本發(fā)明涉及巨大側(cè)耳菌種的檢測(cè)，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、巨大側(cè)耳(pleurotus?giganteus(berk.)karun.&k.d.hyde)，是國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)的一種珍稀食用菌，其口感和風(fēng)味獨(dú)特，有豬肚般的滑膩，因而其商品名為“豬肚菇”。巨大側(cè)耳營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌、保護(hù)肝臟等多種藥用功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，具有較高的潛在市場(chǎng)價(jià)值。巨大側(cè)耳的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、栽培技術(shù)簡(jiǎn)單、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高，逐步引起食用菌生產(chǎn)者的重視，目前已在多個(gè)省市栽培，栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大。研究發(fā)現(xiàn)，野生巨大側(cè)耳多于夏末秋初的炎熱季節(jié)出現(xiàn)，主要分布于中國(guó)熱區(qū)，以及東南亞和大洋洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)。生物學(xué)特性試驗(yàn)也表明，巨大側(cè)耳不僅菌絲階段耐高溫(35℃)，原基階段也不需要嚴(yán)格的低溫刺激，子實(shí)體也適宜在氣溫較高的夏季出菇(23-32℃)。巨大側(cè)耳典型的耐高溫特性，對(duì)于解決食用菌生產(chǎn)淡季和調(diào)節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)很有意義，特別是為熱區(qū)的食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新機(jī)遇。

2、然而，隨著巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，巨大側(cè)耳生產(chǎn)用種“同物異名，同名異物”的問(wèn)題日益突出。在國(guó)內(nèi)收集20株巨大側(cè)耳菌株研究發(fā)現(xiàn)僅有7株具有不同的遺傳背景，其他菌株均為同物異名。這一問(wèn)題不僅損害了巨大側(cè)耳育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，更為生產(chǎn)者造成了極大地風(fēng)險(xiǎn)，為巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展造成了隱患。為保障育種者的權(quán)益和降低生產(chǎn)者的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)我國(guó)巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，建立一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的巨大側(cè)耳菌種特異性鑒定技術(shù)迫在眉睫。

3、隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，dna測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，高通量測(cè)序的成本也在降低。dna分子標(biāo)記技術(shù)能夠從基因水平上檢測(cè)巨大側(cè)耳菌種的遺傳特異性，巨大側(cè)耳全基因組測(cè)序的完成為ssr標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了便利。ssr分子標(biāo)記是一種基于高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，降低了ssr標(biāo)記開(kāi)發(fā)的成本，適用于巨大側(cè)耳全基因組測(cè)序分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。ssr標(biāo)記具有數(shù)量豐富、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、快捷簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，不僅用于分子標(biāo)記輔助育種，而且也可用于巨大側(cè)耳菌株鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)相關(guān)技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該指紋圖譜與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

2、為此，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：

3、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜，該指紋圖譜由10對(duì)ssr標(biāo)記組成，是基于巨大側(cè)耳全基因組開(kāi)發(fā)的ssr標(biāo)記引物，擴(kuò)增帶型好，重復(fù)性高，標(biāo)記引物詳細(xì)信息如表1：

4、表1ssr標(biāo)記引物詳細(xì)信息列表

5、

6、根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括：

7、s1、菌絲培養(yǎng)：將巨大側(cè)耳菌種轉(zhuǎn)接到裝有20ml的pda培養(yǎng)基的平板上，28℃恒溫暗培養(yǎng)，7天后收集菌絲；

8、s2、基因組dna的提取：利用植物基因組dna提取試劑盒提取所述菌絲的基因組dna，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)基因組dna的濃度和純度，并調(diào)整樣品dna的濃度為20-30ng/μl；

9、s3、ssr分子標(biāo)記的檢測(cè)：對(duì)提取的基因組dna進(jìn)行ssr分子標(biāo)記的pcr擴(kuò)增；

10、s4、電泳檢測(cè)：將擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，電泳，銀染，顯色，拍照。

11、進(jìn)一步的，所述利用植物基因組dna提取試劑盒提取所述菌絲的基因組dna，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)基因組dna的濃度和純度，并調(diào)整樣品dna的濃度為20-30ng/μl包括：

12、s201、取100mg的菌絲體放入1.5ml的離心管中，并加入液氮充分研磨；

13、s202、向研磨的粉末中快速加入400μl?buffer?lp1和6μl?rnase?a(10mg/ml)，渦旋振蕩1min，并室溫放置10min使其充分裂解；

