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一種高濃度γ?聚谷氨酸及其發(fā)酵方法與流程

文檔序號:11145531閱讀:888來源:國知局
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及一種高濃度γ-聚谷氨酸及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)
:γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamicacid,簡稱γ-PGA)是一種氨基酸聚合物,由L/D-谷氨酸通過γ-聚谷酰鍵連接而成,其分子量一般在100-1000KDa之間,相當(dāng)于500-5000個谷氨酸單體聚合而成。γ-聚谷氨酸具有優(yōu)良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性,降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸,是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料,可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等,在化妝品、環(huán)境保護、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均有很大的商業(yè)價值和社會價值。γ-聚谷氨酸的主要發(fā)酵方法有化學(xué)合成法、提取法和生物合成法。相比于生物合成法,前兩種方法工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多、產(chǎn)量低、環(huán)境污染較大。目前,國內(nèi)外主要是利用以芽孢桿菌為代表的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。在二十世紀九十年代以來,科研工作者們在篩選γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株及改善γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝方面做了大量的研究工作。Kubota從土壤中分離得到一株BacillussubtilisF201,γ-聚谷氨酸的最大產(chǎn)量可達到50g/L。Yoon對BacilluslicheniformisATCC9945a利用高密度流加培養(yǎng),在發(fā)酵35h后,γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達到最大值39g/L。江波等從土壤中篩選一株Bacillusmethylotrophicus,該菌株可不依賴于谷氨酸進行發(fā)酵,產(chǎn)量達到17g/L,其專利公開號為CN102268389。喬長冕等通過向培養(yǎng)基中添加硝酸鈉,調(diào)節(jié)聚谷氨酸合成酶的活性,提高了谷氨酸的轉(zhuǎn)化率,γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達到45-55g/L,其專利公布號為CN103695485。目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的過程中,合成代謝途徑較為復(fù)雜,發(fā)酵液極其粘稠,發(fā)酵液的高粘度顯著降低了溶氧濃度,并大大增加了傳質(zhì)阻力系數(shù),使得氧氣供給困難,營養(yǎng)物質(zhì)得不到有效利用。這極大地限制了菌體的生長代謝,最終導(dǎo)致γ-聚谷氨酸產(chǎn)量較低。因此,尋找一種改善培養(yǎng)菌體的低氧環(huán)境及提高發(fā)酵液的傳質(zhì)系數(shù),是目前發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸亟待解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足,本發(fā)明的目的在于提供一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法,該發(fā)酵方法可以解決菌體生長過程中供氧不足的難題,在低成本的液體培養(yǎng)基中實現(xiàn)γ-聚谷氨酸的高產(chǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種高濃度γ-聚谷氨酸。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法,包括如下步驟:(1)將產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌接種到含有Span20的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng);(2)在發(fā)酵培養(yǎng)5-7h,添加一定量的正十二烷;(3)在發(fā)酵培養(yǎng)5-7h開始,每隔3-5h,添加一定量的H2O2;(4)從發(fā)酵培養(yǎng)18-24h開始,流加蔗糖溶液、谷氨酸鈉溶液和酵母粉溶液,流加至56-78h,發(fā)酵結(jié)束;(5)分離提取發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸。表面活性劑Span20具有改善發(fā)酵環(huán)境的作用,它的非極性端結(jié)合在菌體表面,能夠使菌體分散度增加,強化傳質(zhì)效果。此外,Span20還能提高細胞膜的通透性,增加菌體細胞的攝氧速率。為了在不增加能耗的情況下,進一步改善菌體生長的低氧環(huán)境,本發(fā)明一方面進行了氧載體強化溶氧的研究,在載體中氧氣的溶解度比在水中的溶解度高很多。氧載體增加溶氧的方法與提高通氣量強化溶氧的方法相比,具有氧氣傳遞速率快、利用率高、能耗低、氣泡少、液體剪切力小等優(yōu)點。因此,氧載體的方法非常適合應(yīng)用于γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn),本發(fā)明選取了正十二烷進行研究,它與Span20共同作用取得了更佳的實驗效果。在另一方面,本發(fā)明通過添加合適濃度的H2O2來增加氧氣的供應(yīng),并對菌體細胞產(chǎn)生一定的氧化脅迫,刺激更多γ-聚谷氨酸的形成,此種方法具有成本低、效率高、環(huán)境污染低、不增加能耗等優(yōu)點。本發(fā)明與相應(yīng)的不添加Span20、正十二烷和H2O2的方法相比可獲得更多的γ-聚谷氨酸,在本發(fā)明的具體實施方式中,γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量達到55g/L左右。在本發(fā)明中,產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌為本鄰域技術(shù)人員所熟知,如本發(fā)明
