本發(fā)明涉及基因工程，尤其是涉及一種ddhd2基因突變的斑馬魚的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前，基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于動物模型的構(gòu)建、基因功能研究中。crispr/cas9作為一種新型基因編輯技術(shù)，具有高位點(diǎn)特異性、設(shè)計(jì)靈活和易于操作的特點(diǎn)。

2、在生物學(xué)基因編輯技術(shù)的研究中通常采用兔及大、小鼠等嚙齒動物，而構(gòu)建這類動物模型存在時(shí)間較長、成本高、喂養(yǎng)空間需求大和遺傳性狀不穩(wěn)定等問題。而斑馬魚作為模式生物優(yōu)勢突出。首先研究表明大約70％的人類基因在斑馬魚中具有功能同源物，其次斑馬魚飼養(yǎng)方便且成本低、胚胎透明、繁殖力強(qiáng)、發(fā)育迅速，受精后三天即可發(fā)育出較完善的神經(jīng)系統(tǒng)，5dpf個(gè)體基本發(fā)育完全。另外通常在神經(jīng)功能方面，斑馬魚具有與人類同源功能的幾個(gè)關(guān)鍵腦區(qū)。在斑馬魚的神經(jīng)遞質(zhì)譜中檢測到許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)；其表現(xiàn)出較多與人類相似的復(fù)雜行為，包括社交、運(yùn)動、情感和防御等，這對神經(jīng)科學(xué)研究十分重要，在研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物上有很好的應(yīng)用前景。

3、ddhd2基因位于人類染色體區(qū)域8p11.23，其編碼的蛋白質(zhì)屬于哺乳動物胞內(nèi)磷脂酶a1(ipla1)家族。該蛋白家族由三個(gè)平行序列組成——ddhd1，ddhd2和sec23ip。ddhd2包含wwe結(jié)構(gòu)域、gxsxg脂肪酶模體、sam和ddhd結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果提示ddhd2可能作為風(fēng)險(xiǎn)基因參與了精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展過程。然而，目前尚未有報(bào)道通過crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建ddhd2基因敲除的斑馬魚模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種ddhd2基因突變的斑馬魚模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的構(gòu)建動物模型周期長，成本高的技術(shù)問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種ddhd2基因突變的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、步驟1，將rnp混合液導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，將敲除效率達(dá)到50％以上的胚胎，在e3水中孵化，培養(yǎng)至成魚，得到ddhd2基因功能缺失的f0代突變體斑馬魚；

4、步驟2，將所述f0代突變體斑馬魚與野生型斑馬魚外交，將敲除效率達(dá)到100％的胚胎培養(yǎng)至成魚，對成魚進(jìn)行剪尾，得到可遺傳的f1代突變體斑馬魚；

5、步驟3，將所述f1代突變體斑馬魚中的雌魚與雄魚內(nèi)交，得到f2代胚胎，將達(dá)到設(shè)定敲除效率的胚胎培養(yǎng)至成魚，對成魚進(jìn)行剪尾，得到ddhd2基因突變的f2代純合突變體斑馬魚。根據(jù)檢測結(jié)果，得到的f2代純合突變體測序如圖1(a)所示,與synthego網(wǎng)站預(yù)測的結(jié)果一致，如圖1(b)所示。

