一種植物核糖體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物核糖體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)期以來(lái)抗植物病毒的藥劑篩選和相關(guān)研宄一直在持續(xù)開展，目前市場(chǎng)上也可得到一些抗病毒的藥劑，然而絕大多數(shù)抗植物病毒劑的抗病毒活性僅僅在30%至60%之間，理想的抗植物病毒藥劑依然十分缺乏。
[0003]植物病毒病防治的研宄仍是當(dāng)務(wù)之急。簡(jiǎn)單地進(jìn)行化合物的抗病毒篩選既耗費(fèi)了大量的精力又難找到理想的化合物。近年，抗植物病毒劑研宄中出現(xiàn)了一些新的動(dòng)向，給抗植物病毒劑的研宄與開發(fā)帶來(lái)新的機(jī)遇。表現(xiàn)在:隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展以及各種先進(jìn)的現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)及手段向該領(lǐng)域的滲透，為了解微區(qū)的、動(dòng)態(tài)的、或者分子間的互作方面提供了可能，這為抗植物病毒劑的藥理研宄注入巨大活力；抗植物病毒劑研宄中新的篩選體系和方法的建立，并且研宄視覺(jué)隨著藥理研宄的深入，已開始僅僅從研宄藥劑對(duì)病毒的活性影響擴(kuò)大到研宄病毒、寄主植物和藥劑間的相互關(guān)系，研宄開始變得深入而全面。另夕卜，天然抗病毒物質(zhì)長(zhǎng)期以來(lái)有不少研宄成果報(bào)道，由于活性成分在天然物中往往含量低，來(lái)源有限，開發(fā)成本高，要大規(guī)模開發(fā)作為實(shí)用的抗植物病毒劑使用并不現(xiàn)實(shí)。這個(gè)領(lǐng)域的研宄目前來(lái)說(shuō)，更重要的是藥理學(xué)研宄與先導(dǎo)化合物的確定。對(duì)環(huán)境友好而對(duì)寄主植物沒(méi)有不良影響卻對(duì)病毒具有抑制活性的天然物篩選及其藥理研宄，無(wú)疑是極有價(jià)值的研宄對(duì)象和重要的基礎(chǔ)性研宄領(lǐng)域，活性物的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定一方面可直接作為仿生合成的模板(先導(dǎo))，為新農(nóng)藥仿生創(chuàng)制服務(wù)；而更具深遠(yuǎn)意義的還在于對(duì)活性物的藥理及機(jī)制研宄，明確作用靶標(biāo)，由靶標(biāo)去設(shè)計(jì)更有效的先導(dǎo)，或者直接利用靶標(biāo)篩選，并從而確定先導(dǎo)化合物，通過(guò)先導(dǎo)優(yōu)化再進(jìn)行人工化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)抗病毒劑，這無(wú)疑是抗植物病毒劑走向成功的更有效途徑。并且現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，在農(nóng)藥合成與篩選中新的思路和方法不斷出現(xiàn)，如針對(duì)靶標(biāo)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、農(nóng)藥合成的分子設(shè)計(jì)、分子等排理論、化合物結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系定量解析(QSAR)、有機(jī)概念圖等給抗植物病毒劑化學(xué)合成提供了有利條件。藥理研宄和相關(guān)學(xué)科的進(jìn)展給抗植物病毒劑帶來(lái)新的機(jī)遇，抗植物病毒劑研宄與其它學(xué)科的緊密聯(lián)系，將推動(dòng)新世紀(jì)抗植物病毒劑實(shí)用化進(jìn)程，使其在植物病毒危害控制中發(fā)揮重要作用。
[0004]在對(duì)抗植物病毒化合物的篩選過(guò)程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些化合物能有效地抑制病毒的蛋白質(zhì)合成，但它們對(duì)寄主植物的毒害也相當(dāng)嚴(yán)重(除PAP等植物蛋白的特殊例子外)，因此未得到實(shí)際應(yīng)用。從中也給人們啟示，如果能找到一些化合物能抑制植物病毒(TMV)的蛋白合成，而對(duì)植物細(xì)胞無(wú)毒害作用，這些化合物有可能發(fā)展成理想的抗病毒劑。在病毒與寄主十分復(fù)雜的關(guān)系中，病毒RNA與寄主核糖體的結(jié)合是病毒蛋白質(zhì)合成的一個(gè)關(guān)鍵步驟，在病毒的整個(gè)侵染循環(huán)中具有非常重要的意義。分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研宄已經(jīng)表明，寄主mRNA和病毒RNA與寄主核糖體的結(jié)合特點(diǎn)是有區(qū)別的，這些mRNA(包括病毒RNA)與寄主核糖體結(jié)合以后的翻譯過(guò)程特點(diǎn)則幾乎無(wú)區(qū)別。因此，如果我們能找到一種化合物，它能有效地阻斷病毒RNA與寄主核糖體的結(jié)合，而對(duì)植物自身的mRNA的翻譯無(wú)影響，即實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒和對(duì)寄主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制選擇性，那么，這種化合物有可能是抗植物病毒高效安全活性物質(zhì)研宄的一個(gè)突破口。從而以病毒核酸和核糖體結(jié)合直接為藥物作用靶標(biāo)，來(lái)篩選藥物，最終有望開發(fā)把病毒復(fù)制控制在病毒侵染寄主早期的病毒核酸與寄主核糖體結(jié)合這一關(guān)鍵步驟的優(yōu)良抗植物病毒劑，這對(duì)于抗植物病毒病藥劑的研制具有重要意義。