背景技術(shù)
部分所提及的,本發(fā)明優(yōu)選采用的枯草芽孢桿菌將在下文中更詳盡地描述;枯草芽孢桿菌的發(fā)酵溫度為34-38℃,本發(fā)明優(yōu)選采用37℃。優(yōu)選的,所述步驟(1)中,產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌是于2014年5月20日保藏于波頓香料有限公司保藏中心的枯草芽孢桿菌PBS55,其保藏編號為CMCC3366。優(yōu)選的,所述步驟(1)中,產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌是在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)而獲得的,種子培養(yǎng)基包括如下組分:蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化鈉10-20g/L、硫酸鎂0.5-4g/L、磷酸二氫鉀1-8g/L和氯化銨2-10g/L,pH為6.0-8.0。更為優(yōu)選的,種子培養(yǎng)基包括如下組分:蛋白胨為12-18g/L,酵母粉為6-12g/L,氯化鈉為12-16g/L,硫酸鎂1-3g/L,磷酸二氫鉀1.5-5g/L,氯化銨為3-6g/L,pH為6.5-7.5。在本發(fā)明中,如未特別指出培養(yǎng)基中的添加物,培養(yǎng)基僅僅是未添加相應(yīng)添加物的培養(yǎng)基。優(yōu)選的,所述步驟(1)中,發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分:蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸鈉20-80g/L、硫酸鎂0.5-3g/L和磷酸二氫鉀2-5g/L,pH為6.5-7.5。更為優(yōu)選的,所述步驟(1)中,發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分:蔗糖40-100g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母粉6-12g/L、谷氨酸鈉30-70g/L、硫酸鎂1-2g/L和磷酸二氫鉀2-3g/L,pH為6.8-7.2。優(yōu)選的,所述步驟(1)中,培養(yǎng)參數(shù)為:培養(yǎng)溫度為34-38℃,攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min,通氣量1-2vvm,罐壓0.04-0.1mPa。更為優(yōu)選的,所述步驟(1)中,培養(yǎng)參數(shù)為:培養(yǎng)溫度為37℃,攪拌轉(zhuǎn)速350r/min,通氣量1.5vvm,罐壓0.08mPa。優(yōu)選的,所述步驟(1)中,Span20的添加量為1-10ml/L;所述步驟(2)中,正十二烷的添加量為10-60ml/L;所述步驟(3)中,H2O2的添加量為3-20ml/L。更為優(yōu)選的,所述步驟(1)中,Span20的添加量為2-6ml/L;所述步驟(2)中,正十二烷的添加量為20-40ml/L;所述步驟(3)中,H2O2的添加量為5-10ml/L。優(yōu)選的,所述步驟(4)中,蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為45-55%,流加速度為每小時6-12mL/L;酵母粉溶液的質(zhì)量濃度為15-25%,流加速度為每小時3-6mL/L;谷氨酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為45-55%,流加速度為每小時4-8mL/L。更為優(yōu)選的,所述步驟(4)中,蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為50%,流加速度為每小時6-12mL/L;酵母粉溶液的質(zhì)量濃度為20%,流加速度為每小時3-6mL/L;谷氨酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為40%,流加速度為每小時4-8mL/L。本發(fā)明在發(fā)酵罐上,通過連續(xù)留加底物方式控制菌體的生長和代謝,進一步促進了γ-聚谷氨酸的生成。分別在不同時間留加蔗糖、谷氨酸鈉和酵母粉等營養(yǎng)物質(zhì),在10-100L發(fā)酵罐中培養(yǎng),γ-聚谷氨酸產(chǎn)量可達50g/L以上,比利用該菌種單批發(fā)酵產(chǎn)量提高了25%左右。本發(fā)明的另一目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種高濃度γ-聚谷氨酸,所述高濃度γ-聚谷氨酸根據(jù)上述所述的發(fā)酵方法制得。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的發(fā)酵方法可以解決菌體生長過程中供氧不足的難題,在低成本的液體培養(yǎng)基中實現(xiàn)γ-聚谷氨酸的高產(chǎn),還具有成本低、效率高、環(huán)境污染低、不增加能耗等優(yōu)點。附圖說明圖1是實施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖2是實施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的DO及相關(guān)氧化酶酶活變化圖。圖3是實施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖4是實施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的DO及相關(guān)氧化酶酶活變化圖。圖5是實施例4在10L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。圖6是實施例5在100L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量變化圖。具體實施方式為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解,下面結(jié)合實施例及附圖1-6對本發(fā)明作進一步的說明,實施方式提及的內(nèi)容并非對本發(fā)明的限定。