本發(fā)明屬于分析化學(xué)、有機化學(xué)、生物化學(xué)領(lǐng)域。具體涉及的是從bt發(fā)酵液中分離純化琥珀酸的方法。

背景技術(shù)：

琥珀酸，琥珀酸學(xué)名為丁二酸。分子量為118.09，無色結(jié)晶體，味酸，可燃。有二種晶形，相對密度1.572(25/4℃)。溶解特性：1g溶于13ml冷水、1ml沸水、18.5ml乙醇、6.3ml甲醇、36ml丙酮、20ml甘油和11ml乙醚，幾乎不溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和石油醚。分子結(jié)構(gòu)如下所示：

蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，bt)發(fā)酵液的上清對草生歐文氏桿菌有明顯的抑菌作用，經(jīng)過分離純化、核磁和質(zhì)譜分析確定該抑菌物質(zhì)為琥珀酸。發(fā)酵液的上清對草生歐文氏桿菌抑菌特性表明，與某些bt菌株發(fā)酵所生物合成的zwittermicina(簡寫zwa)特性相似。

蘇云金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，bt)晶體蛋白對害蟲具有毒殺性、同時對人類健康不構(gòu)成危害，這一點已經(jīng)被世界認(rèn)可。一方面，bt菌劑在外源上防治蟲害；另一方面，該殺蟲蛋白基因已經(jīng)被廣泛地用于轉(zhuǎn)基因植物，從內(nèi)源上控制蟲害。無論哪種形式，由于害蟲不斷地進化，導(dǎo)致某些害蟲對某特定基因型的殺蟲蛋白逐漸表現(xiàn)出抗性，殺蟲效果逐漸失去意義。解決該問題最好的方法是找到某種物質(zhì)，提高殺蟲蛋白的毒力活性。bt中的zwittermicina(簡寫zwa)擁有這個特性。張小朋等(2006)以相同的草生歐文氏桿菌為指示菌，利用來自于蠟狀芽胞桿菌(b.cereusbc)編號uw85的菌株發(fā)酵，獲得了zwa，并建立了對zwa的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線。在其隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，zwa協(xié)同晶體蛋白提高了對棉鈴蟲害蟲和甜菜夜蛾害蟲的藥效。

參考文獻：張小朋.2006.對甜菜夜蛾高毒力的蘇云金芽胞桿菌dl-23菌株的選育及其發(fā)酵優(yōu)化[d].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位畢業(yè)論文.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從bt發(fā)酵液中分離純化琥珀酸的方法。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明的發(fā)明人進行了辛勤的研究，將琥珀酸從bt發(fā)酵液中分離純化出來，整套方法由八個串聯(lián)步驟組成。這八個步驟有先后次序，且缺一不可。包括(1)al2o3去絮凝沉淀物；(2)無水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)石油醚去除醚溶性上清物；(4)非極性大孔樹脂對琥珀酸吸附；(5)無水乙醇萃取，加水濃縮去乙醇，冷凍干燥；(6)乙醚萃取，加水濃縮去乙醚，冷凍干燥；(7)使用agilentzorbaxsb-c18(9.4×250mm×5μm)高效液相色譜柱半制備；(8)使用agelavenusilasb-c18(4.6×150mm×5μm)高效液相色譜柱半制備，琥珀酸純度在95％以上。

具體步驟為：

(一)去除蘇云金芽胞桿菌bt發(fā)酵液中的雜質(zhì)

(1)去除絮凝沉淀物；取10l初始發(fā)酵液，按照1％的濃度加入al2o3，充分?jǐn)嚢韬笾糜?℃冰箱靜止12小時，取出后8000r/min離心10min，收集上清。用1mol/l的hcl調(diào)至ph4.0，50℃真空濃縮，真空度-0.095至-0.088mpa范圍，濃縮至200ml備用；

(2)去除醇不溶性沉淀物；取步驟(1)所制得的備用液體200ml，加入200ml無水乙醇，靜置1小時后再次離心，8000r/min離心10min，取上清備用；

(3)去除醚溶性上清物；取步驟(2)所制得的備用液體，用等體積的石油醚萃取，反復(fù)3次，收集下層相，即得抗生素粗提液，保存于4℃冰箱備用；

(二)樣品的粗制

(4)取非極性大孔樹脂，按樹脂重量與步驟(3)所制得的備用粗提液體積1:2的比例混合上樣，濕法裝柱，裝入量的高度40cm，室溫靜態(tài)吸附2-3小時，先用去離子水洗脫4-6bv，1bv為1倍柱體積，洗脫液為未吸附相，洗脫流速約0.5ml/min，收集洗脫液，減壓濃縮后用去離子水定容至原體積；

