiàn)有技術(shù)及國際腐殖質(zhì)推薦的方法相比較，本發(fā)明所述方法能夠?qū)⑼寥兰俺练e物中活性有機質(zhì)更為完全提取出來，從而可以更全面、完整地表征土壤活性機質(zhì)的特性，同時，將傳統(tǒng)焦磷酸鈉法進行改進，對提取物通過聯(lián)合樹脂進行純化，以獲得全面的、高純度腐殖酸及富里酸，通過透析對不同分子量的腐殖酸和富里酸進行分級，獲得純化后腐殖酸和富里酸的亞組分，可更好地研究不同分子量的腐殖酸和富里酸的氧化還原、光化學(xué)活性等性質(zhì)特征。

附圖說明

圖1是富里酸的紅外圖譜；

圖2是富里酸的三維熒光光譜；

圖3是腐殖酸的紅外圖譜；

圖4是腐殖酸的三維熒光光譜。

具體實施方式

實施例1：

參照附圖1至4。

采集貴陽市百花湖中底泥，將底泥離心，冷凍干燥后得到底泥粉末，去除樹根和石子。稱取干燥后的底泥樣品50g。向土壤樣品中加入250ml超純水，使固液比為1：5，用78ml1mhcl將混合物調(diào)ph值到1，然后向固液混合物中加入172ml0.1mhcl，使固液比為1：10，連續(xù)攪拌6h，靜置24h后離心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉積物樣品；得富里酸1為450ml。

向酸洗沉積物樣品中加入246ml超純水，使其固液比為1:5，向固液混合物中通入氮氣15min以排除溶解氧，在氮氣保護下，加入4ml1mnaoh，使其ph為7，然后在氮氣保護下，，加入250ml0.2m冷卻至20℃的焦磷酸鈉溶液，使固液混合物中焦磷酸鈉濃度為0.1m且固液比為1:10，將加入焦磷酸鈉的土壤固液混合物隔絕空氣持續(xù)攪拌8h，在此期間通氮氣3次，每次15min，以排除溶解氧的影響，然后靜置24h后，離心得495ml上清液ii和殘渣，丟棄殘渣；

在氮氣保護下，向上清液ii加152ml1mhcl使溶液ph值為1，磁力攪拌30min后，靜置28h，使富里酸和腐殖酸充分分離，隨后離心分離，即得647ml富里酸2，沉淀為腐殖酸；

沉積物中腐殖質(zhì)的純化：

步驟一：在氮氣保護下，向腐殖酸沉淀中加入11.7ml0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，而后加入0.136gnacl固體高速(10000rpm)離心，快速將上清液iii和沉淀分離，丟棄沉淀，向上清液iii中迅速加入1.3ml6mhcl，使其酸化至ph＝1，攪拌30min，靜置24h，離心后去除上清液，沉淀即為無雜酸的腐殖酸；

向沉淀中加入少許0.1mhcl/0.3mhf溶液將固液混合物轉(zhuǎn)至塑料瓶中，反復(fù)此步驟3‐5次，將沉淀完全轉(zhuǎn)至塑料瓶中，將剩余hcl/hf全部轉(zhuǎn)入塑料瓶中，使固液比為1:10(共100ml0.1mhcl/0.3mhf溶液)，振蕩過夜，離心分離(5min，10000rpm)，得沉淀。重復(fù)此步驟3次，即得無硅腐殖酸；

向無硅腐殖酸中加入少量超純水，使之為泥狀后轉(zhuǎn)至md44(3500)透析袋中，透析72h，期間換3次透析溶液，對透析袋外的溶液進行鉬氨酸分光光度法和硝酸銀檢測透析袋外溶液中磷含量和氯離子含量,已檢測不出氯離子，磷含量為0.003mg/l，達到要求；

將透析袋中泥狀腐殖酸轉(zhuǎn)至燒杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固體粉末即為純化后的腐殖酸；