實施例1一種高濃度γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法,使用本發(fā)明所用菌種枯草芽孢桿菌PBS55進行不同處理的對比發(fā)酵,其中發(fā)酵方法1的過程如下:將在25%(v/v)的甘油中保藏好的菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中,以37℃和搖床轉(zhuǎn)速180-220r/min,震蕩培養(yǎng)12-16h。然后將獲得的種子液以3%(v/v)的接種量,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,以37℃和搖床轉(zhuǎn)速180-220r/min,震蕩培養(yǎng)60-80h。最后測定并計算發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。其中,種子培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨為12-18g/L,酵母粉為6-12g/L,氯化鈉為12-16g/L,硫酸鎂1-3g/L,磷酸二氫鉀1.5-5g/L,氯化銨為3-6g/L,發(fā)酵初始PH為6.5-7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:蔗糖為60-120g/L,蛋白胨為10-40g/L,酵母粉為5-20g/L,谷氨酸鈉為60-100g/L,硫酸鎂0.5-5g/L,磷酸二氫鉀2-7g/L,發(fā)酵初始PH為6.5-7.5;更優(yōu)選可以是如下配方:蔗糖為80-100g/L,蛋白胨為15-20g/L,酵母粉為6-12g/L,谷氨酸鈉為70-90g/L,硫酸鎂2-4g/L,磷酸二氫鉀3-5g/L,發(fā)酵初始PH為6.8-7.2。發(fā)酵結(jié)束后,測定發(fā)酵液黏度和γ-聚谷氨酸產(chǎn)量,并將發(fā)酵液稀釋15倍后,在660nm處測定其吸光值。發(fā)酵方法2、3、4的過程與發(fā)酵方法1基本相同,所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L、4ml/L、6ml/L的Span20;發(fā)酵方法5、6、7的過程與發(fā)酵方法1基本相同,所不同的是在發(fā)酵培養(yǎng)6h時,向發(fā)酵液添加了20ml/L、40ml/L、60ml/L的正十二烷;發(fā)酵方法8、9、10的過程與發(fā)酵方法1基本相同,所不同的是分別在發(fā)酵培養(yǎng)6h開始,每隔3h向培養(yǎng)基中添加5ml/L、10ml/L、15ml/L的H2O2,直到發(fā)酵結(jié)束;發(fā)酵方法11的過程與發(fā)酵方法1基本相同,所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L的Span20,然后在發(fā)酵培養(yǎng)6h向發(fā)酵液中添加40ml/L的正十二烷;發(fā)酵方法12的過程與發(fā)酵方法1基本相同,所不同的是在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有2ml/L的Span20,然后在發(fā)酵培養(yǎng)6h向發(fā)酵液中添加40ml/L的正十二烷,并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始,每隔3h,向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2,直到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果如表1所示,在Span20、正十二烷和H2O2單獨作用下,γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量均有不同程度的增加。其中,在Span20的作用下,發(fā)酵液黏度明顯降低,促進了營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。在正十二烷、H2O2的作用下,培養(yǎng)系統(tǒng)的低氧環(huán)境得到了改善,有效地解決了發(fā)酵液中氧氣供應(yīng)不足的問題。發(fā)酵方法11和發(fā)酵方法12的結(jié)果也表明,Span20、正十二烷和H2O2三者聯(lián)合作用,可以起到協(xié)同效果,極大地提高了γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。表1不同發(fā)酵方法下菌種生物量及γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量發(fā)酵方法OD660發(fā)酵液黏度(mPa·s)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量(g/L)10.47126.523.620.53219.727.230.48318.924.540.29814.319.850.49623.825.760.56327.231.670.55825.429.380.46828.731.590.45230.834.3100.38623.721.7110.57921.836.7120.53127.443.8實施例2在10L發(fā)酵罐上不添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸,發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:蔗糖為100g/L,蛋白胨為20g/L,酵母粉為10g/L,谷氨酸鈉為80g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸二氫鉀3g/L,初始PH為6.8,裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72h,培養(yǎng)溫度為37℃,發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2,攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min,通氣量1-2vvm,罐壓0.04-0.1mPa。發(fā)酵結(jié)果如圖1、圖2所示。結(jié)果表明,在不添加調(diào)節(jié)劑的情況下,γ-聚谷氨酸產(chǎn)量只有23.2g/L,DO從36h開始就低于20%,CAD和SOD的酶活力均較低,這極大地限制了枯草芽孢桿菌菌體的生長,從而影響最終γ-聚谷氨酸的合成。