(三)樣品的精制

(5)取步驟(4)所制得的液體200ml，使用冷凍干燥機，將樣品凍干，加入400ml無水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有機系濾膜過濾后，加水并減壓蒸餾除去乙醇，體積濃縮至50ml，再次使用凍干機凍干樣品；

(6)使用步驟(5)同樣的方法，加入乙醚萃取，上清液過濾后減壓蒸餾，并加水除去乙醚，得到精制品；

(四)高效液相半制備琥珀酸

(7)第一次半制備；取步驟(6)所制得的液體，使用agilentzorbaxsb-c18(9.4×250mm×5μm)色譜柱，流動相為甲醇、超純水，柱溫35℃，紫外波長為210nm，流速為2ml/min；洗脫方法為：

0-10min：甲醇:超純水＝5:95；

10-15min：甲醇:超純水＝5:95梯度變?yōu)榧状?超純水＝80:20；

15-25min：甲醇:超純水＝80:20；

25-30min：甲醇:超純水＝80:20梯度變?yōu)榧状?超純水＝5:95；

30-35min：甲醇:超純水＝5:95；

多次收集6.5-7.5min組分，減壓蒸餾除去甲醇，樣品冷藏備用；

(8)第二次半制備；取步驟(7)所制得的備用液體，使用agelavenusilasb-c18(4.6×150mm×5μm)色譜柱，流動相為甲醇、超純水，柱溫35℃，紫外波長為210nm，流速為1ml/min，洗脫方法為:

0-10min：甲醇:超純水＝0.2:99.8；

多次收集4-5min時間段組分，減壓蒸餾除去甲醇，即得到了高純度琥珀酸；

依據(jù)上述方法，能夠?qū)㈢晁釓腷t發(fā)酵液中分離純化出來，且純度高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的樣品質(zhì)譜圖。

圖2為本發(fā)明的紅外圖譜。

圖3為本發(fā)明的核磁共振碳譜。

圖4為本發(fā)明的核磁共振氫譜。

具體實施方式

實施例：

本發(fā)明實施例為首次從芽胞bt中分離純化琥珀酸。

所述方法包括以下步驟：

(1)大孔樹脂柱的制備。

制備方法為濕法裝柱。一定量的非極性大孔樹脂，分別先后用弱酸及弱堿浸泡、清洗，最后用去離子水反復(fù)清洗至中性。樹脂經(jīng)過離心脫水，之后在80℃恒溫干燥48小時，取出稱重備用。取長60cm、直徑5cm的玻璃層析柱備用。

(2)制備發(fā)酵液

2.1初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g；蛋白胨20.0g；cacl20.08g；k2hpo41.3g；mgso40.2g；mnso40.08g；ph7.0-7.2，定容至1l，121℃滅菌30min備用。

2.2擴大生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，大豆分離蛋白4.0g；葡萄糖3.0g；氯化鈉2.0g；mgso4·7h2o0.3g；k2hpo40.3g；mnso40.05g；ph7.5，定容至1l，121℃滅菌30min備用。

2.3種子培養(yǎng)基：酵母膏5.0g；蛋白胨10.0g；氯化鈉10.0g；ph7.0-7.2；定容至1l，121℃滅菌30min備用。

2.4蘇云金芽胞桿菌：編號bt菌株。

2.5菌株在種子培養(yǎng)中的擴增：將保存在-20℃冰箱的菌種bt取出，放到室溫復(fù)蘇，至完全解凍，將其接種到含有種子培養(yǎng)基的斜面上，30℃過夜培養(yǎng)，取出后保存于4℃冰箱備用。

2.6菌株在種子培養(yǎng)中的活化：從保存好的bt斜面培養(yǎng)基上取0.5㎝×1.0㎝大小的培養(yǎng)物接種于300ml搖瓶內(nèi)，含有種子培養(yǎng)基100ml，30℃、220r/min搖床培養(yǎng)16-18小時。

2.7初始發(fā)酵：將活化好的菌液以2％的接種量接種初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不超過容器體積的2/3，30℃搖瓶培養(yǎng)32-36小時，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)去除蘇云金芽胞桿菌bt發(fā)酵液中的雜質(zhì)