14、s203、向裂解液中加入130μl?buffer?lp2，上下顛倒混勻后，渦旋振蕩1min；

15、s204、12000rpm離心5min，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；

16、s205、加入1.5倍體積的buffer?lp3，上下顛倒混勻8-10下；

17、s206、將s205所得溶液和沉淀全部轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放回收集管中；

18、s207、向吸附柱中加入500μl?buffer?gw2，12000離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

19、s208、重復(fù)步驟s207；

20、s209、12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入新的離心管中，室溫放置數(shù)分鐘至徹底晾干；

21、s210、向吸附柱的膜中間懸空滴加50-80μl?buffer?ge，室溫放置2-5min，12000rpm離心1min，收集dna溶液。

22、s211、取2μl?dna溶液，分別在2％的瓊脂糖凝膠和分光光度計(jì)上檢測(cè)dna濃度和純度。

23、進(jìn)一步的，ssr分子標(biāo)記的檢測(cè)中pcr擴(kuò)增體系為：總體積為25μl，包括10×buffer2μl，25mmol/l?mgcl2?2μl，10mmol/l?dntps?0.6μl，5u/μl?taq?dna?polymerase?0.3μl，10μmol/l?ssr標(biāo)記正向引物和反向引物體積各0.3μl，濃度20-30ng/μl的dna模板dna?0.5μl，ddh2o?19μl；

24、pcr反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min，72℃10min，30個(gè)循環(huán)。

25、進(jìn)一步的，步驟s4中的電泳包括：取擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物1μl與2×變性凝膠緩沖液1μl依次混勻后，在聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中點(diǎn)樣，聚丙烯酰氨凝膠的體積百分比為20％，電泳緩沖液為1×tbe；180v電壓，恒壓跑90min。

26、銀染和顯色的具體工藝為：電泳結(jié)束后將玻璃板拆開(kāi)，取膠板用去離子水水洗10-20s，然后放入銀染液中避光銀染5-8min，銀染后再用去離子水水洗10-20s，放入顯影液中至顯現(xiàn)出清晰條帶后，用去離子水水洗5–8s，在生物大分子分析儀中拍照并記錄條帶特征；銀染液和顯影液可重復(fù)用3-4次。

27、采用10對(duì)ssr標(biāo)記引物對(duì)巨大側(cè)耳菌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)照50bp?ladder?dnamarker確定各ssr標(biāo)記引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對(duì)分子量，找到帶型符合編號(hào)組合為：(1+2)(1+3)(4+5)14(1+4)(2+4+5)(2+3)2(2+5+6)的菌種，即可確定該菌種為巨大側(cè)耳pg46的菌種。

28、根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，是利用巨大側(cè)耳全基因組開(kāi)發(fā)的10對(duì)ssr標(biāo)記引物，通過(guò)對(duì)收集的7株遺傳背景不同的巨大側(cè)耳菌株進(jìn)行ssr標(biāo)記擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)照50bp?ladder?dna?marker確定了這10對(duì)ssr標(biāo)記引物在各個(gè)巨大側(cè)耳菌株中擴(kuò)增出的等位片段的數(shù)量和相對(duì)分子量并編號(hào)(圖2-圖11，表2)。通過(guò)不同ssr等位位點(diǎn)的編號(hào)組合能夠在所收集的巨大側(cè)耳菌株中有效識(shí)別“pg46”菌種(表3)，其帶型編號(hào)組合為：(1+2)(1+3)(4+5)14(1+4)(2+4+5)(2+3)2(2+5+6)，符合該帶型組合的菌種，即為巨大側(cè)耳pg46菌種。

29、表2ssr引物擴(kuò)增的所有等位片段信息匯總表

30、

31、

32、表3菌種pg46擴(kuò)增的等位片段編號(hào)表

33、

34、

35、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的巨大側(cè)耳pg46菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜可用于pg46菌種的鑒別，本發(fā)明與常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定、拮抗試驗(yàn)和出菇實(shí)驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)所需時(shí)間只需要3-4天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要1周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少2個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的7個(gè)遺傳背景不同的巨大側(cè)耳菌種中具有pg46菌種的專一性，具有良好的應(yīng)用前景。