實施例3在10L發(fā)酵罐上通過添加調(diào)節(jié)劑單批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸,發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為:蔗糖為100g/L,蛋白胨為20g/L,酵母粉為10g/L,谷氨酸鈉為80g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸二氫鉀3g/L,Span202ml/L,發(fā)酵初始PH為6.8,裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)6h,向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷,并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始,每隔3h,向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2,直到發(fā)酵結(jié)束。共發(fā)酵72h,發(fā)酵溫度為37℃,發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2,攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min,通氣量1-2vvm,罐壓0.04-0.1mPa。發(fā)酵結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果表明,在Span20、正十二烷和H2O2的共同作用下,培養(yǎng)環(huán)境有了很大改善,DO始終維持在20%以上,CAT和SOD酶活活性較高,有效地解決了γ-聚谷氨酸發(fā)酵過程中供氧不足的問題,γ-聚谷氨酸產(chǎn)量有了顯著的提高,達到42.8g/L。實施例4在10L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸,發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為:蔗糖為50g/L,蛋白胨為20g/L,酵母粉為10g/L,谷氨酸鈉為30g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸二氫鉀3g/L,Span202ml/L,發(fā)酵初始PH為6.8,裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)6h,向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷,并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始,每隔3h,向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2,發(fā)酵溫度為37℃,發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2,攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min,通氣量1-2vvm,罐壓0.04-0.1mPa。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)18-24h左右時,糖濃度較低,發(fā)酵液PH上升至7.0以上時,開始分別流加50%(w/v)的蔗糖溶液6-12ml/(L*h),20%(w/v)的酵母粉溶液3-6ml/(L*h),50%(w/v)的谷氨酸鈉溶液4-8ml/(L*h),流加至72h,發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)果如圖5所示,通過流加補料的方式,營養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用,γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量有了進一步的提高,達到55.1g/L。實施例5在100L發(fā)酵罐上通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸,發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為:蔗糖為60g/L,蛋白胨為20g/L,酵母粉為10g/L,谷氨酸鈉為40g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸二氫鉀3g/L,Span202ml/L,發(fā)酵初始PH為6.8,裝液量為5L。將培養(yǎng)好的種子液以3%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)6h,向發(fā)酵液添加40ml/L的正十二烷,并發(fā)酵培養(yǎng)6h開始,每隔3h,向發(fā)酵液中添加10ml/L的H2O2,發(fā)酵溫度為37℃,發(fā)酵過程控制pH為6.5-7.2,攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min,通氣量1-2vvm,罐壓0.04-0.1mPa。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)18-24h左右時,糖濃度較低,發(fā)酵液PH上升至7.0以上時,開始分別流加50%(w/v)的蔗糖溶液6-12ml/(L*h),20%(w/v)的酵母粉溶液3-6ml/(L*h),50%(w/v)的谷氨酸鈉溶液4-8ml/(L*h),流加至56h結(jié)束補料,繼續(xù)發(fā)酵至74h時,蔗糖和谷氨酸鈉消耗殆盡,結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果如圖6所示,100L發(fā)酵罐的發(fā)酵結(jié)果與10L發(fā)酵罐的發(fā)酵結(jié)果相似。在流加補料發(fā)酵方式下,γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達到57.3g/L,比添加調(diào)節(jié)劑的單批發(fā)酵提高了32%,比不添加調(diào)節(jié)劑的單批發(fā)酵提高了148%。上述實施例為本發(fā)明較佳的實現(xiàn)方案,除此之外,本發(fā)明還可以其它方式實現(xiàn),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 
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