將純化后的腐殖酸固體用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后轉(zhuǎn)至visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露。將裝有腐殖酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的ph7的naoh溶液中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。每隔24h更換naoh溶液并將其收集，放置于冰箱。72h后將收集三次的naoh溶液混合，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分1。

將visakasemd34(3500)透析袋中的腐殖酸溶液轉(zhuǎn)至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按處理腐殖酸亞組分1的步驟來進行分級，得到腐殖酸亞組分2。

將透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分3。

步驟二：將450ml上清液i以112.5ml/h速度通過體積為7.5mlxad‐8大孔吸附樹脂丟棄出水，用4.86ml超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用7.5ml0.1mnaoh沖洗柱子，再用22.5ml的超純水沖洗柱子，接液，立即用0.53ml6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入1.05ml濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中務(wù)必使富里酸全部溶解，得31.58ml富里酸a；

將富里酸2通過150mlxad‐8大孔吸附樹脂，沖洗速度為2.25l/h，由于出水顏色較深，則需出水接液，待富里酸2溶液全部通過樹脂后，用97.5ml的超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8樹脂，然后用150ml0.1mnaoh沖洗柱子，然后用600ml超純水沖洗柱子，接液，立即用1.9ml6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入12.64ml濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中務(wù)必使富里酸全部溶解，得864ml富里酸b；

體積為864ml富里酸2的出水再次通過xad‐8吸附樹脂，過100ml樹脂，按處理富里酸1的步驟來進行洗滌和酸化，得477.8ml富里酸c，將富里酸a，b和c洗滌液收集起來，混合，將其通過270mlxad‐8吸附樹脂，用體積為175.5ml蒸餾水漂洗樹脂，270ml0.1mnaoh溶液洗滌吸附樹脂，再用540ml的蒸餾水漂洗，將洗滌液通過2‐3倍溶液中na⁺摩爾量的飽和的732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂，接液，冷凍干燥提取物即可得到純化后的富里酸。

富里酸的分級：

將純化后的富里酸固體用少量的超純水溶解完全后轉(zhuǎn)至截留分子量為visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露。將裝有富里酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的燒杯中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。每隔24h更換超純水并將其收集，放置于冰箱。72h后將收集三次的超純水混合，冷凍干燥，得到富里酸亞組分1。

將visakasemd34(3500)透析袋中的富里酸溶液轉(zhuǎn)至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按處理富里酸亞組分1的步驟來進行分級，得到富里酸亞組分2。

將透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷凍干燥，得到富里酸亞組分3。

實施例2：

采集遵義板山水庫底泥，將底泥離心，冷凍干燥后得到底泥粉末，去除樹根和石子。稱取干燥后的底泥樣品50g。向土壤樣品中加入250ml超純水，使固液比為1：5，用9ml1mhcl將混合物調(diào)ph值到1，然后向固液混合物中加入241ml0.1mhcl，使固液比為1：10，連續(xù)攪拌6h，靜置24h后離心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉積物樣品；得富里酸1為380ml。

向酸洗沉積物樣品中加入245ml超純水，使其固液比為1:5，向固液混合物中通入氮氣15min以排除溶解氧，在氮氣保護下，加入5ml1mnaoh，使其ph為7，然后在氮氣保護下，加入250ml0.2m冷卻至20℃的焦磷酸鈉溶液，使固液混合物中焦磷酸鈉濃度為0.1m且固液比為1:10，將加入焦磷酸鈉的土壤固液混合物隔絕空氣持續(xù)攪拌8h，在此期間通氮氣3次，每次15min，以排除溶解氧的影響，然后靜置24h后，離心得400ml上清液ii和殘渣，丟棄殘渣；

在氮氣保護下，向上清液ii加72ml1mhcl使溶液ph值為1，磁力攪拌30min后，靜置28h，使富里酸和腐殖酸充分分離，隨后離心分離，即得375ml上清液為富里酸2，沉淀為腐殖酸；