[0005]材料的來(lái)源與質(zhì)量直接關(guān)系到體系建立的成功性，探尋合理的制備技術(shù)在整個(gè)研宄過(guò)程中占有重要地位，材料的質(zhì)量保證是體系及藥物篩選的前提。因此，尋找一種材料的制備方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種植物核糖體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括麥胚的制備、核糖體麥胚抽提物的制備步驟，具體包括:
A、麥胚的制備:取小麥種子，干燥至含水量12%，粉碎過(guò)孔徑Imm篩，再過(guò)孔徑0.45mm篩，收集0.45mm篩上的麥粉顆粒，加入麥粉顆粒固液體積比2~5倍的懸浮液，懸浮得到懸浮顆粒，去除溶劑后挑選完整麥胚，完整麥胚進(jìn)一步洗滌，洗滌后加入固液體積比8~12倍的無(wú)菌水，置于搖床上于溫度3~5°C晃搖洗滌8~12min，洗滌2~4次，加入固液體積比1~3倍的裂解液，超聲處理，棄去裂解液，加入固液體積比8~12倍的DEPC處理水于搖床上震搖處理8~12min,處理2~4次，干燥，于3~5°C保存?zhèn)溆茫?br> B、核糖體麥胚抽提物的制備:稱取A步驟制備的麥胚0.05?0.15g，置于DEPC處理過(guò)的離心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5?1.5ml的核糖體抽提緩沖液(2XBuffer A:40mM Hepes/KOH, 120mM K(AC)2，5mM Mg (AC) 2, 2mM CaCl2, 4mM DTT^P 8 ?12 μ I 標(biāo)準(zhǔn)混合氨基酸(lmM/each，promega)，混搖使粉末分散，置于頻率30Hz的振蕩器上震蕩抽提20?40s，于O?5°C靜置2?4min，于3?5°C、30000g離心20?40min，上清液上SephadexG-25柱，用I X Buffer A (核糖體抽提緩沖液2X Buffer A倍比稀釋)洗脫，以1.5ml/管或0.5ml/管依次收集洗脫液，并將洗脫液于3?5°C、30000g離心8?12min純化處理，測(cè)定各管洗脫液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脫曲線，以吸收峰作為不同組分的依據(jù)，對(duì)相應(yīng)峰的洗脫液通過(guò)瓊脂糖電泳和氯仿/酚法去蛋白后核酸瓊脂電泳，鑒定洗脫液，確定含核糖體的麥胚抽提物并收集，得到目標(biāo)物，置液氮中保存?zhèn)溆谩?br>[0008]本發(fā)明解決了核酸核糖體離體結(jié)合體系的構(gòu)建及藥物的抗病毒活性篩選中材料的來(lái)源與質(zhì)量，本發(fā)明制備得到的植物核糖體質(zhì)量純凈，純度較高且提取完整，可用于病毒TMV-RNA離體蛋白翻譯體系，用于靶向性藥物篩選，作為核糖體的一個(gè)來(lái)源。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為提純TMV紫外掃描圖譜示意圖；
圖2為提純TMV SDS-PAGE蛋白電泳示意圖；
圖3為TMV病毒核酸RNA的紫外掃描圖譜示意圖；
圖4為總RNA (I )、提純TMV-RNA (2)、麥胚核糖體(4)電泳圖；
其中:1_ 植物總 RNA ;2_ 提純 TMV-RNA ；3-RNA-Marker(0.5，1，2，3，4，5，6kb 標(biāo)準(zhǔn));4_ 麥胚核糖體抽提物；
圖5為血清IgG純化前后SDS-PAGE差異顯不不意圖；
圖6為感病煙草葉片SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)示意圖；
圖7為挑選制備水洗前后的麥胚對(duì)比示意圖；
圖8為核糖體麥胚抽提液G-25凝膠純化洗脫曲線示意圖；
圖9為麥胚抽提物凝膠洗脫含核糖體組分電泳檢測(cè)示意圖；
圖10為核糖體，感病煙葉總RNA及TMV-RNA電泳圖譜示意圖；
其中:1-核糖體；2-感病煙葉總RNA ；3-TMV-RNA ；
圖11為第一個(gè)淋出峰進(jìn)一步離心并脫蛋白后針對(duì)核酸電泳圖譜示意圖；
圖12為凝膠洗脫具麥胚核糖體部分小體積收集順次電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011 ] 本發(fā)明所述的植物核糖體的制備方法，包括麥胚的制備、核糖體麥胚抽提物的制備步驟，具體包括:
A、麥胚的制備:取小麥種子，干燥至含水量12%，粉碎過(guò)孔徑Imm篩，再過(guò)孔徑0.45mm篩，收集0.45mm篩上的麥粉顆粒，加入麥粉顆粒固液體積比2~5倍的懸浮液，懸浮得到懸浮顆粒，去除溶劑后挑選完整麥胚，完整麥胚進(jìn)一步洗滌，洗滌后加入固液體積比8~12倍的無(wú)菌水，置于搖床上于溫度3~5°C晃搖洗滌8~12min，洗滌2~4次，加入固液體積比1~3倍的裂解液，超聲處理，棄去裂解液，加入固液體積比8~12倍的DEPC處理水于搖床上震搖處理8~12min,處理2~4次，干燥，于3~5°C保存?zhèn)溆茫?br> B、核糖體麥胚抽提物的制備:稱取A步驟制備的麥胚0.05?0.15g，置于DEPC處理過(guò)的離心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5?1.5ml的核糖體抽提緩沖液(2XBuffer A:40mM Hepes/KOH, 120mM K(AC)2，5mM Mg (AC) 2, 2mM CaCl2, 4