6、進(jìn)一步地，步驟1中所述rnp混合液含有sgrna、cas9蛋白；

7、所述rnp混合液的注射劑量為每個(gè)受精卵0.8-1.2nl；

8、每1ulrnp混合液中含有0.5-2umol的sgrna、0.1-1ug的cas9蛋白。

9、進(jìn)一步地，所述sgrna的靶位點(diǎn)位于斑馬魚ddhd2基因的第五外顯子，如圖2所示。

10、進(jìn)一步地，所述sgrna的靶位點(diǎn)的3’端為ngg。

11、優(yōu)選地，sgrna的靶位點(diǎn)的5’端的gg二核苷酸為t7啟動子的一部分；

12、優(yōu)選地，所述sgrna對應(yīng)的dna序列為：

13、cacctagtgttcatggttca。

14、進(jìn)一步地，步驟1中所述斑馬魚受精卵應(yīng)在受精后15min內(nèi)導(dǎo)入所述rnp混合液。

15、進(jìn)一步地，步驟3中所述設(shè)定敲除效率為100％。

16、進(jìn)一步地，所述敲除效率的檢測步驟如下：

17、步驟a，在斑馬魚胚胎受精72小時(shí)后(72hpf)，分別收集野生型和實(shí)驗(yàn)組胚胎，每200μl的pcr管中收集1顆胚胎，加入40μl50mm?naoh,95℃裂解40分鐘,隨后加入4μl?ph＝8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris-hcl)進(jìn)行中和。渦旋震蕩30秒，瞬離后上清液即為斑馬魚基因組dna；

18、步驟b,取所述斑馬魚基因組dna，按照如下表1所示配方配制pcr反應(yīng)體系試劑：

19、表1為pcr反應(yīng)體系試劑配方：

20、

21、將上述pcr反應(yīng)體系試劑振蕩混勻之后離心，于pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，3min，(變性95℃，15s，退火60℃，20s，延伸72℃，30s)進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，再72℃，10min。待反應(yīng)結(jié)束后，離心得到含有目的dna片段的pcr產(chǎn)物；取5μl所述pcr產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測pcr產(chǎn)物大??；

22、步驟c，將所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序并經(jīng)比對，得出sgrna的敲除效率。

23、優(yōu)選地，所述引物的序列如下：

24、ddhd2-forward?primer：gtcaatgctgaactgagtct；

25、ddhd2-reverse?primer：tggagtctccactcggcctg。

26、本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供一種篩選精神類藥物的方法，所述方法是采用上述構(gòu)建方法得到的ddhd2基因突變的斑馬魚模型來篩選效果突出的藥物。

27、采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：

28、本發(fā)明提供的ddhd2基因突變的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，首次創(chuàng)造性地實(shí)現(xiàn)了斑馬魚磷脂酶a1合成關(guān)鍵基因ddhd2敲除；通過對本發(fā)明構(gòu)建的斑馬魚模型的研究，可以明確ddhd2缺陷對斑馬魚脂質(zhì)代謝的影響；利用本發(fā)明提供的斑馬魚模型進(jìn)行藥物效果研究具有檢測通量高，檢測周期短，檢測靈敏度高，且檢測載體的倫理限制少的優(yōu)點(diǎn)，對于快速篩選及評價(jià)精神類藥物及天然功效因子具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種ddhd2基因突變的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1中所述rnp混合液含有sgrna、cas9蛋白；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述sgrna的靶位點(diǎn)位于斑馬魚ddhd2基因的第五外顯子。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述sgrna的靶位點(diǎn)的3’端為ngg。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述sgrna對應(yīng)的dna序列為cacctagtgttcatggttca。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1中所述斑馬魚受精卵應(yīng)在受精后15min內(nèi)導(dǎo)入所述rnp混合液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3中所述設(shè)定敲除效率為100％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述設(shè)定敲除效率的檢測步驟如下：

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的斑馬魚模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟b中所述引物的序列如下：

10.一種篩選精神類藥物的方法，其特征在于，所述方法是采用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法得到的ddhd2基因突變的斑馬魚模型來篩選效果突出的藥物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種ddhd2基因突變的斑馬魚模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明通過將含有sgRNA、Cas9蛋白的RNP混合液導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，并經(jīng)過篩選培養(yǎng)，創(chuàng)造性地實(shí)現(xiàn)了對斑馬魚ddhd2基因的敲除，采用本發(fā)明構(gòu)建的斑馬魚模型對精神類藥物進(jìn)行篩選，具有檢測通量高，檢測周期短，檢測靈敏度高以及檢測載體的倫理限制少的優(yōu)點(diǎn)，對于快速篩選及評價(jià)精神類藥物及天然功效因子具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：李志強(qiáng),彭利霞,吳傳鴻,王寶堃,常開慧
受保護(hù)的技術(shù)使用者：青島大學(xué)附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/12