沉積物中腐殖質(zhì)的純化：

步驟一：在氮氣保護下，向腐殖酸沉淀中加入100ml0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，而后加入2.14gnacl固體高速(10000rpm)離心，快速將上清液iii和沉淀分離，丟棄沉淀，向上清液iii中迅速加入3.5ml6mhcl，使其酸化至ph＝1，攪拌30min，靜置24h，離心后去除上清液，沉淀即為無雜酸的腐殖酸；

向沉淀中加入少許0.1mhcl/0.3mhf將固液混合物轉(zhuǎn)至塑料瓶中，反復(fù)此步驟3‐5次，將沉淀完全轉(zhuǎn)至塑料瓶中，將剩余hcl/hf全部轉(zhuǎn)入塑料瓶中，使固液比為1:10(共250ml)，振蕩過夜，離心分離(5min，10000rpm)，得沉淀。重復(fù)此步驟3次，即得無硅腐殖酸；

向無硅腐殖酸中加入少量超純水，使之為泥狀后轉(zhuǎn)至md44(3500)透析袋中，透析72h，期間換3次透析溶液，對透析袋外的溶液進行鉬氨酸分光光度法和硝酸銀檢測透析袋外溶液中磷含量和氯離子含量,已檢測不出氯離子，磷含量為0.002mg/l，達到要求；

將透析袋中泥狀腐殖酸轉(zhuǎn)至燒杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固體粉末即為純化后的腐殖酸；

將純化后的腐殖酸固體用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后轉(zhuǎn)至visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露。將裝有腐殖酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的ph7的naoh溶液中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。每隔24h更換naoh溶液并將其收集，放置于冰箱。72h后將收集三次的naoh溶液混合，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分1。

將visakasemd34(3500)透析袋中的腐殖酸溶液轉(zhuǎn)至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按處理腐殖酸亞組分1的步驟來進行分級，得到腐殖酸亞組分2。

將透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷凍干燥，得到腐殖酸亞組分3。

步驟二：將380ml上清液i以117ml/h速度通過體積為7.8mlxad‐8大孔吸附樹脂丟棄出水，用5.07ml超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用7.8ml0.1mnaoh沖洗柱子，再用23.4ml的超純水沖洗柱子，接液，立即用0.6ml6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入0.82ml濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中務(wù)必使富里酸全部溶解，得39.0ml富里酸a；

將富里酸2通過120mlxad‐8大孔吸附樹脂，富里酸溶液顏色相對較淺，沖洗速度為2.25l/h，出水接液，待富里酸2溶液全部通過樹脂后，用78ml的超純水沖洗吸附富里酸的xad‐8樹脂，然后用120ml0.1mnaoh沖洗柱子，然后用360ml超純水沖洗柱子，接液，立即用2.0ml6mhcl將溶液酸化至ph＝1，加入12.6ml濃hf溶液，使體系中氫氟酸的最終濃度為0.5m，溶液中務(wù)必使富里酸全部溶解，得572ml富里酸b；

將富里酸a,b洗滌液收集混合，將其通過120mlxad‐8吸附樹脂用體積為78ml的蒸餾水漂洗樹脂，120ml0.1mnaoh溶液洗滌吸附樹脂，再用240ml蒸餾水漂洗，收集洗滌液將洗滌液通過2‐3倍溶液中na⁺摩爾量的飽和的732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂，接液，冷凍干燥提取物即可得到純化后的富里酸。

富里酸的分級：

將純化后的富里酸固體用少量的超純水溶解完全后轉(zhuǎn)至截留分子量為visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夾夾緊以防溶液從透析袋中泄露。將裝有富里酸溶液的透析袋放置于裝有500ml超純水的燒杯中，磁力攪拌72h，轉(zhuǎn)速為400rpm，燒杯外貼一層鋁箔紙以防光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。每隔24h更換超純水并將其收集，放置于冰箱。72h后將收集三次的超純水混合，冷凍干燥，得到富里酸亞組分1。

將visakasemd34(3500)透析袋中的富里酸溶液轉(zhuǎn)至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按處理富里酸亞組分1的步驟來進行分級，得到富里酸亞組分2。

將透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷凍干燥，得到富里酸亞組分3。