3.1去除絮凝沉淀物：取10l初始發(fā)酵液，按照1％的濃度加入al2o3，充分?jǐn)嚢韬笾糜?℃冰箱靜止12小時。取出后，8000r/min離心10min、收集上清。用1mol/l的hcl調(diào)至ph4.0。50℃真空濃縮，真空度-0.095至-0.088mpa范圍，濃縮至200ml備用。

3.2去除醇不溶性沉淀物：取3.1所制得的備用液體200ml，加入200ml無水乙醇，靜置1小時后再次離心，8000r/min離心10min，取上清備用。

3.3去除醚溶性上清物：取3.2所制得的備用液體，用等體積的石油醚萃取，反復(fù)3次。收集下層相，即得粗提液，保存于4℃冰箱備用。

(4)樣品的粗制

取非極性大孔樹脂，按樹脂重量與3.3所制得的備用粗提液體積1:2的比例混合上樣，濕法裝柱，裝入量的高度40cm。室溫靜態(tài)吸附2-3小時，先用去離子水洗脫4-6bv。1bv為1倍柱體積。洗脫液為未吸附相，洗脫流速0.5ml/min，收集洗脫液，減壓濃縮后用去離子水定容至原體積。

(5)樣品的精制

取200ml上述液體，使用冷凍干燥機，將樣品凍干，加入400ml無水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有機系濾膜過濾后，加水并減壓蒸餾除去乙醇，體積濃縮至50ml。再次使用凍干機凍干樣品，使用同樣的方法，加入乙醚萃取，上清液過濾后減壓蒸餾，并加水除去乙醚，得到精制品。

(6)高效液相半制備琥珀酸

6.1第一次半制備：取步驟(5)所制得的液體，使用agilent1260infinity，agilentzorbaxsb-c18(9.4×250mm×5μm)色譜柱，流動相為甲醇、超純水，柱溫35℃，紫外波長210nm，流速2ml/min。洗脫方法為:

0-10min:甲醇:超純水＝5:95；

10-15min:甲醇:超純水＝5:95梯度變?yōu)榧状?超純水＝80:20；

15-25min:甲醇:超純水＝80:20；

25-30min:甲醇:超純水＝80:20梯度變?yōu)榧状?超純水＝5:95；

30-35min:甲醇:超純水＝5:95；

多次收集6.5-7.5min組分，減壓蒸餾除去甲醇，樣品冷藏備用。

6.2第二次半制備：取6.1所制得的備用液體，使用agilent1260infinity，agelavenusilasb-c18(4.6×150mm×5μm)色譜柱，流動相為甲醇、超純水，柱溫35℃，紫外波長210nm，流速1ml/min。洗脫方法為：

0-10min：甲醇:超純水＝0.2:99.8；

多次收集4-5min時間段組分，減壓蒸餾除去甲醇，即得到了高純度樣品。

質(zhì)譜、紅外線、核磁共振分析如下：

(7)質(zhì)譜檢測

使用thermo公司的q-exactive超高分辨質(zhì)譜，樣品質(zhì)譜分析，將樣品溶于超純水中，質(zhì)量體積濃度為萬分之一。

使用c18色譜柱，流動相50％水+50％乙腈，進樣后得到的譜圖數(shù)據(jù)。質(zhì)譜為陰離子模式。如圖1。從圖1可見，該物質(zhì)的相對分子量為118。

(8)紅外檢測

使用nicoletiz10傅里葉變換顯微紅外成像光譜儀，進行紅外分析。方法為壓片法，如圖2。從圖2可見，在吸收頻率1470cm^-1處和1680-1700cm^-1處均有明顯峰，該樣品具有烷基或烯基或炔基和羧基。

(9)核磁檢測

使用bruker500m，分別進行氫譜和碳譜分析，溶劑為氘代二甲基亞砜。碳譜(圖3)和氫譜(圖4)。從圖3碳譜可見，該物質(zhì)含有甲基或烯基或炔基和羰基；圖4氫譜可見，為-ch2-和-oh。質(zhì)譜和紅外及核磁分析表明，確定樣品中c歸屬為ch2和c＝o，存在對稱結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式為hooc-ch2-ch2-cooh，該物質(zhì)為琥珀酸，學(xué)名丁二酸。